本实验方案的目的是研究啮齿类动物的空间认知能力。双H形水迷宫是一种新型测试方法，特别适用于阐明学习、巩固和记忆的不同组分，以及记忆系统之间的相互作用。
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摘要
摘要
啮齿类动物空间认知研究通常采用迷宫任务，不同迷宫的任务特征各不相同。这些任务在行为灵活性、所需记忆持续时间、目标数量与路径数量以及整体任务复杂性方面均存在差异。许多此类任务存在一个混杂因素，即难以控制啮齿类动物为达成目标所采用的策略。 例如， 基于环境线索（类似陈述性）或基于自身位置（程序性）的策略。双H迷宫是一种新型的水迷宫记忆任务，可通过实验者控制训练阶段所习得的策略类型来解决这一问题。双H迷宫为透明装置，由一条中央通道构成，两侧各伸出三个分支臂，其中一个分支臂末端设有一个 submerged 的逃生平台。
可以通过在迷宫中以不可预测的方式交替起始位置来训练大鼠使用以环境为参照的（allocentric）策略（参见方案1；§4.7），从而要求它们根据可利用的外部线索学习平台的位置。或者，通过在每次试验中从相同位置释放大鼠，可采用以自身为参照的（egocentric）学习策略（方案2；§4.8），直到它们学会到达目标所需的程序性模式。该任务已被证实能够形成稳定的记忆痕迹。
在训练期结束后，可通过误导性探测试验来检测记忆，其中大鼠的起始位置交替变化。根据自我中心学习范式，大鼠通常会转而采用以环境线索为中心的策略，但仅当其在新起始位置所看到的迷宫外线索与原始位置有显著差异时才会如此。该任务非常适合用于探究药物或干扰因素对以环境线索为中心和自我中心记忆表现的影响，以及这两种记忆系统之间的相互作用。
引言
在动物中，学习主要由基于海马体和纹状体的记忆系统介导1,2，它们分别在位置记忆和程序性记忆中发挥核心作用。这两个系统之间的关系十分复杂，已知它们会以协作或竞争的方式相互作用1,3。此外，研究显示，当其中一个记忆系统缺失或受损后，另一个系统对动物行为的影响可能会增强4-7。这两个系统均通过丘脑与前额叶皮层相连。
多种神经系统疾病和神经退行性疾病可影响人类的空间认知能力，这种能力依赖于程序性记忆系统与陈述性记忆系统之间的相互作用。例如帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）8-10、阿尔茨海默病（AD）11-14以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）15。可通过多种药物处理阻断特定受体16，或通过靶向性损毁等方法，建立与这些疾病相关的动物模型。将此类动物应用于空间记忆任务时，可深入理解这些疾病的潜在机制，并为多种治疗方案提供有价值的信息。
啮齿类动物的空间记忆任务有多种不同类型，这些任务共同用于评估学习和记忆的特定方面，以及各种疾病潜在治疗方法的效果17,18。这些任务可根据目标和路径的数量、解决问题时行为灵活性的程度、记忆持续时间或延迟，以及解决问题所采用的策略类型进行区分。良好的表现可能基于外部线索或地标，动物利用这些线索定位目标（即他心性或位置策略）。或者，啮齿动物也可能发展出基于身体方向和运动方向相关线索的策略（即自我中心性或程序性策略），例如，若大鼠知道目标路径为一次左转后接一次右转，则几乎无需依赖他心性或位置策略。迷宫任务通常根据啮齿动物在解决问题时所具有的灵活性程度而有所不同。例如，在莫里斯水迷宫、其干式版本（例如，19）或巴恩斯迷宫（例如，20）中，大鼠可能采取无限多条路径到达目标。以莫里斯水迷宫为例，目标位置可通过外部地标或线索（他心性策略）来学习，也可通过简单地绕圈游向中心直至发现平台（自我中心性策略）来实现21。某些任务具有多个目标且灵活性较高，例如锥场任务22或奥尔顿放射迷宫23。而在另一极端，则是一些达到目标的灵活性有限的任务，例如，斯通迷宫或T迷宫的交替版本。这些任务仅提供一种正确的路径以到达目标，有助于形成主要由纹状体依赖的程序性记忆系统支配的认知惯例。
