一个 体外 骨髓中雌激素敏感性乳腺癌的休眠模型：分子机制研究与假设生成的工具

摘要

我们开发了一种 体外 骨髓中雌激素敏感性乳腺癌细胞休眠模型。本实验方案旨在展示该模型在研究休眠状态的分子与细胞生物学机制中的应用，并用于提出可进一步验证的科学假设。 体内.

摘要

研究骨髓中乳腺癌细胞休眠现象极具挑战性，原因在于休眠细胞与其微环境之间的相互作用复杂、休眠细胞数量稀少，以及造血细胞的大量存在造成干扰。为此，我们开发了一种 体外 骨髓中雌激素敏感型乳腺癌细胞休眠的二维克隆形成模型。该模型包含休眠所需的几个关键要素：1）使用雌激素敏感型乳腺癌细胞，这类细胞更可能在较长时间内保持休眠状态；2）以克隆形成密度培养细胞，使每个细胞主要与基质发生结构相互作用；3）纤维连接蛋白（fibronectin），骨髓中的关键结构成分；4）成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），由骨髓基质细胞大量合成并富集于细胞外基质中的生长因子。在含有FGF-2的条件下培养细胞6天后，可形成休眠克隆，其由12个或更少的细胞组成，形态扁平、明显较大且铺展程度更高，胞质与细胞核的比值较大。相比之下，在无FGF-2条件下培养的细胞主要形成由超过30个相对较小细胞组成的增殖性克隆。在培养第3天对系统施加抗体、抑制剂、多肽或核酸等干扰因素，可显著影响第6天时休眠细胞的多种表型和分子特征，可用于评估膜定位或细胞内分子、因子及信号通路在细胞休眠状态或休眠细胞存活中的作用。尽管认识到 体外 由于该检测方法的特性，它可作为一种非常有用的工具，以获取关于静息细胞建立与存活所必需的分子机制的重要信息。这些数据可用于提出假设并进一步验证 体内 模型

引言

在乳腺癌尚不可检测时，癌细胞即已向骨髓转移¹，这一过程始于微小肿瘤形成血管之时^2,3。转移过程迅速但效率低下：癌细胞可快速进入新生血管，数量高达每天数百万个⁴，但仅有极少数能够存活并抵达远端器官⁵。尽管如此，部分微转移灶仍可在骨髓中存活，并在新确诊患者的骨髓穿刺物中以单个细胞或小细胞团的形式被发现¹。这些细胞对辅助化疗具有耐受性，而辅助化疗的正是旨在清除此类细胞的治疗手段⁶。这种耐药性在很大程度上源于癌细胞与骨髓微环境相互作用所启动的生存信号通路^7,8。约三分之一的局部乳腺癌女性患者中可检测到微转移灶，单因素分析表明其为独立的生存预后指标⁹。部分微转移灶已启动增殖，但复发模式因细胞类型而异。三阴性乳腺癌患者多在1至4年内复发，提示其对休眠状态的控制能力较差；而其他类型细胞（如ER/PR阳性细胞）则可保持长达20年的休眠状态，并以稳定持续的速率复发¹⁰。尽管ER+与ER-乳腺细胞系及肿瘤之间在休眠相关基因表达特征上的差异反映了其不同的休眠潜能¹¹，但与骨髓基质的相互作用很可能在维持休眠状态中起着重要作用。

休眠研究 体内 极为困难，因为微转移灶非常罕见，且其数量远少于造血细胞，比例超过10:1⁶-倍。因此，必须建立能够提供....

方案

1. 克隆形成实验

1. 使用以下步骤制备依赖雌激素的乳腺癌细胞系 MCF-7 和 T47D 细胞的单细胞悬液
   1. 从一个细胞融合度不超过 50% 的 10 cm 组织培养皿中吸除培养基（DMEM/10% 热灭活胎牛血清/谷氨酰胺及青霉素-链霉素），该培养皿中培养有 MCF-7 或 T-47D 细胞。用 PBS 洗涤一次。加入含 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA 的高糖 DMEM 溶液，在 37 °C 下孵育 1–4 分钟。
   2. 每隔 1 分钟在相差显微镜下观察细胞，确保形成单细胞分布。使用 2 ml 移液器反复吹打数次，使细胞重悬并破坏细胞间接触，从而获得几乎完全一致的单细胞状态。
   3. 若孵育仅 2 分钟后仍观察到细胞团块，则继续在 37 °C 下用胰蛋白酶孵育最多至 4 分钟。若胰蛋白酶消化 4 分钟后细胞仍相互黏附，则不应将这些细胞用于克隆形成实验，否则会导致克隆数量计数出现误差。
      注意：若细胞成团，则形成的克隆数将反映接种细胞数中较少细胞的乘积。若胰蛋白酶消化过度，细胞的克隆形成潜能可能降低。
   4. 通过在一支主试管中进行系列稀释（该试管包含实验中所有变量所需的总体积），将细胞用培养基配制成 1,500 个细胞/ml 的单细胞悬液，用于 24 孔板或更低浓度（根据细胞类型或传代次数可增加 500 个细胞/ml）。
      注意：目标终末细胞密度为 800 个细胞/cm²（范围....

