一种经济、可扩展的行为检测方法，用于测量乙醇镇静敏感性及快速耐受性 果蝇

摘要

测量乙醇敏感性与快速耐受性的简便实验方法 果蝇 促进利用该模式生物研究这些重要的酒精相关行为。本文描述了一种相对简单、可扩展的检测果蝇酒精敏感性和快速耐受性的实验方法。

摘要

酒精使用障碍（AUD）是一种严重的健康问题。尽管AUD具有显著的遗传成分，但迄今仅有少数基因被明确证实与其病因相关。果蝇（Drosophila melanogaster） 果蝇 黑腹果蝇是研究酒精相关行为背后分子遗传机制的有力模型，因此在识别和理解影响酒精使用障碍（AUD）的基因功能方面具有广阔前景。该模型的使用 果蝇 适用于此类研究的模型取决于能否获得可可靠测量乙醇行为反应的检测方法。本报告描述了一种可用于评估果蝇乙醇敏感性和快速耐受性的检测方法。本检测中测得的乙醇敏感性受乙醇使用体积和浓度、多种先前报道的遗传操作，以及果蝇在测试前禁食时间长短的影响。相比之下，该检测中的乙醇敏感性不受果蝇操作强度、果蝇性别，以及培养基中添加抗生素或活酵母的影响。文中介绍了三种不同的乙醇敏感性定量方法，所得结果基本一致。该检测方法具有可扩展性，且设置简便、成本相对较低，适用于对果蝇乙醇敏感性和快速耐受性进行小规模和大规模的遗传分析 果蝇.

引言

酒精使用障碍（AUD）是全球范围内严重的健康问题（详见综述） ¹）。尽管驱动酒精使用障碍（AUD）发展的机制十分复杂，但这类疾病具有显著的遗传成分（例如， ²). AUD 的高遗传性 以及多种物种对乙醇保守的行为反应（详见综述于 ^3,4) 已引发人们利用遗传模型生物研究特定基因在酒精相关行为中作用的浓厚兴趣，以期更深入地理解酒精使用障碍（AUD）的分子基础。果蝇（Drosophila melanogaster） 果蝇 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）已成为研究乙醇相关行为的分子遗传机制的首选模式生物（综述见 ^3,4）。果蝇中的研究已揭示了多种信号通路在乙醇行为反应中的作用（详见综述于 ⁵有趣的是，一些影响果蝇对乙醇行为反应的基因和通路也与啮齿类动物的乙醇相关行为和/或人类酒精使用障碍（AUD）有关 (例如， ^6-14）。跨物种间驱动酒精相关行为的机制具有保守性，加之该物种可利用一系列遗传学工具 果蝇 模型系统，强调了果蝇模型在研究乙醇行为反应遗传学方面的实用性。

人类对乙醇的敏感性^15,16和耐受性（见文献¹⁷综述）与酒精使用障碍（AUD）的发展有关。这些对乙醇的行为反应均可通过多种实验室检测方法在果蝇中建立模型（见文献^3,4综述）。作者所知的所有果蝇检测方法均基于乙醇引起的时间依赖性镇静/运动失调，或乙醇镇静后的时间依赖性恢复。

在我们课题组此前发表的一篇关于乙醇敏感性与快速耐受遗传学的文章中 黑腹果蝇采用基于乙醇蒸气诱导果蝇镇静的行为学检测方法 ¹⁸. 通过将未麻醉的活体成年果蝇转移至空的食物小瓶中开始本实验，用醋酸纤维素塞将果蝇封存在小瓶内，随后在顶部加入乙醇（即， 纤维素乙酸酯塞的非蝇侧），并用硅胶塞密封含有果蝇、纤维素乙酸酯塞和乙醇的小瓶（参见示意图 图 S3，参考文献 ¹⁸）。多个试管代表不同组别的果蝇，同时进行平行评估，提高了该检测方法的通量。试管均标记为匿名代码，实验操作者对处理分组保持盲态，以避免在镇静评估中引入无意偏倚。在标准实验中，每间隔6分钟轻敲试管，经过30秒恢复后，记录每管中未镇静果蝇的数量，并换算为活动果蝇百分比。果蝇通过醋酸纤维素塞吸收乙醇蒸气，吸收呈时间依赖性，导致体内乙醇浓度逐步升高¹⁸ 和镇静（参见参考文献 ¹⁸ 和 图1A 和 1B 在本报告中，该实验中的镇静状态被操作性定义为果蝇（i）静止站立且不进行行走，或（ii）仰卧于背，无论是否伴有翅膀扑动。本文详细描述了乙醇镇静实验的操作流程，进一步提供了与该实验应用相关的操作优化建议，并利用该实验探讨了不同食物补充方案对果蝇镇静敏感性的影响。