双H迷宫是一种新型的空间记忆测试装置，旨在让实验者能够控制啮齿类动物在完成任务时所采用的学习策略24。该迷宫由三条平行的跑臂与一条垂直交叉的中央通道组成，是一种水逃避任务，啮齿类动物需学会找到位于迷宫某一位置的浸没式逃生平台。在训练过程中，若始终保持相同的起始点和目标位置，则可促使动物形成程序性策略；而若以随机顺序交替起始位置，则可促使动物发展出以环境线索为基础的异中心策略，这类似于动物在水迷宫中寻找隐藏平台时所需依赖的空间记忆机制。这种方法克服了传统迷宫任务中的一个难题，即实验者通常难以控制动物实际采用的策略类型。这一点尤为重要，因为某些促认知药物候选物的作用效果依赖于海马依赖的位置记忆系统，因此，若动物在训练过程中从异中心策略转向程序性记忆，可能会干扰对行为学结果的解释。同样，在评估药物或治疗手段对程序性记忆的影响时，也需排除异中心空间记忆的干扰。最后，该装置还可用于研究这两种记忆系统之间的协同或竞争关系，以及啮齿类动物在何种条件下会从一种记忆系统转换为另一种。
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方案
1. 一般注意事项
本方案已获得弗莱堡大学医院动物护理与使用委员会（斯特拉斯堡同）批准。视觉敏锐度是完成空间学习测试所必需的。因此，视觉系统受损的啮齿类动物不适用于此类实验。此外，光照条件必须充足，以确保大鼠能够看清周围墙壁上设置的不同提示线索。建议使用基本形状（如方形、圆形、三角形）但对比度明显的提示物（例如，白色背景上的黑色提示物）。同样，严重的运动功能障碍属于排除标准，因为该测试需要动物游泳，否则可能发生溺水。最后，高度焦虑的啮齿类动物可能出现显著偏向性的搜索行为，从而影响测试表现。
2. 仪器设置
- 构建一个双H型迷宫，包括一条160 cm的中央通道，在其两端及中央位置分别与三条160 cm的平行跑臂相交（参见 图1）。确保中央通道及其垂直臂的宽度均为20 cm，周围由35 cm高的透明有机玻璃（Plexiglas）墙围成，所有部分的有机玻璃厚度均为6 mm。
- 使用胶水和螺丝固定墙壁，并在迷宫所有内角处用硅胶进行防水处理。这些硅胶接缝若失去防水性能可轻松更换。在其中一个角落臂的末端（或迷宫中央）设置排水口以便排空。
- 将迷宫放置在一张高80 cm的桌子上，周围应留有充足空间，以便于 a) 围绕迷宫走动，以及 b) 设置高对比度的视觉线索。根据迷宫中各臂的位置对其进行编号命名， 即西北（NW）、北（N）、东北（NE）、西南（SW）、南（S）和东南（SE）。
- 在迷宫上方安装一个天花板固定的摄像头，用于测试后通过手动或自动（视频追踪）方法分析动物行为（参见 §5).
3. 一般说明
- 使用前，将水注入迷宫，水位高度约为 18 cm（200 L）。该水位足以防止大鼠用脚触碰到迷宫底部，但又足够浅以防止其逃脱。
- 预训练后，加入250 g脱脂奶粉使水呈不透明状。每日更换水以防止牛奶水变质。保持水温在21 - 23℃之间 °C 以激励大鼠寻找逃生平台。
注意：随着大鼠在预训练阶段逐渐熟悉平台的位置，在正式训练阶段会将其位置移动至迷宫的另一臂。 - 使用前，将一个高17 cm、直径10 cm的平台浸入其中一个角落臂（NE、NW、SE或SW）的末端，确保平台顶端位于水面以下1 cm处。通过采用以环境线索为导向的（异中心）或以自身为导向的（自我中心）学习策略训练大鼠寻找目标平台，具体策略取决于所使用的实验范式类型（参见 §4).
