缺血-再灌注（IR）损伤与较高的发病率和死亡率相关。本研究的目的是 体外 此处描述的氧糖剥夺与复氧（OGD-R）模型用于评估缺血再灌注损伤对多种细胞的影响，尤其是血脑屏障（BBB）内皮细胞。
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摘要
摘要
缺血-再灌注（IR）损伤被认为是导致缺血性卒中相关发病率和死亡率的重要因素。缺血性脑血管意外占所有卒中病例的80%。IR损伤的常见原因是血液、营养物质和氧气对组织的急性或慢性阻塞后，再灌注时液体迅速流入，触发自由基的形成。
缺血性脑卒中后常伴随血脑屏障（BBB）功能障碍和血管源性脑水肿。从结构上看，内皮细胞之间的紧密连接（TJs）在维持血脑屏障（BBB）完整性中起着重要作用。缺血再灌注（IR）损伤是一种早期继发性损伤，可引发非特异性的炎症反应。炎症后产生的氧化应激和代谢应激会触发继发性脑损伤，包括血脑屏障通透性增加以及紧密连接（TJ）完整性的破坏。
本方案介绍了一种 体外 大鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺与复氧（OGD-R）对紧密连接完整性和应力纤维形成的示例。目前，已有多种实验方法 体内 模型被用于研究缺血再灌注（IR）损伤的影响；然而，这些模型存在若干局限性，例如手术操作的技术难度、基因依赖性的分子影响以及机制关系研究的困难。然而， 体外 模型可能有助于克服这些局限性中的许多问题。本方案可用于研究各种分子机制及机制间的相互关系，从而提供潜在的治疗策略。然而，这些结果的 体外 研究可能与标准不同 体内 研究应谨慎解读。
引言
缺血-再灌注（IR）损伤被认为是与中风、心肌梗死、创伤、外周血管疾病和创伤性脑损伤相关的多种致残性并发症和死亡的常见原因1,2。脑血管中的缺血-再灌注损伤是一种早期继发性损伤，可导致炎症和水肿3。炎症后由氧化应激和代谢应激引起的一种严重并发症是稳态失衡，进而导致自由基生成、血脑屏障（BBB）紧密连接（TJs）的改变以及微血管通透性的增加4,5。
目前，用于研究缺血再灌注（IR）损伤对血脑屏障（BBB）影响的体内模型包括大脑中动脉闭塞（MCAO）、微栓塞以及转基因或基因敲除动物模型。然而，如Hossmann6所述，这些模型各自存在技术上的缺陷和局限性。MCAO模型常用于研究氧化还原应激、BBB连接通讯的变化以及脑组织与免疫细胞之间的相互作用，但其实验操作面临多种技术挑战，例如需要精确的显微外科手术及其相关操作难度。微栓塞模型可瞬时破坏BBB，而使用转基因或基因敲除动物研究脑缺血时，可能面临基因依赖性分子效应对 梗死形成的影响、血管解剖结构改变以及个体体重差异等挑战6。因此，近年来体外缺血模型受到越来越多关注，主要因其适用于开展药物作用机制的研究。然而，体外研究的结果可能无法完全代表体内情况，解释时需谨慎对待6。
Ogawa7已研究了低氧浓度对内皮细胞单层及微血管通透性的拮抗作用。本研究采用大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）构建体外血脑屏障（in vitro BBB）模型。本方案中所采用的氧糖剥夺与再复氧（OGD-R）技术，借鉴自Zulueta et al 和 Zhu et al8,9的研究。我们将脑内皮细胞置于含0% O2、5% CO2 和95% N2的低氧/无氧环境中，以实施OGD-R处理。随后分别通过免疫荧光定位和罗丹明-鬼笔环肽（rhodamine phalloidin）标记法，评估紧密连接（TJ）完整性的变化及应力纤维的形成情况。通过针对闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）的免疫荧光染色来判断TJ完整性，因为ZO-1是一种重要的支架性膜结合紧密连接蛋白。罗丹明-鬼笔环肽标记用于检测细胞骨架中的丝状肌动蛋白（f-actin），是内皮细胞中肌动蛋白应力纤维形成的明确指标。
本方法的目标是为建立氧糖剥夺-复氧（OGD-R）模型提供参考 体外 用于研究血脑屏障内皮细胞紧密连接完整性和F-肌动蛋白应力纤维形成的IR模型。该结果将提供关于氧糖剥夺-再灌注（OGD-R）后紧密连接蛋白ZO-1及应力纤维形成变化的信息。阐明这些关系将有助于揭示OGD-R后被激活的潜在分子机制，并为开发减轻OGD-R治疗后血脑屏障损伤的潜在治疗策略提供依据。
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方案
1. 内皮细胞的接种
- 从成年 Sprague Dawley 大鼠中获取脑微血管内皮细胞（RBMEC）的原代培养物（或从商业来源获取）。
- 将 RBMEC 培养于经纤维连接蛋白（50 µg/ml）包被的 100 cm 培养皿中，使用大鼠脑微血管内皮细胞生长培养基。每两天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。
- 当细胞达到 80–90% 汇合度时，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻旋转洗涤细胞。随后将细胞暴露于 1 ml 预热至 37 °C 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中使其脱离。
- 在 37 °C 下孵育 2–5 分钟 ，直至细胞完全脱离并分散。
