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方法文章

利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

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DOI：

10.3791/52698

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2015年4月30日

 ,  ,  , 
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

有孔肝窦状内皮细胞是一种重要的生物学滤过系统，其结构易受多种疾病、毒素及生理状态的影响。这些变化显著影响肝脏功能。本文描述了对该类细胞中孔径大小和孔数量进行测量的标准化方法。

摘要

肝窦内皮细胞是进入肝脏的门户，其细胞穿通性窗孔结构可使血液中的小分子和溶解物质无阻碍地进入肝实质，进行代谢和加工处理。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可随不同的生理状态、药物及疾病状态而发生改变，因此成为重要的调控靶点。要理解不同疾病、毒性及生理状态下肝窦内皮细胞形态的变化及其对肝功能的影响，必须准确测量窗孔的大小和数量。本文介绍了我们实验室所采用的扫描电镜固定与处理技术，以确保样本制备的可重复性及结果解读的准确性。这些方法包括灌注固定、继发固定与脱水、扫描电镜样品制备以及图像分析。最后，我们提供了一套标准化图像分析的逐步操作方法，以惠及本领域所有研究人员。

引言

肝窦内皮细胞（LSECs）是高度分化的内皮细胞，衬于肝窦壁内。LSECs 上具有无隔膜的穿胞孔，称为窗孔，直径为 50–250 nm。LSECs 表面最多有 20% 被窗孔覆盖，这些窗孔通常成群分布，每群由数十至数百个窗孔组成，称为筛板1-3（图 1）。窗孔允许血浆和纳米底物在血液与肝细胞之间转运，从而形成高效的超滤系统。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可因不同的生理状态、药物及疾病而发生改变。例如，禁食状态下窗孔比进食状态下更大4；2-二碘安非他明可增加窗孔数量5,6；而在衰老及多种疾病状态下，每个细胞的窗孔大小和数量均会减少7-13。准确测量窗孔的大小和数量，对于理解不同疾病、毒性及生理状态对 LSEC 形态的影响、其对肝功能的作用，以及开发调节窗孔的治疗干预手段具有重要意义1。

研究窗孔结构具有较大难度。窗孔的直径低于常规光学显微镜的分辨极限，因此以往只能通过电子显微镜观察完整肝组织或培养的肝窦内皮细胞（LSECs）中的窗孔。扫描电子显微镜（SEM）最常用于研究窗孔的大小、频率和孔隙率（即被窗孔穿孔的LSEC膜所占的百分比），因为SEM能够观察内皮表面的大范围区域，并可测量成千上万甚至数万个窗孔。尽管SEM具有实用价值，但基于SEM的研究所报道的LSEC参数（如窗孔大小、数量、频率和孔隙率）在文献中存在广泛差异（表1）。

窗孔和筛板是脆弱的结构，在样本制备过程中可能发生收缩、破裂、扩张或融合，因此需要谨慎处理以保持其完整性。灌注压力升高14；固定剂和缓冲液的渗透压不正确15；固定不充分或固定时间不足；以及固定后脱水和干燥速度过快，都是扫描电镜（SEM）样本处理中可能产生干扰超微结构保存的人工假象的因素（图2）。窗孔的丢失（“去窗孔化”）和窗孔收缩可能因固定不良而发生，导致窗孔直径减小和细胞通透性降低。此前已有文献描述过改进用于SEM分析样本保存的方法15–17，本文将对此进行讨论，并补充一些提高样本保存质量的实用建议。样本保存的主要目标是清除肝窦内的血液，以便观察肝窦内皮细胞（LSEC）表面结构，同时避免因高压或固定延迟造成的LSEC损伤。通过门静脉进行全肝灌注固定是肝脏固定的首选方法。如其他文献详细所述16,18，灌注必须在低压条件下进行（例如10 cm H2O），以避免与压力相关的人工假象及对LSEC的损伤，这类损伤通常表现为细胞膜上出现大范围的裂隙。然而，对于人类和动物的肝活检样本，采用针头直接灌注固定剂的方法也常能获得较为理想的固定效果，具体操作详见其他文献19。该技术包括将固定剂直接注入组织，直至血液被完全冲洗出样本，且组织变得坚实并完成固定。 由于肝脏的自溶过程极为迅速，为防止超微结构发生改变，电子显微镜样本的固定必须在血流停止后尽快进行。

我们还提出了一种图像分析方法，可最大限度减少伪影的纳入，并对窗孔结构的测量进行标准化。在显微照片中选择窦状隙的差异、对伪影的图像分析，以及对孔隙率和窗孔频率进行细胞面积测量时的方法差异，已导致已发表结果之间存在显著分歧。此前文献中尚未明确阐述对窗孔结构进行评估和测量的标准化方法，以及数据呈现所需的最低要求4,10,20-31。