4. 基本训练方案
注意：大鼠通常需要进行一天的预训练，以使其熟悉迷宫环境。
- 预训练时，将大鼠从其中一个中央臂的末端释放例如， S臂）并将目标平台置于其中一个角落臂的末端（例如， NE），然后给予大鼠连续4次、每次60秒的试验，以使其找到目标平台。
- 到达逃生平台后，让大鼠在平台上停留15秒，以便其休息并观察周围环境。无论起始位置如何，始终使用透明的活板门封闭对侧臂，以防止进入。
注意：在预训练期间，保持水体透明，并调节平台高度，使其高出水面1厘米，以便大鼠可见。 - 进行每日训练，每次包含最多4次连续试验，每次试验之间至少间隔10秒（离散训练）， 即， 两次试验之间间隔数分钟，也是一种替代方案。
- 训练时，将平台从训练前的位置移至选定的臂例如， NW），并将其末端浸入水面以下1 cm处。随后通过加入奶粉使水变得不透明，并进行以下训练（第4节）。
- 对于在60秒内未能到达目标平台的大鼠，将其放回起始位置，并由实验人员轻轻引导至平台。
- 在训练和探测试验期间测量多个变量，例如游泳距离、到达目标臂/平台的潜伏期、在各臂停留的时间，以及初始/重复性错误次数（参见 图2）。需注意，潜伏期可能受运动困难的影响。若出现此种情况，距离和错误次数相较于认知表现而言是更为可靠的变量。
- 以环境为参照的策略训练：
- 天 1 - 预训练：
- 此步骤中不要添加奶粉。将逃生平台固定放置于水面以上1厘米处。训练大鼠连续进行4次试验以找到平台。
- 第2 - 5天——训练：
- 加入250 g脱脂奶粉至水中，使水变得不透明。将平台移至另一条臂例如， 从东北方向到西北方向）并加水，使平台位于水面下1 cm处。每次实验中，以不可预测的顺序从北臂或南臂释放大鼠，确保在单次实验中两个臂各被用作两次试验起点（每日4次试验， 例如， SNNS，NSNS；参见 图3).
- 第6天——探针试验：
- 移除探针试验中的平台。将大鼠从训练时未使用的新臂中释放。例如， SW），并让它们游动60秒。参见 图4 用于代表性游泳轨迹。对大鼠在目标臂（平台先前位置）停留时间的分析可表明其是否采用空间策略、其他类型策略、不同策略的顺序组合（见下文），或无序搜索模式。
- 天 1 - 预训练：
- 以自我为中心的策略训练：
- 第1天——训练前：
- 这与以环境线索策略训练的第一步（步骤4.1）相同。此步骤中不要添加奶粉。将逃生平台固定放置于水面以上1 cm处的特定位置。训练大鼠连续进行4次试验，以找到该平台。
- 第2 - 5天——训练：
- 将250 g脱脂奶粉加入水中使其呈不透明状。将平台移至另一条臂中，并加水使平台位于水面下1 cm处。从相同的起始臂（S或N；见 图5每次试验（每天4次试验）。
- 第6天——探针实验：
- 移除探针试验中的平台。将大鼠从与训练时不同的臂中释放，允许其游泳60秒。使用透明活板门阻断对侧臂。
注意：根据特定实验的要求调整上述训练策略， 例如， 测试药物效应 等等.
