一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜

摘要

开孔肝窦内皮细胞是一个生物学上重要的过滤系统，受各种疾病、毒素和生理状态的高度影响。这些变化对肝功能有显著影响。我们描述了这些细胞中开窗大小和数量的标准化测量方法。

摘要

肝窦内皮细胞是通往肝脏的门户，它们的跨细胞开窗允许小的和溶解的物质从血液中畅通无阻地转移到肝实质中进行代谢和加工。Fenestrations 是动态结构 - 它们的大小和/或数量都可以响应各种生理状态、药物和疾病而改变，使它们成为调节的重要目标。了解 LSEC 形态如何受各种疾病、毒性和生理状态的影响以及这些变化如何影响肝功能，需要准确测量开窗的大小和数量。在本文中，我们描述了我们实验室使用的扫描电子显微镜固定和处理技术，以确保可重复的标本制备和准确解释。这些方法包括灌注固定、二次固定和脱水、扫描电子显微镜的准备和分析。最后，我们提供了一种标准化图像分析的分步方法，这将使该领域的所有研究人员受益。

引言

肝窦内皮细胞（LSECs）是高度分化的内皮细胞排列在肝窦的壁。 LSECs均穿有穿孔是非diaphragmed，跨细胞孔径为50-250纳米。高达LSECs的表面的20％被覆盖穿孔，这通常是在几十组到几百称为筛板^1-3（ 图1）。开窗使血浆和血液和肝细胞之间nanosubstrates的转移，创造一个高效的超滤系统。窗孔是动态的结构 - 无论它们的尺寸和/或数量可以响应于各种生理状态，药物和疾病而改变。例如，穿孔较大在禁食比在进食状态^4; 2-二- iodoamphetamine增加开窗号; ^5,6-和尺寸的减小和穿孔的数目每细胞发生衰老和许多疾病状态^7-13 。窗孔的尺寸和数量的精确测量是理解如何LSEC形态是由各种疾病，中毒性和生理状态的影响重要;它们对肝功能的影响;和用于显影开窗调制治疗干预^1。

窗孔的研究是困难的。窗孔的直径在于传统光学显微镜的分辨率下面，所以无论是在完整的肝组织或培养LSECs以前只观察用电子显微镜已经成为可能。扫描电子显微镜（SEM）已最经常被用于研究开窗尺寸，频率和孔隙率（LSEC膜是受窗孔穿孔的百分比），因为SEM允许观测大面积的数千内皮表面和测量，如果不是几万窗孔的。尽管它的效用，这是从报告的结果的SEM为基础的研究为LSEC参数如开窗大小，数量，频率和孔隙率有很大的不同在文献中（

方案

注:所有涉及使用动物的程序进行，根据当地的法规。我们的工作是经悉尼当地卫生区动物福利委员会。允许程序项目许可文档中描述，并按照指引，以确保动物在任何时候都幸福。确保遵守有关的地方进行工作的国家动物实验的立法。

为准备EM固色剂1.协议

1. 100ml中的固定剂的，通过加入2多聚甲醛粉末至25ml在一个锥形瓶中蒸馏水，加​​热至65ºC，用磁力搅拌器不断搅拌制备的多聚甲醛。
   注:戊二醛，多聚甲醛和二甲胂酸钠缓冲都是有害物质，必须始终在通风柜处理。
2. 热，在65ºC为2分钟，然后允许冷却。如果需要的话，加氢氧化钠溶液dropwISE边搅拌至完全明确的解决方案。
   注:氢氧化钠是危险的，小心处理。
3. 加入10毫升EM级库存戊二醛，将50ml的0.2M二甲胂酸钠缓冲液和2克蔗糖和搅拌用磁力搅拌器。添加1.0M的氯化钙_{2 2}毫升
4. 调节至pH 7.4之前使溶液至100毫升蒸馏水。最终固定剂中含有2.5％戊二醛，2％多聚甲醛，2毫摩尔_氯化钙 ，2％蔗糖的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中。确保总渗透压为440 mOsmol /升。使用内准备24小时。

肝2.灌注固定

1. 温馨灌注缓冲和定于35 - 37ºC。放血的缓冲液和固定液的正确的温度有助于确保组织的完整性。
2. 麻....