方案

1. 检测前一天

1. 在环境受控的空间（通常为 25 °C、相对湿度 60%、12 小时光照/12 小时黑暗循环）中，将果蝇用短暂（1–5 分钟）CO₂ 麻醉后，按每组 11 只（单性别）收集至新鲜培养基小瓶中。
2. 让果蝇在培养基小瓶中过夜恢复。
3. 通过将纯（100%）乙醇用纯化水（≥18 MΩ）稀释，配制适当终浓度的乙醇溶液，用于后续实验。将溶液过夜放置至室温。
   注意：乙醇稀释过程为放热反应。

2. 检测当天

1. 针对每个待测果蝇小瓶，准备以下物品：(i) 一个洁净的空食物小瓶（即测试小瓶），(ii) 一个新的醋酸纤维素塞，(iii) 一个硅胶塞，以及 (iv) 1 ml 乙醇溶液（参见 表3）。
2. 调节测试室的温度至 20–25 °C，相对湿度至 55–65%。
3. 安排另一名操作人员为每组小瓶分配唯一的编码并记录，以备后续使用。将带有果蝇的编码小瓶放入测试室，使其适应环境数分钟。
4. 标记空的测试小瓶，使其编码与步骤 2.3 中果蝇小瓶上的编码相对应。
5. 参照类似 表1 的电子表格，将编码填入各列（每列对应一个小瓶），制作纸质版测试记录表。
6. 以测试记录表为指导，在测试室内将带有果蝇的编码食物小瓶和空的测试小瓶按对应顺序排列成阵列。
   注意：合理的最大测试小瓶数量为 24 个（即 6 组，每组 4 个小瓶）。
7. 将果蝇从食物小瓶转移至配对并标记的空测试小瓶中，并立即插入醋酸纤维素塞，使塞子顶端距离小瓶口 2 cm。
8. 此后，以交错 1 分钟 间隔的方式，将每排四个小瓶作为一组进行操作。
9. 在时间点 0 进行评估时，用拇指和食指单独握住每个小瓶，在桌面上轻敲三次，使果蝇震落至小瓶底部，等待 30 秒后，计数无法活动或已死亡的果蝇数量。在纸质测试记录表中记录每个小瓶在 0 分钟时无法活动或死亡的果蝇数量。
10. 在时间点 0 启动计时器并持续计时，立即开始向第一排/第一组 4 个小瓶的醋酸纤维素塞中各加入 1 ml 乙醇。按照待测顺序，每隔 5 秒向一个小瓶的醋酸纤维素塞中加入 1 ml 乙醇。以环形方式加入乙醇，使乙醇在整个醋酸纤维素塞中均匀吸收。当该组全部 4 个测试小瓶均加入乙醇后，向每个小瓶插入一个硅胶塞以密封。
11. 在 1、2、3、4 和 5 分钟时，分别向第二、第三、第四、第五和第六组（每组 4 个小瓶）的醋酸纤维素塞中加入 1 ml 乙醇。每完成一组 4 个小瓶的乙醇添加后，继续插入硅胶塞。
12. 在 6 分钟时，测试第一组 4 个小瓶：用拇指和食指握住每个小瓶，在桌面上轻敲三次使果蝇落至瓶底，等待 30 秒后，计数并记录处于麻醉状态的果蝇总数。若果蝇出现以下情况，则记为已麻醉：(i) 停留在小瓶底部但不走动，或 (ii) 仰面躺倒，无论是否扇动翅膀。
13. 根据 表2 中的时间安排，每组内的每个小瓶以 5 秒间隔依次操作。
14. 在 7、8、9、10 和 11 分钟时，分别对第二、第三、第四、第五和第六组小瓶进行测试，方法同第一组。
15. 在 12 分钟时，再次测试第一组 4 个小瓶（方法同步骤 2.12），随后分别在 13、14、15、16 和 17 分钟时继续测试第二、第三、第四、第五和第六组小瓶。
16. 按照步骤 2.12 所述方法持续测试果蝇，直至所有果蝇均进入麻醉状态。
17. 在纸质测试记录表中填写每个小瓶的果蝇总数。从总数中剔除在时间点 0 时已无法活动或死亡的果蝇。
18. 计算每个评估时间点的活动果蝇百分比，并绘制 % 活动果蝇（y 轴）对时间（x 轴）的曲线图。通过三阶多项式或 S 形曲线拟合插值得出 50% 麻醉时间（ST50，即达到 50% 麻醉所需时间），或计算曲线下面积，以量化乙醇麻醉效应。
19. 汇总解码后的小瓶数据，并根据实验设计进行适当的统计分析（例如 采用 Bonferroni 多重比较检验的单因素方差分析）。