- 移除探针试验中的平台。将大鼠从与训练时不同的臂中释放，允许其游泳60秒。使用透明活板门阻断对侧臂。
- 第1天——训练前：
- 每次在水中训练后，用吸水毛巾将大鼠擦干。
5. 分析
- 通过记录俯视摄像机拍摄的视频，手动测量潜伏期、初始错误和重复错误、首次选择及反应类型等变量。
- 或者，如有条件，可使用 commercially available video-tracking software（商用视频追踪软件），并将其设置为自动记录上述变量。
- 统计分析：
注意：统计分析的具体方法取决于正在进行的研究。- 针对初始错误/重复错误、到达目标臂/平台的潜伏期以及在目标臂停留的时间，进行单因素、双因素或三因素方差分析（ANOVA），分析因素包括测试天数和处理组别。
- 必要时，采用事后 Newman-Keuls 多重比较检验对上述方差分析结果进行进一步分析。为比较行为表现，可使用参考值（例如，探针试验中在目标臂停留的时间与机会水平相比），并进行 t 检验。
- 若条件不满足参数检验的前提假设，则可根据需要额外使用或改用非参数统计方法（例如，χ² 检验，见下文）。
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结果
自我中心学习策略
一项研究旨在确定大鼠在遵循自我中心学习范式的情况下，其选择的记忆策略是否会因其对外部环境线索的感知角度发生变化而改变25大鼠在4天内（每天4次试验）被训练到达位于东北方向的目标臂，并在第5天进行误导性探测试验，其中起始臂向左移动60 cm即， NE起始点用于训练期间从N臂释放的动物；SW起始点用于从S臂训练的动物），或旋转 180°在探针试验中，当平台从其正常位置向左移动60 cm时，大鼠表现出对程序性记忆反应的偏好（在26只大鼠中占92.3%；参见 图6）。对于在N臂和S臂均接受过训练的实验大鼠（在探测试验中分别从NE臂和SW臂释放），这一现象尤为明显。相比之下，在训练时所处的臂与释放臂完全相反的大鼠中，仅有8只（占25只中的32%）表现出类似行为。即， 由 N 变为 S，或反之亦然）表现出程序性反应，且位置反应出现频率更高。χ2 分析表明，该分布的差异具有高度显著性（χ2 = 19.80，p < 0.001）。在旋转组中，训练...
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讨论
关于研究设计与分析的说明
自问世以来，双H迷宫已被用于多项大鼠行为学实验，这些实验旨在研究大鼠在正常条件下以自我为中心（egocentric）和/或以环境为中心（allocentric）的行为反应24,25 和改变的26-29 脑状态。后者的研究包括纹状体深部脑刺激（DBS）26神经系统疾病动物模型27,28，以及使用蝇蕈醇对多个皮质-海马脑区进行双侧失活29许多研究所采用的策略为以环境为中心（allocentric）或以自我为中心（egocentric）的学习策略，分别总结于§4.7和§4.8；尽管核心范式存在细微变化例如， 误导性探测试验中起始臂的180°旋转25）应根据具体研究的需要进行适当调整。训练范式的具体性质取决于正在进行的研究。例如， 24-29）。每当大鼠首次偏离正确的目标路径并重新进入起始臂或进入一个新的迷宫区段时，计为一次初始错误。当此类偏离行为发生超过一次时，计为一次重复错误。正...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由斯特拉斯堡大学和上莱茵神经科学网络 Neurex（为 RP 提供博士后奖学金）以及德国研究基金会（DFG，资助号 EXC 1086）资助的卓越集群 BrainLinks-BrainTools 共同支持。我们感谢 Nadja Martini 提供出色的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠或小鼠 | Charles River | ||
| 用于干燥的毛巾 | 大学医院 | 每只动物1条 | |
| 水 | 约200升/天 | ||
| 脱脂奶粉 | 杂货店 | 250克/200升水 | |
| 花园软管 | 五金店 | ||
| 毛巾干燥架 | 五金店 | ||
| Kinect相机 | Kinect | ||
| PC计算机 | 任意品牌 | ||
| [header] | |||
| 双H迷宫（有机玻璃）（定制） | |||
| 外侧墙板，1600 × 350 × 6 mm | 2块 | ||
| 内侧墙板，706 × 350 × 6 mm | 8块 | ||
| 中央通道板，500 × 350 × 6 mm | 4块 | ||
| 迷宫臂末端板，188 × 350 × 6 mm | 6块 | ||
| 滑门（ Guillotine 门），187 × 350 × 6 mm | 3个 | ||
| 末端盖板，200 × 250 mm | 6个 | ||
| 横梁，200 × 40 mm | 6根 | ||
| [header] | |||
| 双H迷宫平台（需配重）（定制） | |||
| 金属平台，直径100 mm × 150 mm | 2个 | ||
| 平台盖板，直径100 mm × 6 mm | 2个 |
参考文献
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