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方法文章

一个 体外 骨髓中雌激素敏感性乳腺癌的休眠模型：分子机制研究与假设生成的工具

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DOI：

10.3791/52672

⸱

2015年6月30日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

本文内容

摘要

我们开发了一种 体外 骨髓中雌激素敏感性乳腺癌细胞休眠模型。本实验方案旨在展示该模型在研究休眠状态的分子与细胞生物学机制中的应用，并用于提出可进一步验证的科学假设。 体内.

摘要

研究骨髓中乳腺癌细胞休眠现象极具挑战性，原因在于休眠细胞与其微环境之间的相互作用复杂、休眠细胞数量稀少，以及造血细胞的大量存在造成干扰。为此，我们开发了一种 体外 骨髓中雌激素敏感型乳腺癌细胞休眠的二维克隆形成模型。该模型包含休眠所需的几个关键要素：1）使用雌激素敏感型乳腺癌细胞，这类细胞更可能在较长时间内保持休眠状态；2）以克隆形成密度培养细胞，使每个细胞主要与基质发生结构相互作用；3）纤维连接蛋白（fibronectin），骨髓中的关键结构成分；4）成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），由骨髓基质细胞大量合成并富集于细胞外基质中的生长因子。在含有FGF-2的条件下培养细胞6天后，可形成休眠克隆，其由12个或更少的细胞组成，形态扁平、明显较大且铺展程度更高，胞质与细胞核的比值较大。相比之下，在无FGF-2条件下培养的细胞主要形成由超过30个相对较小细胞组成的增殖性克隆。在培养第3天对系统施加抗体、抑制剂、多肽或核酸等干扰因素，可显著影响第6天时休眠细胞的多种表型和分子特征，可用于评估膜定位或细胞内分子、因子及信号通路在细胞休眠状态或休眠细胞存活中的作用。尽管认识到 体外 由于该检测方法的特性，它可作为一种非常有用的工具，以获取关于静息细胞建立与存活所必需的分子机制的重要信息。这些数据可用于提出假设并进一步验证 体内 模型

引言

在乳腺癌尚不可检测时，癌细胞即已向骨髓转移1，这一过程始于微小肿瘤形成血管之时2,3。转移过程迅速但效率低下：癌细胞可快速进入新生血管，数量高达每天数百万个4，但仅有极少数能够存活并抵达远端器官5。尽管如此，部分微转移灶仍可在骨髓中存活，并在新确诊患者的骨髓穿刺物中以单个细胞或小细胞团的形式被发现1。这些细胞对辅助化疗具有耐受性，而辅助化疗的正是旨在清除此类细胞的治疗手段6。这种耐药性在很大程度上源于癌细胞与骨髓微环境相互作用所启动的生存信号通路7,8。约三分之一的局部乳腺癌女性患者中可检测到微转移灶，单因素分析表明其为独立的生存预后指标9。部分微转移灶已启动增殖，但复发模式因细胞类型而异。三阴性乳腺癌患者多在1至4年内复发，提示其对休眠状态的控制能力较差；而其他类型细胞（如ER/PR阳性细胞）则可保持长达20年的休眠状态，并以稳定持续的速率复发10。尽管ER+与ER-乳腺细胞系及肿瘤之间在休眠相关基因表达特征上的差异反映了其不同的休眠潜能11，但与骨髓基质的相互作用很可能在维持休眠状态中起着重要作用。

休眠研究 体内 极为困难，因为微转移灶非常罕见，且其数量远少于造血细胞，比例超过10:16-倍。因此，必须建立能够提供的相关模型 体外 可提示机制并生成可验证假设的数据 体内. 多种休眠模型，包括数学模型12,13, 体外 模型7,8,14,15, 体内 异种移植模型16，组合的 体外 异种移植模型17,18 自发性肿瘤及转移模型19，对癌细胞休眠现象提供了一些见解20每种模型都有其自身的局限性，主要用于提出关于调控休眠的分子信号传导与相互作用的假设，这些假设需在生物学相关性更强的模型中进行验证。

以阐明休眠的分子机制、微环境相互作用导致细胞周期阻滞、重新分化及治疗耐药性的机制，以及ER+细胞中复发机制为总体目标，我们建立了一种 体外 提供基质微环境特定相关要素的模型7该模型虽然组分相对简单，但具有足够的稳健性，可使研究人员推导出影响休眠重要功能的特定分子机制。这些实验能够产生可直接验证的假设。 体内该模型依赖于我们已证明在休眠过程中起关键作用的几个要素，包括使用雌激素依赖性乳腺癌细胞、将细胞以克隆形成密度培养（使细胞间相互作用主要发生于细胞与基质及培养基中可溶性成分之间）、采用纤连蛋白作为基质，以及在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）。