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方案

注意：所有涉及动物使用的操作均根据当地法律法规进行。我们的研究已获得悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循始终确保动物福利的指导原则。 务必遵守研究所在国家关于动物实验的法律法规。

1. 透射电镜固定液制备方案

  1. 对于100 ml固定液，准备 将2 g多聚甲醛粉末加入25 ml蒸馏水中，置于锥形瓶内，加热至65 ºC，并用磁力搅拌器持续搅拌。
    注意：戊二醛、多聚甲醛和二甲胂酸钠缓冲液均为有害物质，必须始终在通风橱中操作。
  2. 65 ºC 加热 2 分钟，然后冷却。如有需要，边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，直至溶液完全澄清。
    注意：氢氧化钠具有危险性，需小心操作。
  3. 加入10 ml EM级储备液 戊二醛，50 ml 0.2 M 卡可基酸钠缓冲液和 2 g 蔗糖，用磁力搅拌器搅拌。加入 2 ml 1.0 M CaCl₂2.
  4. 用蒸馏水定容至 100 ml 前，调节 pH 至 7.4。终末固定液含有 2.5 % 戊二醛、2 % 多聚甲醛、2 mmol CaCl₂。2，0.1 M 中含 2% 蔗糖  卡可基酸盐缓冲液。确保总渗透压为440 mOsmol/L。24小时内使用。 制备方法。

2. 肝脏灌注固定

  1. 将灌注缓冲液和固定液预热至 35 - 37 ºC。排血缓冲液和固定液的正确温度有助于保持组织完整性。
  2. 通过单次腹腔注射 50 mg/kg 氯胺酮（Ketamine）和 5 mg/kg 赛拉嗪（Xylazine）对动物进行麻醉。
  3. 当动物达到深度麻醉状态（通过后肢回缩和尾部夹捏无反应来判断）后，使用钝头剪刀在动物腹部做 Y 形切口，暴露肝脏和门静脉。
    注意：确保器械清洁，以避免微生物和一般碎屑污染样本，这些污染物在扫描电镜（SEM）下会明显可见。
  4. 在门静脉上靠近肝脏和远离肝脏的位置分别绑两根非常松的缝线。
  5. 使用合适尺寸的静脉套管（大鼠用 18 G，小鼠用 22 G）插入门静脉，并收紧缝线以固定套管。
  6. 开始以 37 ºC 预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行灌注，灌注压力为 10 cm H2O。通常需要 5 至 20 ml PBS 才能将肝脏血液完全排出。
    注意：切勿让气泡通过连接套管的管道进入肝脏，因为这会导致栓塞和压力相关的假象；若灌注压力过高，会造成肝细胞、肝窦和肝窦内皮细胞（LSEC）窗孔的损伤。
  7. 切断腹部和胸腔段下腔静脉，使缓冲液可自由流出肝脏，从而防止反向高压对肝窦内皮细胞（LSECs）造成损伤。
  8. 当肝脏血液完全排净后，将 PBS 替换为电镜固定液（EM fixative），继续灌注约 5 分钟，直至肝脏变硬且颜色变得非常苍白。
  9. 停止灌注，用锋利的手术刀将固定的肝脏切成 1 - 2 mm3 的组织块。
  10. 将组织在电镜固定液中后固定 24 - 72 小时，温度保持在 4 ºC。
    注意：通常情况下，固定不足比过度固定更容易产生假象。
  11. 后固定完成后，将固定液更换为 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，并在 4 ºC 下保存。
    注意：以此方式保存的样本可在较长时间内保持良好状态（最长可达 12 个月），但为了获得最佳结果，建议尽早进行后续固定和观察。

3. 针式灌注

注意：针头固定法是一种灌注固定的变体，通过将固定剂直接注射到活检的肝组织中，使固定剂流经血管，从而清除血液并使组织块充分接触固定剂。操作时必须注意保持较低的注射压力，以避免因压力过高造成组织损伤18,19。

  1. 从动物或受试者体内取出一小块肝脏组织，用生理盐水冲洗以去除血液和碎片。
  2. 将生理盐水吸入装有细针头（通常为胰岛素注射器）的注射器中。
  3. 将生理盐水极缓慢地注入肝脏组织，直至血液完全被冲洗出。可能需要多次注射。
  4. 将电子显微镜固定液（EM fixative）吸入另一支装有细针头（通常为胰岛素注射器）的注射器中。
  5. 将固定液极缓慢地注入肝脏组织，直至组织变硬且颜色呈浅褐色。可能需要多次注射。
  6. 使用锋利的手术刀将固定的肝脏切成 1 - 2 mm3 的小块，在电子显微镜固定液中 4 °C 下孵育 24 - 72 小时。在进行二次固定前，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤三次。

