利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

摘要

有孔肝窦状内皮细胞是一种重要的生物学滤过系统，其结构易受多种疾病、毒素及生理状态的影响。这些变化显著影响肝脏功能。本文描述了对该类细胞中孔径大小和孔数量进行测量的标准化方法。

摘要

肝窦内皮细胞是进入肝脏的门户，其细胞穿通性窗孔结构可使血液中的小分子和溶解物质无阻碍地进入肝实质，进行代谢和加工处理。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可随不同的生理状态、药物及疾病状态而发生改变，因此成为重要的调控靶点。要理解不同疾病、毒性及生理状态下肝窦内皮细胞形态的变化及其对肝功能的影响，必须准确测量窗孔的大小和数量。本文介绍了我们实验室所采用的扫描电镜固定与处理技术，以确保样本制备的可重复性及结果解读的准确性。这些方法包括灌注固定、继发固定与脱水、扫描电镜样品制备以及图像分析。最后，我们提供了一套标准化图像分析的逐步操作方法，以惠及本领域所有研究人员。

引言

肝窦内皮细胞（LSECs）是高度分化的内皮细胞，衬于肝窦壁内。LSECs 上具有无隔膜的穿胞孔，称为窗孔，直径为 50–250 nm。LSECs 表面最多有 20% 被窗孔覆盖，这些窗孔通常成群分布，每群由数十至数百个窗孔组成，称为筛板^1-3（图 1）。窗孔允许血浆和纳米底物在血液与肝细胞之间转运，从而形成高效的超滤系统。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可因不同的生理状态、药物及疾病而发生改变。例如，禁食状态下窗孔比进食状态下更大⁴；2-二碘安非他明可增加窗孔数量^5,6；而在衰老及多种疾病状态下，每个细胞的窗孔大小和数量均会减少^7-13。准确测量窗孔的大小和数量，对于理解不同疾病、毒性及生理状态对 LSEC 形态的影响、其对肝功能的作用，以及开发调节窗孔的治疗干预手段具有重要意义¹。

研究窗孔结构具有较大难度。窗孔的直径低于常规光学显微镜的分辨极限，因此以往只能通过电子显微镜观察完整肝组织或培养的肝窦内皮细胞（LSECs）中的窗孔。扫描电子显微镜（SEM）最常用于研究窗孔的大小、频率和孔隙率（即被窗孔穿孔的LSEC膜所占的百分比），因为SEM能够观察内皮表面的大范围区域，并可测量成千上万甚至数万个窗孔。尽管SEM具有实用价值，但基于SEM的研究所报道的LSEC参数（如窗孔大小、数量、频率和孔隙率）在文献中存在广泛差异（....

方案

注意：所有涉及动物使用的操作均根据当地法律法规进行。我们的研究已获得悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循始终确保动物福利的指导原则。 务必遵守研究所在国家关于动物实验的法律法规。

1. 透射电镜固定液制备方案

1. 对于100 ml固定液，准备 将2 g多聚甲醛粉末加入25 ml蒸馏水中，置于锥形瓶内，加热至65 ºC，并用磁力搅拌器持续搅拌。
   注意：戊二醛、多聚甲醛和二甲胂酸钠缓冲液均为有害物质，必须始终在通风橱中操作。
2. 65 ºC 加热 2 分钟，然后冷却。如有需要，边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，直至溶液完全澄清。
   注意：氢氧化钠具有危险性，需小心操作。
3. 加入10 ml EM级储备液 戊二醛，50 ml 0.2 M 卡可基酸钠缓冲液和 2 g 蔗糖，用磁力搅拌器搅拌。加入 2 ml 1.0 M CaCl₂₂.
4. 用蒸馏水定容至 100 ml 前，调节 pH 至 7.4。终末固定液含有 2.5 % 戊二醛、2 % 多聚甲醛、2 mmol CaCl₂。₂，0.1 M 中含 2% 蔗糖  卡可基酸盐缓冲液。确保总渗透压为440 mOsmol/L。24小时内使用。 制备方法。

结果

通过扫描电子显微镜在低倍率下进行初步观察，可见肝脏标本表面平坦，暴露区域足够大，可观察到许多较大的肝血管和肝窦（图1A）。为获得清晰的肝窦图像，必须确保肝脏组织块在载样 stub 上的正确放置，因此应避免观察到肝格利森囊（Glisson’s capsule）（图1B）。提高放大倍数后，可更细致地观察肝脏密集的血管系统，并显示出分隔血管的单层肝细胞板（图1C）。肝脏固定不良会导致图像质量下降，血细胞和碎片会遮挡肝脏结构的观察（图1D）。

进一步增加放大倍数可观察到肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构（图 2A）。正确识别肝窦结构至关重要——在某些情况下，肝细胞板可能看似血管，但诸如胆小管等结构特征有助于定位判断（图 2B）。过高的灌注压力可能导致内皮层出现大间隙等假象，这被认为是LSEC筛板融合所致。此类假象在扫描电镜（SEM）下易于识别（图 2C）。.......

讨论

准确且可重复地测量肝窦内皮细胞状态的能力是理解这些高度特化细胞生物学的重要一步。新兴技术如结构照明显微镜³²，原子力显微镜³³ 以及 d-STORM（直接随机光学重建显微镜） ³⁴ 将提供有关这些细胞形态的重要信息 体外 但扫描电镜（SEM）仍是观察和测量其结构的主要方法 原位.

最关键的且技术上最具挑战性的步骤是初始固定：如果肝脏保存良好，后续步骤将产生易于观察且确实美观的肝窦图像。全肝灌注是确保良好固定的最有效方法，但在快速且低压条件下固定的针式灌注样本也可获得相当的结果。脱水肝脏样本吸收水分是导致扫描电镜图像质量差的另一个常见原因，但通过将样本正确储存在含有干燥剂的干燥器中，这一问题可轻易避免。

有必要对窗孔结构的定量方法进行标准化，以便能够比较和解读不同研究团队的研究结果。过去发表的数值存在较大差异，且关于这些数值获取方法的细节信息极少。本文提供了一种标准化的方法，用于确定和呈现描述窗孔超微结构的参数值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% 电子显微镜级戊二醛	ProSciTech	C001	将储备液保存于 -20 °C，直至使用；避免反复冻融
多聚甲醛粉末	Sigma Aldrich	158127	每次均需新鲜配制多聚甲醛
二甲胂酸钠粉末	Sigma Aldrich	C0250	配制 0.2 M 储存液，pH 7.4，将粉末溶于 dH₂O 中2O，通常以0.1 M浓度使用，通过1:2稀释制备
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016	通过将粉末溶于dH₂O中配制1 M CaCl₂2O
四氧化锇	ProSciTech	C011	使用前用弱酸清洗安瓿瓶，以避免污染。在玻璃瓶中配制2%的储备液
乙醇- 绝对	Sigma Aldrich	459836	100% 乙醇必须为高纯度，并与分子筛一同储存
其他等级的乙醇	实验室技术	EL5	用dH₂O配制梯度乙醇2O
六甲基二硅氮烷	Sigma Aldrich	52619	使用前需恢复至室温
套管针	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G 适用于大多数大鼠，22 G 适用于大多数小鼠，但最好备用几根 24 G 针头，以应对体型非常小的小鼠
导电碳带	ProSciTech	IA0201
碳导电银浆	ProSciTech	I003
氯胺酮			必须在许可下获取
赛拉嗪			必须在许可下获取
分子筛	Sigma Aldrich	208647	从100%乙醇中去除水分