结果

在低放大倍数的扫描电子显微镜初始可视揭示肝脏标本具有暴露面积大到足以观察许多大的肝血管和正弦波（ 图1A）的平坦表面。确保正确的肝块放置于安装存根是用于获得清晰的图像的正弦和 ​​肝脏的Glisson囊应避免这个原因（ 图1B）是必不可少的。增加放大率允许稠密脉管肝脏的仔细检查揭示该分割容器（ 图1C）的肝细胞的单细胞板。的肝导致图像质量差，血液细胞和碎片差定影遮蔽肝脏（ 图1D）的图。

进一步增加放大倍数可以观察LSEC窗孔（ 图2A）的。至关重要的是，该正弦波是科尔 ectly确定-肝细胞的板可以在某些情况下看起来像血管，但功能，如胆小管协助定位（ 图2B）。高灌注压可能会导致假象，例如大的间隙在内皮，被认为是由在LSEC筛板的聚结所引起的。这些都容易SEM（ 图2C）所确定。直接避免细胞膜以上细胞核将协助开窗密度和孔隙度的计算（

讨论

精确地和可重复地测量所述肝窦内皮的状态的能力是在理解这些高度特化的细胞的生物学的一个重要步骤。如结构照明显微镜^32，原子力显微镜³³和d- STORM（直接随机光学Reconstrucion显微镜^）34更新的技术将赋予重要的信息对这些细胞在体外的形态，但SEM仍然是主要的方法来可视化和在测量它们的结构原位 。

最关键和技术挑战性的一步是初始固定:如果肝脏保存完好的后续步骤会产生容易观察到，事实上，美丽，肝血窦的图像。全肝灌注是最有效的方法，以确保良好的固定，但可比较的结果是可能的，已被迅速固定针灌注样品中和在低压下。的水由脱水肝脏样本骨吸收是另一个常见的​​原因差SEM图像，但是这可以通过样品的正确的存储与干燥剂干燥器很容易地避免。

有必要对窗孔的量化的标准化，以便来自不同的研究小组研究可以进行比较和解释。在过去，一直在与有关如何将这些价值观得到很少的方法论发表信息的价值差异很大。在这里，我们提供了确定和提出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% EM 级戊二醛	ProSciTech	C001	将原液储存在 -20°C 直至需要，避免重新冷冻
多聚甲醛粉末	Sigma Aldrich	158127	始终准备多聚甲醛新鲜
二甲胂酸钠粉末	Sigma Aldrich	C0250	粉末溶解在 dH2O 中制备 0.2 M 原液，pH 7.4，主要在 0.1 M 下使用，通过准备 1：2 稀释液
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016	通过将粉末溶解在 dH2O
锇 tretroxide	ProSciTech	C011	使用前在弱酸中清洗安瓿瓶以避免污染。在玻璃瓶中制备 2% 原液
乙醇 - Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % 乙醇必须是高等级的，并与分子筛一起储存
其他等级的乙醇	Labtech	EL5	用dH2O六
甲基二硅氮烷	Aldrich	52619	使用前让其达到室温
鞘	Terumo	TSROX1832C、TSROX2225C TSROX2419C	18 G 适用于大多数大鼠，22 G 适用于大多数小鼠，但最好手头有几 24 G，以防非常小的小鼠
导电碳带	ProSciTech	IA0201
碳漆	ProSciTech	I003
氯胺酮			必须在许可下获得
甲苯噻嗪			必须在许可证下获得
分子筛	Sigma Aldrich	208647	从 100 % 乙醇中去除水分