4. 扫描电子显微镜样品制备

  1. 用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗样品 3 次。为固定脂质，将样品在含 2% 四氧化锇的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中后固定 2 小时。
    注意：彻底清洗非常重要，因为戊二醛与四氧化锇会发生交叉反应，并在扫描电镜（SEM）中产生伪影。
  2. 用浓度递增的乙醇冲洗样品以开始脱水。先用 50% 乙醇冲洗 5 分钟；然后用 70% 乙醇冲洗 3 次，每次 5 分钟；再用 90% 乙醇冲洗 3 次，每次 5 分钟；接着用 100% 乙醇冲洗 2 次，每次 5 分钟；最后用 100% 乙醇（分子筛处理）冲洗 2 次，每次 10 分钟。
  3. 从样品中完全去除乙醇，替换为六甲基二硅氮烷（HMDS），在通风橱中放置 10 分钟。移除组织样品中的 HMDS，并使其自然挥发。
    注意：HMDS 在低温下具有强吸湿性，因此在用于最终脱水步骤前应使其恢复至室温。
  4. 可选择立即安装样品，或将其置于干燥器中保存，待进行扫描电镜（SEM）检测时再安装。

5. 封片

注意：正确的标本制备方法将最大限度地增加在扫描电镜下可用于分析的清晰界定的窦状隙数量。

  1. 标记金属 SEM 样品台的底部，并在其顶部贴上双面导电碳胶带。
  2. 使用解剖显微镜观察样品，确定具有最佳窦状隙结构的表面用于后续扫描电镜观察。将该表面朝上放置于样品台的碳胶带表面。
  3. 将样品牢固地粘附在样品台上，样品现可进行溅射镀膜。

6. 包被

注意：在溅射镀膜仪中用一层薄导电金属（金或铂）对样品进行镀膜，可使样品接地，从而保护其免受电子束损伤。若镀层过厚，可能遮蔽感兴趣的结构。

  1. 将样本放入自动精细溅射镀膜仪的真空腔中，设置模式为旋转并自动溅射镀膜45秒。使用铂金镀膜可获得更精细的细节，但金也适用。
  2. 在固定好的肝组织样本的外表面涂上一层薄薄的导电碳漆，注意避免涂覆到窦状面。
  3. 待样本完成铂镀膜且碳漆完全干燥后，即可用于扫描电子显微镜观察。样品可保存在干燥器中。

7. 使用扫描电子显微镜

  1. 将样品放入扫描电子显微镜中，并使显微镜恢复真空状态。
  2. 按照标准显微镜操作程序，从低倍率开始观察样品，逐步提高放大倍数。
  3. 确保显微镜的工作距离、束斑大小和像散已适当调节。
  4. 检查固定完整性。若肝窦内皮细胞（LSEC）基本无裂隙，且含有直径为 30 - 250 nm 的窗孔结构，通常表明样品制备成功。
  5. 若肝窦存在大量裂隙或缺乏窗孔结构，则表明样品制备失败或存在显著病理改变。此时，应使用极细的剃须刀片对样品进行切片，重新镀膜后对切面进行分析，以寻找成功固定的肝窦区域。
  6. 在约 15,000 - 20,000 × 放大倍数下，选择无碎片污染、固定良好且窗孔清晰可见的平坦LSEC表面（通常应包含至少10个窗孔）。
  7. 每例肝脏样本应至少采集10个肝窦的图像，取自不同组织块的不同区域，每例肝脏至少使用两个组织块。每只动物采集10张15,000 - 20,000 × 放大倍数的显微照片，通常足以代表整个肝脏的窗孔定量分析。

8. 分析

注意：使用可从美国国立卫生研究院（NIH）免费下载的 ImageJ 软件来量化窗孔直径和频率（www.imagej.nih.gov/ij）。

  1. 打开 ImageJ 软件，并使用图像中嵌入的比例尺设置比例（截图 1）。
  2. 在 ImageJ 中使用多边形工具，围绕 LSEC 的整个平坦区域进行描记，包括有孔区和无孔区。不要仅描记筛板区域，否则会导致孔隙率被错误地高估。排除细胞表面可能遮挡孔洞的任何大块碎片。
  3. 测量孔径时，选择直线工具，穿过每个孔洞的最长直径画一条线，按“m”键测量该线段，再按“d”键（draw）将该线永久绘制在图像上。此线段定义为孔径。线段长度将显示在 ImageJ 的结果窗口中（截图 2）。
  4. 测量 LSEC 胞质中所有大于 250 nm 的较大孔洞，包括真正的孔洞和间隙。间隙通常是由于灌注或固定不良导致的人工假象，但也可能由疾病或毒性引起。在后续分析中，间隙的数据将不纳入孔洞参数的计算。
  5. 对于非圆形的间隙，应通过在 ImageJ 中围绕间隙描记轮廓并计算其面积来确定面积。
  6. 将 ImageJ 结果窗口中的数据复制粘贴到 Excel 电子表格中，用于进一步分析。

