一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜

摘要

开孔肝窦内皮细胞是一个生物学上重要的过滤系统，受各种疾病、毒素和生理状态的高度影响。这些变化对肝功能有显著影响。我们描述了这些细胞中开窗大小和数量的标准化测量方法。

摘要

肝窦内皮细胞是通往肝脏的门户，它们的跨细胞开窗允许小的和溶解的物质从血液中畅通无阻地转移到肝实质中进行代谢和加工。Fenestrations 是动态结构 - 它们的大小和/或数量都可以响应各种生理状态、药物和疾病而改变，使它们成为调节的重要目标。了解 LSEC 形态如何受各种疾病、毒性和生理状态的影响以及这些变化如何影响肝功能，需要准确测量开窗的大小和数量。在本文中，我们描述了我们实验室使用的扫描电子显微镜固定和处理技术，以确保可重复的标本制备和准确解释。这些方法包括灌注固定、二次固定和脱水、扫描电子显微镜的准备和分析。最后，我们提供了一种标准化图像分析的分步方法，这将使该领域的所有研究人员受益。

引言

肝窦内皮细胞（LSECs）是高度分化的内皮细胞排列在肝窦的壁。 LSECs均穿有穿孔是非diaphragmed，跨细胞孔径为50-250纳米。高达LSECs的表面的20％被覆盖穿孔，这通常是在几十组到几百称为筛板^1-3（ 图1）。开窗使血浆和血液和肝细胞之间nanosubstrates的转移，创造一个高效的超滤系统。窗孔是动态的结构 - 无论它们的尺寸和/或数量可以响应于各种生理状态，药物和疾病而改变。例如，穿孔较大在禁食比在进食状态^4; 2-二- iodoamphetamine增加开窗号; ^5,6-和尺寸的减小和穿孔的数目每细胞发生衰老和许多疾病状态^7-13 。窗孔的尺寸和数量的精确测量是理解如何LSEC形态是由各种疾病，中毒性和生理状态的影响重要;它们对肝功能的影响;和用于显影开窗调制治疗干预^1。

窗孔的研究是困难的。窗孔的直径在于传统光学显微镜的分辨率下面，所以无论是在完整的肝组织或培养LSECs以前只观察用电子显微镜已经成为可能。扫描电子显微镜（SEM）已最经常被用于研究开窗尺寸，频率和孔隙率（LSEC膜是受窗孔穿孔的百分比），因为SEM允许观测大面积的数千内皮表面和测量，如果不是几万窗孔的。尽管它的效用，这是从报告的结果的SEM为基础的研究为LSEC参数如开窗大小，数量，频率和孔隙率有很大的不同在文献中（ 表1）。

开窗和筛板是脆弱的结构，其合同，打破，扩张或标本制备过程中凝聚，从而精心加工是需要保持其完整性。升高灌注压^14;固定液和缓冲区¹⁵的不正确的渗透压;固定不充分或固定时间;和后固定脱水和干燥的速度是处理用于SEM的所有领域，可能产生伪影，与保存超微结构的干扰（ 图2）。窗孔的损失（'抛出窗外'）和开窗收缩可发生定影不良的结果，从而降低开窗直径和孔的孔隙率。方法，提高试样的保存用于SEM分析先前已经描述^15-17和将要讨论的这里，关于如何提高标本保存额外的提示。检体保存的主要目标是从血窦除去血液，使得LSEC的表面可以可视化，并避免从任一高压或延迟固定的LSEC损坏。固定剂经门静脉全肝灌注是肝脏固定的首选方法。如在详细描述别处^16,18灌注必须在低压力下进行（例如，10厘米H ₂ O），以避免压力相关灌注艺术品和损坏LSEC，典型表现内于细胞膜一样大的差距。然而，合理的固定通常可以使用从人类和动物的肝活检的针灌注获得，如在别处¹⁹进行详细描述。该技术包括直接注射入固定液的组织，直到血冲出样品和组织是坚定的和固定的。样品电子显微镜的固定需要被法律约束ormed尽快以下血流停止，以防止发生由于肝脏极其迅速自溶过程的结果超微结构改变。

我们还提出，最大限度地减少包含伪影，和标准化窗孔的测量图像分析的方法。变化血窦为显微照片的选择，人工制品的图像分析，并且小区区域的测量孔隙度和开窗频率已导致在已发表的结果重大差异。评估和窗孔和数据呈现的最低要求的测量标准化的做法没有得到明确解决在文献中以前^{4,10,20-31。}