我们表征了调控该系统的机制 体外，包括 FGF-2 诱导的细胞周期阻滞21，通过TGF介导β22，通过PI3激酶的存活信号传导7,8 和ERK8 以及向上皮表型的形态发生分化，该过程依赖于RhoA失活和整合素 α5β1 型胶原上调及基质纤维连接蛋白的连接以促进存活7,15 (图1。FGF-2 对 MCF-7 细胞的体外细胞周期作用始于浓度至少比 10 ng/ml 低一个数量级时21,23其原理基于对FGF-2表达的时间调控，该调控在多种哺乳动物系统中控制乳腺导管形态发生以及周期性扩张与退缩24-27我们证明了FGF-2可在三维培养中诱导包括导管形态发生在内的分化过程28，且FGF-2的表达通常在人类肿瘤的恶性转化过程中丢失29乳腺癌样本中 FGFR1 的表达保持完整29 且MCF-7细胞持续表达全部4种FGF受体30在休眠的背景下，FGF-2 由骨髓基质细胞分泌并大量沉积于骨髓基质中31,32 在此功能为维持造血干细胞33我们证明了在纤维连接蛋白基质上培养的ER+乳腺癌细胞中，FGF-2可诱导其进入静息状态，而骨髓中也富含纤维连接蛋白，在该环境中FGF-2同样可诱导形态发生性分化7在该模型中，乳腺癌细胞的生长受到抑制，通过RhoGap GRAF失活Rho A，重新分化为上皮表型，并重新表达整合素 α5β1 随着恶性进展而丢失。它们通过整合素与纤连蛋白结合 α5β1 并激活生存信号通路，使其对细胞毒性治疗产生抵抗7,8,15 (图1。先前已证明，抑制Rho类GTP酶可诱导产生静息表型34.

本文将概述具体实验步骤，使研究人员能够建立该模型，并研究调控ER+乳腺癌细胞休眠的特定分子和细胞机制。在本研究中，我们通过使用Akt抑制剂和PI3K抑制剂靶向PI3K信号通路（图1B），并利用广谱Rho抑制剂和Rho激酶（ROCK）抑制剂靶向Rho家族的所有成员（图1B），以展示该模型的应用。