9. 计算

  1. 平均窗孔直径 = 所有窗孔直径的平均值（不包括间隙，间隙定义为 ≥ 250 nm）。
  2. 窗孔面积 = πr2, 其中半径 r 由各个窗孔直径计算得出（r = d/2），不包括间隙。
  3. 孔隙率（%）= [Σ(πr2) /（分析的总面积 - Σ（间隙面积  =）(µm2))] × 100。
  4. 窗孔频率 = 窗孔总数 /（分析的总面积 - Σ（间隙面积）(µm2）。

10. 窗孔数据的展示

注意：在可能的情况下，包含窗孔量化数据的出版物应包括以下信息

  1. 窗孔直径，并说明用于定义窗孔的边界直径范围（通常为 50 - 250 nm）、窗孔频率（个/µm2）和孔隙率（%）。
  2. 需说明分析中是否包含间隙；应提供窗孔直径的频率分布图，并注明纳入分析的肝脏数量、组织块数量、图像数量及窗孔数量。

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结果

通过扫描电子显微镜在低倍率下进行初步观察，可见肝脏标本表面平坦，暴露区域足够大，可观察到许多较大的肝血管和肝窦（图1A）。为获得清晰的肝窦图像，必须确保肝脏组织块在载样 stub 上的正确放置，因此应避免观察到肝格利森囊（Glisson’s capsule）（图1B）。提高放大倍数后，可更细致地观察肝脏密集的血管系统，并显示出分隔血管的单层肝细胞板（图1C）。肝脏固定不良会导致图像质量下降，血细胞和碎片会遮挡肝脏结构的观察（图1D）。

进一步增加放大倍数可观察到肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构（图 2A）。正确识别肝窦结构至关重要——在某些情况下，肝细胞板可能看似血管，但诸如胆小管等结构特征有助于定位判断（图 2B）。过高的灌注压力可能导致内皮层出现大间隙等假象，这被认为是LSEC筛板融合所致。此类假象在扫描电镜（SEM）下易于识别（图 2C）。...

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讨论

准确且可重复地测量肝窦内皮细胞状态的能力是理解这些高度特化细胞生物学的重要一步。新兴技术如结构照明显微镜32，原子力显微镜33 以及 d-STORM（直接随机光学重建显微镜） 34 将提供有关这些细胞形态的重要信息 体外 但扫描电镜（SEM）仍是观察和测量其结构的主要方法 原位.

最关键的且技术上最具挑战性的步骤是初始固定：如果肝脏保存良好，后续步骤将产生易于观察且确实美观的肝窦图像。全肝灌注是确保良好固定的最有效方法，但在快速且低压条件下固定的针式灌注样本也可获得相当的结果。脱水肝脏样本吸收水分是导致扫描电镜图像质量差的另一个常见原因，但通过将样本正确储存在含有干燥剂的干燥器中，这一问题可轻易避免。

有必要对窗孔结构的定量方法进行标准化，以便能够比较和解读不同研究团队的研究结果。过去发表的数值存在较大差异，且关于这些数值获取方法的细节信息极少。本文提供了一种标准化的方法，用于确定和呈现描述窗孔超微结构的参数值。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25% 电子显微镜级戊二醛ProSciTechC001将储备液保存于 -20 °C，直至使用；避免反复冻融
多聚甲醛粉末Sigma Aldrich158127每次均需新鲜配制多聚甲醛
二甲胂酸钠粉末Sigma AldrichC0250配制 0.2 M 储存液，pH 7.4，将粉末溶于 dH₂O 中2O，通常以0.1 M浓度使用，通过1:2稀释制备
氯化钙Sigma AldrichC1016通过将粉末溶于dH₂O中配制1 M CaCl₂2O
四氧化锇ProSciTechC011使用前用弱酸清洗安瓿瓶，以避免污染。在玻璃瓶中配制2%的储备液
乙醇- 绝对Sigma Aldrich459836 100% 乙醇必须为高纯度，并与分子筛一同储存
其他等级的乙醇实验室技术EL5用dH₂O配制梯度乙醇2O
六甲基二硅氮烷Sigma Aldrich52619 使用前需恢复至室温
套管针TerumoTSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C18 G 适用于大多数大鼠，22 G 适用于大多数小鼠，但最好备用几根 24 G 针头，以应对体型非常小的小鼠
导电碳带ProSciTechIA0201
碳导电银浆ProSciTechI003
氯胺酮必须在许可下获取
赛拉嗪必须在许可下获取
分子筛Sigma Aldrich208647从100%乙醇中去除水分

参考文献

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478(2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).

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