方案

注:所有涉及使用动物的程序进行，根据当地的法规。我们的工作是经悉尼当地卫生区动物福利委员会。允许程序项目许可文档中描述，并按照指引，以确保动物在任何时候都幸福。确保遵守有关的地方进行工作的国家动物实验的立法。

为准备EM固色剂1.协议

1. 100ml中的固定剂的，通过加入2多聚甲醛粉末至25ml在一个锥形瓶中蒸馏水，加​​热至65ºC，用磁力搅拌器不断搅拌制备的多聚甲醛。
   注:戊二醛，多聚甲醛和二甲胂酸钠缓冲都是有害物质，必须始终在通风柜处理。
2. 热，在65ºC为2分钟，然后允许冷却。如果需要的话，加氢氧化钠溶液dropwISE边搅拌至完全明确的解决方案。
   注:氢氧化钠是危险的，小心处理。
3. 加入10毫升EM级库存戊二醛，将50ml的0.2M二甲胂酸钠缓冲液和2克蔗糖和搅拌用磁力搅拌器。添加1.0M的氯化钙_{2 2}毫升
4. 调节至pH 7.4之前使溶液至100毫升蒸馏水。最终固定剂中含有2.5％戊二醛，2％多聚甲醛，2毫摩尔_氯化钙 ，2％蔗糖的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中。确保总渗透压为440 mOsmol /升。使用内准备24小时。

肝2.灌注固定

1. 温馨灌注缓冲和定于35 - 37ºC。放血的缓冲液和固定液的正确的温度有助于确保组织的完整性。
2. 麻醉的动物用单次腹膜内注射50毫克/千克氯胺酮和5mg / kg的甲苯噻嗪。
3. 一旦动物是下深度麻醉，用后肢撤退和尾掐评估，A Y切口，钝性结束剪刀在动物的腹部，露出肝脏和门静脉。
   注:确保设备清洁，避免标本微生物和一般的碎片，这将很容易看到SEM污染。
4. 扎两个非常松散的缝线门静脉周围1近侧至肝脏，在其他更远侧到肝脏。
5. 导管插入门静脉与适当大小的IV套管（18克的老鼠，22克的老鼠）.Tighten缝线固定套管。
6. 开始灌注用磷酸盐缓冲盐水加热到37ºC，并在10厘米的H _{2 O}的压力。 5至20毫升的PBS通常需要抽血肝脏。
   注意:不要让气泡进入通过连接到他们的文物引起继发栓塞和压力套管管肝脏;损害肝细胞，SInusoids和LSEC窗孔发生，如果灌注压力过高。
7. 切断的腹部和胸部腔静脉，以允许缓冲从肝脏自由退出。这可以防止高背压损坏LSECs。
8. 一旦肝脏是免费的血液，用EM固定液更换PBS和灌注约5分钟，直到肝脏硬化，很苍白。
9. 停止灌注和削减固定肝脏中转化为1 - 2 mm ³的街区用锋利的手术刀。
10. 后修复组织EM固定液24 - 72小时，在4ºC。
    注:在一般情况下，underfixation导致比overfixation更多的文物。
11. 更改固定液以下后修复期为存储0.1M的二甲胂酸钠缓冲液，4ºC。
    注:存储在这种方式标本将被保存为一个显著一段时间（最长12个月），但及时的辅助固定和审查建议以获得最佳效果。

3.针Perfusion

注:针固定是灌注固定的一个变种，涉及到注入固定液直接进入肝脏活检组织。这样做的目的是为固定剂可以通过血管，以抽血它们和公开所有的组织块以固定剂冲洗。必须小心，以保持注射压力低，以避免气压伤^18,19。

1. 取出一小片来自动物或受肝脏和冲洗的生理盐水，以清除血液和碎片。
2. 绘制生理盐水注射进装有细针头（通常胰岛素注射器）。
3. 注入生理盐水非常缓慢进入肝脏的血，直到被刷新出来的组织。多次注射可能是必需的。
4. 绘制对EM固定液到装配有细规针（通常是胰岛素注射器）另一个注射器。
5. 注入固定液非常缓慢进入肝脏，直到它变得坚硬和棕褐色。多次喷射之间可以需要。
6. 用锋利的手术刀2毫米³个街区-切肝固定为1。在孵育固定液EM为24 - 72小时4℃。开始二次固定前需清洗的0.1M的二甲胂酸钠缓冲液的3倍。