结果

实验旨在重复该检测方法。实验的时间进程如图所示。 图 2A细胞于第-1天以克隆形成密度接种，在第0天向新鲜培养基中添加FGF-2，并持续培养至第6天，随后进行染色并计数克隆。对系统的任何干预均于第3天施加。 100 μl 所需终浓度的10倍体积 图2B 展示了生长和休眠菌落的典型形态。生长菌落包含 >30个细胞和休眠菌落包含12个或更少的细胞，这些细胞的体积比生长中的细胞大许多倍，且具有较大的细胞质/细胞核比例。 图 2C 展示了四次重复实验的典型结果。未添加 FGF-2 时，细胞主要表现为生长型克隆；而在 FGF-2 存在的情况下，绝大多数克隆处于静息状态。

图3 是一项在第3天添加干扰试剂的实验示例。该图展示了通过广谱Rho抑制剂C3转移酶和Rho激酶（ROCK）抑制剂Y27632抑制GTP酶Rho家族后，对静息克隆产生的剂量依赖性抑制作用。该检测方法可用于评估所添加抑制剂对静息克隆以及生长中克隆的半数有效浓度（ED₅₀

讨论

我们的模型包含了骨髓中休眠状态的多个关键要素。该模型包括对雌激素敏感的细胞，这类细胞可能在骨髓中长期处于休眠状态¹⁰；包含纤维连接蛋白（fibronectin），这是骨髓的关键结构成分；包含成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），这是一种由骨髓基质细胞大量合成并大量沉积于骨髓细胞外基质中的生长因子^31,32；还包括以克隆形成密度培养细胞，使细胞之间的相互作用主要发生在细胞与基质之间。尽管骨髓微环境远比此复杂，但这一简化系统可根据研究特定机制问题的需要，逐步增加复杂性。

该模型可用于通过多种方法比较休眠细胞与生长中的细胞，包括细胞生物学技术、分子生物学技术以及体内技术。细胞表型可通过重新克隆、运动性与侵袭性研究³⁵、非黏附性肿瘤起始球体形成³⁶，或利用特异性阻断抗体或肽段进行微环境相互作用的功能研究⁷来检测。

克隆形成实验的主要结果是克隆集落数量的计数，这些克隆可能处于生长状态或静息状态，从而反映细胞的生.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MCF-7 细胞	ATCC	HTB-22
T47D 细胞	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 孔透明平底 TC 处理多孔培养板	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm 培养皿	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm 培养皿	Corning	354451
BD BioCoat 22×22 mm #1 玻璃盖玻片，均匀包被人纤维连接蛋白	Corning	354088
6 孔组织培养板	CellTreat	229106
DMEM 高糖培养基 10X 粉剂	Corning Life Sciences	50-013-PB
热灭活胎牛血清	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
青霉素-链霉素溶液，100X	Corning	30-002-CI
L-谷氨酰胺，100X，液体	Corning	25-005-CI
重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF basic）	R&D Systems	234-FSE-025
Akt 抑制剂（1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯）	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	PI3K 化学抑制剂
C3 转移酶	Cytoskeleton	CTO3	抑制 RhoA、RhoB 和 RhoC，但不抑制其他相关 GTP 酶如 Cdc42 或 Rac1
Y-27632 二盐酸盐	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-鬼笔环肽（绿色）	Molecular Probes	B607	用于丝状肌动蛋白染色的荧光染料
BODIPY FL-罗丹明鬼笔环肽（红色）	Molecular Probes	R415	用于丝状肌动蛋白染色的荧光染料
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG 抗体，ReadyProbes 试剂	Molecular Probes	R37114
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Molecular Probes	P-36931