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方案

1. 克隆形成实验

  1. 使用以下步骤制备依赖雌激素的乳腺癌细胞系 MCF-7 和 T47D 细胞的单细胞悬液
    1. 从一个细胞融合度不超过 50% 的 10 cm 组织培养皿中吸除培养基（DMEM/10% 热灭活胎牛血清/谷氨酰胺及青霉素-链霉素），该培养皿中培养有 MCF-7 或 T-47D 细胞。用 PBS 洗涤一次。加入含 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA 的高糖 DMEM 溶液，在 37 °C 下孵育 1–4 分钟。
    2. 每隔 1 分钟在相差显微镜下观察细胞，确保形成单细胞分布。使用 2 ml 移液器反复吹打数次，使细胞重悬并破坏细胞间接触，从而获得几乎完全一致的单细胞状态。
    3. 若孵育仅 2 分钟后仍观察到细胞团块，则继续在 37 °C 下用胰蛋白酶孵育最多至 4 分钟。若胰蛋白酶消化 4 分钟后细胞仍相互黏附，则不应将这些细胞用于克隆形成实验，否则会导致克隆数量计数出现误差。
      注意：若细胞成团，则形成的克隆数将反映接种细胞数中较少细胞的乘积。若胰蛋白酶消化过度，细胞的克隆形成潜能可能降低。
    4. 通过在一支主试管中进行系列稀释（该试管包含实验中所有变量所需的总体积），将细胞用培养基配制成 1,500 个细胞/ml 的单细胞悬液，用于 24 孔板或更低浓度（根据细胞类型或传代次数可增加 500 个细胞/ml）。
      注意：目标终末细胞密度为 800 个细胞/cm2（范围约为 500 至 1,100 个细胞/cm2）。目标是获得约 100 ± 50 个克隆，以便于计数、避免拥挤，并在实验干预导致克隆数量增加或减少时产生具有统计学意义的差异。
  2. 按照以下步骤以克隆形成密度孵育细胞
    1. 将来自主单细胞悬液管（1,500 个细胞/ml）的细胞以每孔 1,500 个细胞的克隆形成密度接种于纤维连接蛋白包被的 24 孔板中，每组设四个复孔。使用 5 ml 移液器吸取含细胞的培养基 3 ml，反复吹打混匀后，向两个孔中各加入 1 ml 培养基。
      注意：应从商业供应商处购买预先包被好的纤维连接蛋白板。在缺乏质量控制和自动化流程的条件下自行包被会导致表面不均，不适合本实验。
    2. 用 5 ml 移液器反复吹打混匀悬液，吸取 3 ml 细胞悬液，向两个孔中各加入 1 ml。每次仅用一支移液器填充两个孔。将移液器中剩余液体返回主试管中的细胞悬液，再次吹打混匀后，重新吸取 3 ml 用于填充另外两个孔，每孔 1 ml。
      注意：必须持续混匀主试管，因为细胞会不断沉降。每次仅吸取足够填充两个孔的体积，是为了确保各孔加入的细胞数量相近，因为细胞也会在移液器内发生沉降。
    3. 快速操作以分配大量细胞，因为将细胞长时间置于室温及 CO2 浓度下会改变其克隆形成潜能（未发表观察结果）。
    4. 在将细胞移入孔板进行克隆实验时，应优化细胞的空间分布。操作时应缓慢地将含有最终细胞浓度的悬液加入孔中央。在细胞沉降到孔底前，不要移动孔板。不要摇晃孔板，因为环形混合会有效将细胞离心至孔边缘，导致第 6 天时边缘细胞密度高，形成融合性克隆而无法计数。
      注意：除非必要，否则不要混匀，因为在加入含细胞悬液后，不混匀比混匀更理想。若必须混匀，可在平板平放于水平台面时，沿相互垂直的方向前后左右轻缓移动平板。
    5. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 6 天，期间不更换培养基。6 天后，每孔中的少量细胞不会显著影响原始培养基中的营养物质、细胞因子组成或 pH 值。
    6. 实验时间进程设计如下：第 1 天将细胞接种于纤维连接蛋白包被的基质上。第 0 天更换为 1 ml 新鲜培养基或含 10 ng/ml FGF-2 的新鲜培养基。第 6 天按 1.4）步骤染色。第 3 天进行任何实验干预，如 1.3）所述。 
  3. 设置分子信号通路或黏附分子的实验干预
    1. 第 3 天，向每孔 1 ml 培养基中加入 100 μl 含有目标终浓度 10 倍量的干预试剂溶液。不要混匀。继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 天。
      注意：干预试剂可包括多种黏附分子、受体或其他表面蛋白的抑制剂和阻断剂，细胞内信号通路的抑制剂，以及可能参与维持静息状态的分子、因子、辅因子或结构蛋白。
    2. 第 6 天进行克隆染色，步骤如下。 
  4. 克隆染色
    1. 培养 6 天后，使用新配制的 0.1% 结晶紫溶液（溶于 2% 乙醇/10 mM 硼酸钠，pH 9.0）对细胞染色。吸除培养基，每孔加入 1 ml 结晶紫溶液，室温染色 20 分钟。
    2. 将孔板浸入水槽中装有冰水且持续流水溢出的冰桶内进行洗涤，孔口朝下倾斜浸入。待孔板完全没入水中后，将其倾斜至水平位置（孔口仍朝下），然后在取出时再恢复为倾斜角度，整个过程动作轻柔连贯。
    3. 重复浸洗 2 至 3 次，直至孔底部流出的水不再呈蓝色为止。剧烈冲洗可能会去除因实验干预而黏附性较弱的细胞或克隆，显著增加计数误差和数据偏差。
    4. 将孔板倒置放在实验台面的纸巾上，与其对应标记的盖子并排放置，过夜干燥。 
  5. 克隆计数
    1. 在孵育、染色和干燥 6 天后，对每孔中生长型和静息型克隆的数量进行计数。建议在倒置相差显微镜下以 40X 放大倍数进行计数。将含有超过>30 个细胞的克隆计为生长型克隆，将含有 12 个或更少细胞、形态上表现为体积显著增大（相比生长型细胞）、细胞质扩张明显、胞质/核比例大的克隆计为静息型克隆，如图 17,15 所示。
      注意：通常不将含 13–29 个细胞的细胞簇计入，因为在标准的静息实验中这类细胞簇并不常见。但如果实验干预改变了生长型或静息型细胞的增殖潜能，则可将其计入，但需结合生物学意义进行相关性分析。