4.准备扫描电子显微镜

1. 洗涤样品在0.1M二甲胂酸钠缓冲液3次。要修复脂类，交固定在0.1M二甲胂酸钠缓冲液将样品在2％四氧化锇进行2小时。
   注:完全清洗是非常重要的，因为戊二醛和四氧化锇交叉反应，生成SEM文物。
2. 冲洗样品中增加的乙醇浓度开始脱水。第一冲洗在50％乙醇5分钟;然后3次，每次5分钟，用70％的乙醇;冲洗3次，每次5分钟，用90％的乙醇;冲洗2次，每次5分钟，在100％乙醇;最后漂洗2次，在100％乙醇（分子筛）10分钟。
3. 从样本中删除所有乙醇和六甲基二带（HMDS）代替通风柜，离开10分钟。从组织样品中除去HMDS，并允许蒸发。
   注:HMDS是吸湿性强冷的时候，因此允许使用的最终脱水行程之前达到室温。
4. 可选，立即装入样品或将它们放入干燥器中，直到准备安装的扫描电镜。

5.安装

注:正确的样品安装将最大限度的提供SEM分析下明确界定血窦的数量。

1. 标记金属SEM存根的基极与应用双面导电碳胶带的存根的顶部。
2. 使用解剖显微镜来识别与用于随后的SEM最好血窦表面可视化的样品。向上放置该表面上的截线的碳胶带表面。
3. 坚持标本坚决存根，样品现在已经准备好了溅射镀膜。

ove_title"> 6。涂料

注:涂层在溅射镀膜机的理由有导电金属（金或铂）的致密的膜试样的试样和从电子束损伤保护它。如果涂层是感兴趣太厚结构可以被遮蔽。

1. 地方存根成的自动微溅射镀膜机的真空室，45秒设置模式为旋转和自动溅射涂覆。使用铂涂层更精细的细节，但是金也是合适的。
2. 涂抹一层薄薄的碳涂料以所安装的肝标本的外表面，小心不要涂覆正弦曲面。
3. 一旦标本都涂有铂和碳​​油漆已干，他们已经准备好观察的SEM。样品可以在干燥器中储存。

7.使用扫描电子显微镜

1. 地方标本进入扫描电子显微镜，并返回显微镜至真空。
2. 使用的样本可视化标准显微镜操作程序通过在开始低倍率，逐渐增加的放大倍率。
3. 确保显微镜为工作距离，光点尺寸和散光适当调整。
4. 检查固定的完整性。如果LSEC是从缺口较自由，并包含窗孔测量30 - 250 nm的直径，这将通常表明试样制备已经成功。
5. 如果正弦充满空隙或缺乏穿孔的试样准备尚未成功或有显著病理。在这种情况下，片具有非常优良的剃刀刀片的样品，并且切割表面重新涂复并成功地固定正弦分析。
6. 大约在15,000-20,000×倍率选择平坦的表面LSEC是免费的碎片具有良好的固定和其中窗孔清晰可见（通常至少含有10的窗孔）。
7. 保存至少10血窦图像每肝，来自各块的不同区域，使用每肝的至少两个块。采样10的显微照片以15,000 - 每只动物20000×放大倍数通常是足够的窗孔的量化是代表整个肝脏的。

8.分析

注意:可从美国国立卫生研究院免费下载的ImageJ软件来定量测定开窗直径和频率（ www.imagej.nih.gov/ij ）。

1. 使用嵌入在图像（ 屏幕快照1）的比例尺打开图像J和设置比例。
2. 使用多边形工具中的ImageJ，跟踪绕LSEC的整个平面区域包括有孔和defenestrated领域。不要只跟踪筛板，因为这会错误地夸大孔隙度。排除任何大的碎片是在细胞表面上，可能是obscuriNG窗孔。
3. 为了测量直径开窗，通过选择行工具跟踪通过每个开窗的最长直径线，然后按"M"来衡量的路线，和"d"（画）永久画上的图片就行了。这条线被定义为开窗直径。该生产线的长度现在可在结果框中的ImageJ（ 屏幕打出2）。
4. 测量这些都是LSEC细胞质超过250纳米的较大的孔，以及窗孔所有间隙。间隙往往假象反射灌注或定影不良，但是间隙也可以作为疾病和毒性的结果。对于缺口的数据将被排除在开窗参数计算分析后。
5. 差距是不是圆形的区域应该通过跟踪周围的空白，并计算其在ImageJ的面积计算。
6. 从ImageJ的结果框中的数据粘贴到Excel电子表格的furthe- [R分析。