结果

本乙醇镇静实验的原始数据为在不同乙醇蒸气暴露时间下被镇静的果蝇数量。原始数据被转换为随时间变化的活动果蝇百分比（主要数据，图1A、B、D–F）。根据主要数据，乙醇镇静敏感性可通过镇静时间50（ST50）进行量化，即50%果蝇被镇静所需的时间，或通过曲线下的面积（AUC）经曲线拟合插值计算得出。如预期所示，先前报道的¹⁸三阶多项式曲线能够很好地拟合主要数据（平均R² = 0.934，n = 24，图1A），尽管S型曲线对主要数据的拟合效果略优（平均R² = 0.997，n = 24；图1B）。作为从曲线拟合中确定ST50值的替代方法，乙醇镇静敏感性也可通过曲线下面积（AUC，%活动果蝇 × 时间）进行量化（图1C）。这三种量化方法的结果彼此高度相关（Pearson r² ≥ 0.998，n = 24），且几乎无法区分（...

讨论

能够可靠地定量测定有意义表型的简便检测方法对于行为分析具有重要价值。本文所述的研究针对了果蝇（Drosophila）乙醇镇静敏感性和快速耐受性检测中的若干实际操作问题。尽管并非本研究的重点，但在一项研究中保持受试对象的环境条件和遗传背景一致，有助于提高行为学分析的可靠性。此外，通常应在并行饲养和测试的果蝇组之间进行比较。为此，本研究中各个实验内的所有果蝇均具有相同的遗传背景，并在统一的环境条件下（25 °C，60% 相对湿度，12 小时光照/黑暗循环）使用标准食物培养基（10% 蔗糖、3.3% 玉米粉、2% 酵母和 1% 琼脂）并行饲养，除非实验中明确对食物培养基进行了干预处理。

此处描述的乙醇镇静实验仅需少量材料（塑料小瓶、醋酸纤维素塞、硅胶塞和乙醇），所有材料均价格低廉且可从商业渠道轻松获得。表3）。该乙醇镇静实验与先前报道的方法相似，并在很大程度上基于这些方法（例如， ^6,20,25-27，已在 ^3,28）。尽管所有这些检测方法均可用于测量乙醇镇静敏感性，但本文所...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
食物瓶	VWR	89092-772	窄口
果蝇培养管塞	Genesee/flystuff.com	49-102	窄口
硅胶塞	Fisher Scientific	09-704-1l	#4
乙醇	Pharmaco-Aaper	111000200	200 proof