2. 用于免疫荧光研究的克隆形成培养

  1. 将细胞数量调整至约7,500–8,000个细胞/孔，接种于6孔板中，使细胞数量/表面积与24孔板实验相当。
  2. 在接种细胞前，将圆形无菌纤维连接蛋白包被的盖玻片放入6孔板每孔底部，用于成像研究。按照上述1.2)中克隆形成实验所述浓度，以每次2孔、每孔3 ml的体积加入细胞悬液。
  3. 将细胞孵育6天，条件同上述1.2.4和1.2.5。在第3天以10倍浓度加入干扰因子，体积为300 μl，具体操作参见1.3)中的克隆形成实验步骤。
  4. 在第6天使用标准直接或间接免疫荧光染色技术，对细胞黏附分子（如整合素α4、α5、α6、β1、β3）、黏着斑复合物分子（如FAK、paxillin和vinculin）、运动相关蛋白（如α-tubulin）、信号通路成员（如phospho-Akt、phospho-ERK、phospho-p38、phospho-JNK）或其他任何作为休眠机制研究靶标的蛋白进行抗体染色。
    1. 第6天用镊子取出盖玻片，在–20 °C条件下用丙酮/甲醇（1:1）固定20分钟，随后空气干燥。必要时可选用其他固定剂（如多聚甲醛）。若需检测胞内抗原，使用含0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸钠的溶液对细胞进行通透处理，持续2分钟。用PBS洗涤细胞。
    2. 进行间接免疫荧光染色时，在室温下用5% BSA或用与二抗同源物种的10%非免疫血清封闭盖玻片1小时。
    3. 在4 °C条件下，用PBS（含0.1% TRITON X-100）稀释的针对细胞黏附分子、黏着斑复合物分子、信号通路成员或任何作为休眠机制研究靶标的蛋白的一抗溶液孵育过夜。
    4. 用PBS洗涤3次。在室温下用荧光标记的二抗孵育盖玻片2小时。例如，可使用Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG抗体检测小鼠来源的单克隆一抗。将盖玻片细胞面向下封片于载玻片上，使用含Dapi的抗荧光淬灭剂封片，并用指甲油密封边缘。
    5. 进行直接免疫荧光染色时，按2.4.2)中所述进行BSA封闭，随后在4 °C条件下与荧光标记的一抗孵育过夜。用PBS洗涤3次。加入抗荧光淬灭剂并含Dapi封片，用指甲油密封。
    6. 将载玻片置于铝箔包裹的容器中，于4 °C保存，可在数周内随时进行成像和拍照。使用配备相机的荧光显微成像系统，在1,000倍放大倍数下观察并拍摄细胞图像。
    7. 进行纤维状肌动蛋白染色时，先用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭盖玻片30分钟，随后在室温下用BODIPY FL-Phallacidin（绿色）或Rhodamine phalloidin（红色）染色20分钟。加入抗荧光淬灭剂并按上述方法封片。

3. 用于分子研究的克隆形成培养

  1. Western Blot
    1. 将ER+乳腺癌细胞MCF-7或T47D以克隆形成密度接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，60 mm培养皿接种20,000个细胞，100 mm培养皿接种50,000个细胞，在37 °C、5% CO2条件下培养。
    2. 对于需要从裂解物中获得毫克级蛋白进行分子研究的实验，可采用稍高密度接种，即每个100 mm培养皿接种75,000个细胞。每个实验组最多使用十个培养皿，以收集足量蛋白用于Western Blot分析，或收集足量RNA用于Northern Blot分析。
    3. 基于细胞数量的凝胶上样是比较大小显著不同的增殖期与静止期细胞中蛋白表达所必需的辅助手段。进行Western Blot样品制备时，应通过胰酶消化收集细胞，并取部分细胞悬液加入0.2%台盼蓝染色后，用血细胞计数板计数，而不应使用单刃刮刀直接刮取细胞。
    4. 以10,000 × g离心2分钟，吸除培养基，每管加入200 μl裂解缓冲液，将细胞在裂解缓冲液中进行超声处理，随后测定蛋白浓度。
    5. 通过将蛋白产量除以产生该蛋白量的细胞数量，计算每个细胞的蛋白含量。将裂解物上样至不同的聚丙烯酰胺凝胶孔中，确保每孔上样量包含：a) 等量的蛋白；以及 b) 代表等量细胞数的蛋白量。每孔至少上样25 μg蛋白。
      注意：该方法可实现对大小和蛋白含量显著不同的增殖期与静止期细胞之间的有效比较（图1）。
  2. 流式细胞术
    1. 按照步骤3.1的方法，通过胰酶消化从100 mm培养皿中收集细胞，并根据步骤2.4所述方案，采用一抗或二抗免疫荧光染色，按照标准荧光激活细胞分选（FACS）流程对细胞进行分析。
      注意：通过胰酶消化从组织培养皿上分离细胞，不会影响抗体标记所测定的膜蛋白浓度。