9.计算

1. 平均直径开窗平均=所有开窗直径（不包括空白，其中差距≥250纳米）。
2. 开窗面积^=πR2，其中r，半径，是从各个窗孔直径相关（r = D / 2），不包括间隙算出。
3. 孔隙率^{（％）=（Σ（πR2）/}分析总面积- Σ（间隙的面积=））（微米^{2））×100。}
4. 开窗频率=开窗总数/（总面积分析-Σ（空白区域）（微米^2）。

10.介绍开窗数据

注:只要有可能，出版物，包括开窗数据的量化应包括下列资料

1. 开窗直径，以声明证实什么用的地方直径边界定义开窗（通常间50 - 250纳米），开窗频率（数个^/μm2）和孔隙率（％）。
2. 声明确认是否间隙已被包括在分析中，开窗直径和肝脏，块，图像和窗孔的数目的频度分布曲线应包括在分析中。

结果

在低放大倍数的扫描电子显微镜初始可视揭示肝脏标本具有暴露面积大到足以观察许多大的肝血管和正弦波（ 图1A）的平坦表面。确保正确的肝块放置于安装存根是用于获得清晰的图像的正弦和 ​​肝脏的Glisson囊应避免这个原因（ 图1B）是必不可少的。增加放大率允许稠密脉管肝脏的仔细检查揭示该分割容器（ 图1C）的肝细胞的单细胞板。的肝导致图像质量差，血液细胞和碎片差定影遮蔽肝脏（ 图1D）的图。

进一步增加放大倍数可以观察LSEC窗孔（ 图2A）的。至关重要的是，该正弦波是科尔 ectly确定-肝细胞的板可以在某些情况下看起来像血管，但功能，如胆小管协助定位（ 图2B）。高灌注压可能会导致假象，例如大的间隙在内皮，被认为是由在LSEC筛板的聚结所引起的。这些都容易SEM（ 图2C）所确定。直接避免细胞膜以上细胞核将协助开窗密度和孔隙度的计算（ 图2D）的准确性。

在LSEC用的ImageJ分析允许的LSEC开窗直径，密度和频率（ 图3A）定量。这些尺寸提供穿孔的经验测量，并允许致老化，疾病，毒素或疗法（ 图3B）的变化的测量。

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图1.可视化用SEM肝脏。 （一）在SEM下初步检查发现肝脏血窦和大型船舶包括门户道和中央静脉的;（二）Glisson囊覆盖血窦的所有细节;（三）密集的血管肝脏和摆在血管之间的肝细胞的单细胞板;（D）固定不佳导致崩溃血窦和超微结构文物的开发，请点击此处查看该图的放大版本。

图2.肝脏的超微结构。（A）LSEC窗孔很容易看到中的n良好固定的组织;（B）与保存完好的胆小管肝细胞的表面;（C）大的间隙所引起的高灌注压的内皮;（D）中的LSEC核由箭头表示的表面之下凸出薄LSEC，不应包括在孔隙度分析领域。 请点击此处查看该图的放大版本。

在LSEC与ImageJ的图3.分析。 （A）中的多边形工具允许测量及行工具用于测量开窗直径的总面积的测量;（B）通过从的Image J分析所获得的数据产生的频率直方图。269​​8fig3large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

直径（纳米）	频率（每UM2）	孔隙率（％）	参考
NA	NA	60±12	20
127±4纳米	6.5±0.5	4.6±0.4	21
NA	NA	40.5	22
NA	0.6±1.4	0.01±0.03
NA	2.5±0.5	0.047±0.012	24
87.25±1.4	NA	9.22±0.7	25
100-200	4.49±0.69	2.55±0.54	26
NA	NA	23±2	27
85±17	11±0.4	6.6±0.2	28
NA	2.7±1.1	4.1±2.3	10
68±1	8±0.6	3.4±0.2	29
NA	NA	3.9±0.2	三十
73.3±0.4	NA	2.2±0.2	31
90.7±11.7	8.45±2.43	5.93±2.05	4
110.7±0.25	9	6	3
104.8±0.22	13	8	3

表1中。

部件	假象
固定液的渗透压和缓冲太低（低渗）	细胞肿胀
固定液的渗透压和缓冲太高（高渗）	细胞皱缩
试样尺寸过大	孵化期间自溶= /不足固定液固定无法穿透远远不够
pH值固定液和锇缓冲之前小于7.2或7.4以上	蛋白质变性和结构畸形
固定时间太短	自溶
注视时间太长	可能会导致细胞皱缩
温度高	增大固定速度可能然而蛋白质变性
温度低	固定不足
灌注压过高	差距，狄氏扩大空间，在肝细胞空泡，筛板的损失，扩大开窗直径
机械损伤切碎和/或使用镊子时，	蜂窝结构的破碎，如果组织没有硬化不够好由固定剂
延长时间以固定去世后，活检标本，或放血	缺血，自溶，形成缺口，抛出窗外
低固定液孵化量	低于20倍的样品体积=在块的中心的固定剂和自溶的渗透不足。
˚Fixative浓度过高	浓度影响的固定和固定剂的渗透速度。假象的形成。
固定液的浓度过低	在固定过程之前，固定剂用尽完成产生细胞起泡和其他伪影。
不完全固定在肝脏的迹象	细胞出泡（微绒毛肿胀或从细胞质始发），抛出窗外，差距，微绒毛丧失，线粒体肿胀，细胞肿胀，倒塌或压缩血窦腔，血液在正弦流明，形状不规则的肝细胞核
固定液的血液污染	停用固定液
脏灌注和制备设备	标本污染的碎片和细菌
标本或存储的不完全脱水无涂层后干燥剂	特定男子充上SEM。添加碳漆块可能有助于降低费用

表2.故障排除技巧不佳标本和图像质量。

讨论

精确地和可重复地测量所述肝窦内皮的状态的能力是在理解这些高度特化的细胞的生物学的一个重要步骤。如结构照明显微镜^32，原子力显微镜³³和d- STORM（直接随机光学Reconstrucion显微镜^）34更新的技术将赋予重要的信息对这些细胞在体外的形态，但SEM仍然是主要的方法来可视化和在测量它们的结构原位 。

最关键和技术挑战性的一步是初始固定:如果肝脏保存完好的后续步骤会产生容易观察到，事实上，美丽，肝血窦的图像。全肝灌注是最有效的方法，以确保良好的固定，但可比较的结果是可能的，已被迅速固定针灌注样品中和在低压下。的水由脱水肝脏样本骨吸收是另一个常见的​​原因差SEM图像，但是这可以通过样品的正确的存储与干燥剂干燥器很容易地避免。

有必要对窗孔的量化的标准化，以便来自不同的研究小组研究可以进行比较和解释。在过去，一直在与有关如何将这些价值观得到很少的方法论发表信息的价值差异很大。在这里，我们提供了确定和提出描述开窗超微结构值的标准方法。

只要有可能，出版物，包括开窗数据的量化应包括以下信息:开窗直径，以声明证实什么用的地方直径边界定义开窗（通常在50 - 250纳米）;开窗频率（数/＆＃181;米^2）和孔隙率（％）;声明确认是否差距已经纳入分析;和开窗直径的频率分布图。另外，肝脏，块，图像和窗孔的数量应被包括在分析中。

开窗直径，频率和孔隙率的肝脏状态的重要指标，并标准化这个数据的收集将是该领域是有益的。这里讨论的方法可以确保所LSEC和窗孔的超微结构的研究被执行并在跨越不同的研究小组的可比方式呈现提供了一个框架。该方法很容易适应测量窗孔中分离和培养LSECs。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% EM 级戊二醛	ProSciTech	C001	将原液储存在 -20°C 直至需要，避免重新冷冻
多聚甲醛粉末	Sigma Aldrich	158127	始终准备多聚甲醛新鲜
二甲胂酸钠粉末	Sigma Aldrich	C0250	粉末溶解在 dH2O 中制备 0.2 M 原液，pH 7.4，主要在 0.1 M 下使用，通过准备 1：2 稀释液
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016	通过将粉末溶解在 dH2O
锇 tretroxide	ProSciTech	C011	使用前在弱酸中清洗安瓿瓶以避免污染。在玻璃瓶中制备 2% 原液
乙醇 - Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % 乙醇必须是高等级的，并与分子筛一起储存
其他等级的乙醇	Labtech	EL5	用dH2O六
甲基二硅氮烷	Aldrich	52619	使用前让其达到室温
鞘	Terumo	TSROX1832C、TSROX2225C TSROX2419C	18 G 适用于大多数大鼠，22 G 适用于大多数小鼠，但最好手头有几 24 G，以防非常小的小鼠
导电碳带	ProSciTech	IA0201
碳漆	ProSciTech	I003
氯胺酮			必须在许可下获得
甲苯噻嗪			必须在许可证下获得
分子筛	Sigma Aldrich	208647	从 100 % 乙醇中去除水分