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结果

实验旨在重复该检测方法。实验的时间进程如图所示。 图 2A细胞于第-1天以克隆形成密度接种，在第0天向新鲜培养基中添加FGF-2，并持续培养至第6天，随后进行染色并计数克隆。对系统的任何干预均于第3天施加。 100 μl 所需终浓度的10倍体积 图2B 展示了生长和休眠菌落的典型形态。生长菌落包含 >30个细胞和休眠菌落包含12个或更少的细胞，这些细胞的体积比生长中的细胞大许多倍，且具有较大的细胞质/细胞核比例。 图 2C 展示了四次重复实验的典型结果。未添加 FGF-2 时，细胞主要表现为生长型克隆；而在 FGF-2 存在的情况下，绝大多数克隆处于静息状态。

图3 是一项在第3天添加干扰试剂的实验示例。该图展示了通过广谱Rho抑制剂C3转移酶和Rho激酶（ROCK）抑制剂Y27632抑制GTP酶Rho家族后，对静息克隆产生的剂量依赖性抑制作用。该检测方法可用于评估所添加抑制剂对静息克隆以及生长中克隆的半数有效浓度（ED50

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讨论

我们的模型包含了骨髓中休眠状态的多个关键要素。该模型包括对雌激素敏感的细胞，这类细胞可能在骨髓中长期处于休眠状态10；包含纤维连接蛋白（fibronectin），这是骨髓的关键结构成分；包含成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），这是一种由骨髓基质细胞大量合成并大量沉积于骨髓细胞外基质中的生长因子31,32；还包括以克隆形成密度培养细胞，使细胞之间的相互作用主要发生在细胞与基质之间。尽管骨髓微环境远比此复杂，但这一简化系统可根据研究特定机制问题的需要，逐步增加复杂性。

该模型可用于通过多种方法比较休眠细胞与生长中的细胞，包括细胞生物学技术、分子生物学技术以及体内技术。细胞表型可通过重新克隆、运动性与侵袭性研究35、非黏附性肿瘤起始球体形成36，或利用特异性阻断抗体或肽段进行微环境相互作用的功能研究7来检测。

克隆形成实验的主要结果是克隆集落数量的计数，这些克隆可能处于生长状态或静息状态，从而反映细胞的生...

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披露

由美国国防部资助项目 DAMD17-01-C-0343 和 DAMD17-03-1-0524、新泽西州癌症研究委员会项目 02-1140-CCR-E0 以及露丝·斯特林·戈德伯格癌症研究纪念基金（RW）提供支持

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MCF-7 细胞ATCCHTB-22
T47D 细胞 ATCCHTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 孔透明平底 TC 处理多孔培养板Corning354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm 培养皿Corning354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm 培养皿Corning354451
BD BioCoat 22×22 mm #1 玻璃盖玻片，均匀包被人纤维连接蛋白Corning354088
6 孔组织培养板CellTreat229106
DMEM 高糖培养基 10X 粉剂Corning Life Sciences50-013-PB
热灭活胎牛血清Serum Source InternationalFB02-500HI
0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTACorning25-053-CI
青霉素-链霉素溶液，100XCorning30-002-CI
L-谷氨酰胺，100X，液体Corning25-005-CI
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF basic）R&D Systems234-FSE-025
Akt 抑制剂（1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯）CalBiochem124005
LY294002 CalBiochem19-142PI3K 化学抑制剂
C3 转移酶 CytoskeletonCTO3抑制 RhoA、RhoB 和 RhoC，但不抑制其他相关 GTP 酶如 Cdc42 或 Rac1
Y-27632 二盐酸盐 Santa Cruz Biotechnology129830-28-2
BODIPY FL-鬼笔环肽（绿色） Molecular ProbesB607用于丝状肌动蛋白染色的荧光染料
BODIPY FL-罗丹明鬼笔环肽（红色） Molecular ProbesR415用于丝状肌动蛋白染色的荧光染料
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG 抗体，ReadyProbes 试剂 Molecular ProbesR37114
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 Molecular ProbesP-36931

参考文献

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