注意：轻敲培养皿以促进细胞脱落。在显微镜下观察细胞，确认细胞已完全从皿表面脱离。 - 向培养皿中加入 5 ml 完全培养基以中和胰蛋白酶。用移液器吸取含有脱落细胞的培养基，并收集至 15 ml 离心管中。
- 将含有内皮细胞的培养基在 220 × g 条件下离心 5 分钟。
- 吸除上清液，保留含有细胞的沉淀。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于 3–5 ml 新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞生长培养基中。随后使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。
- 将细胞悬液转移至经纤维连接蛋白（50 μg/ml）预包被的 8 孔无菌腔室载玻片系统中（每孔 0.7 cm2），接种密度为每孔 10,000–15,000 个细胞。将细胞在 37 °C 下培养至完全汇合。
注意：如需进行 Western 印迹或其他实验，可根据实验要求将细胞培养于 10 cm 细胞培养皿或特定规格的培养器皿中。
2. 氧糖剥夺-复氧 体外 模型
注：以下实验方案改编自 Zulueta et al. 1997；Zhu H et al. 20128,9。
- 使用缺氧细胞培养系统研究氧糖剥夺-复氧（OGD-R）对脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响（见图1）。根据制造商说明书，在实验开始前安装并校准缺氧细胞培养系统。
- 从37 °C培养箱中取出已融合的腔室载玻片（步骤1.8）。将腔室载玻片中的完全培养基更换为脱氧、无葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并置于含95% N2 和5% CO2 的缺氧室中，在37 °C下孵育2小时 ，以模拟氧糖剥夺（OGD）条件。
- 将细胞转移回含95% O2、5% CO2 的37 °C培养箱中 ，加入新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞完全培养基，在37 °C下继续培养1小时。
注意：此步骤模拟复氧状态。 - 使用腔室载玻片进行免疫荧光定位及罗丹明-鬼笔环肽标记（见第3节）。
3. 使用罗丹明鬼笔环肽对ZO-1和f-肌动蛋白进行免疫荧光定位标记
- 将含有RBMEC单层的腔室载玻片暴露于每孔100 μl的Opti-MEM/低血清培养基中，孵育1小时。用100 μl磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0–7.2）洗涤腔室载玻片3次。
- 使用100 μl含4%多聚甲醛的PBS（pH 7.0–7.2）固定细胞，孵育15分钟，随后再用PBS（pH 7.0–7.2）洗涤腔室载玻片3次。
- 使用100 μl含0.5% Triton X-100的PBS（pH 7.0–7.2）对细胞进行通透处理，孵育15分钟。随后加入100 μl含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，室温封闭1小时。此步骤后，可选择对ZO-1或f-肌动蛋白进行染色/标记。
- 进行免疫荧光染色时，将细胞与抗ZO-1的兔源一抗（按1:150比例溶于2% BSA-PBS）在4 °C孵育过夜。用PBS（pH 7.0–7.2）洗涤细胞3次。随后加入100 μl异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗兔二抗，室温孵育1小时。
- 进行罗丹明鬼笔环肽标记时，在封闭后，将细胞与100 μl罗丹明鬼笔环肽（按1:50比例溶于2% BSA-PBS）在室温孵育20分钟。
- 用PBS（pH 7.0–7.2）洗涤经免疫荧光染色和罗丹明鬼笔环肽标记的细胞。使用含抗荧光淬灭剂并含DAPI的封片剂封片。
- 使用60倍水浸物镜，在共聚焦显微镜下以单个光学切面扫描并观察细胞。
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结果
在预先包被纤维连接蛋白的Nunc II培养板中培养的细胞，通过置于Biospherix ProOx 110型厌氧 chamber 中进行氧糖剥夺-复氧（OGD-R）处理。完成OGD-R处理后，采用免疫荧光技术对细胞进行ZO-1连接蛋白染色，如图所示 图2 以及使用罗丹明鬼笔环肽染色标记显示F-肌动蛋白应力纤维形成的细胞骨架组装情况，如图所示 图3对照细胞未经历氧糖剥夺-复氧（OGD-R）处理，其紧密连接保持完整；而经历OGD-R处理的内皮细胞则显示出连接不连续，提示紧密连接完整性丧失 图2未接受氧糖剥夺-复氧（OGD-R）处理的对照细胞未出现或仅出现极轻微的 f-肌动蛋白应力纤维形成，而经历氧糖剥夺-复氧（OGD-R）的内皮细胞表现出增加的 f-肌动蛋白应力纤维的形成，表明肌动蛋白细胞骨架组装的变化 图3；转载自参考文献#13，已获许可
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讨论
OGD-R作为一种 体外 缺血-再灌注损伤的神经元研究模型已得到充分建立10,11也有研究显示氧糖剥夺（OGD）对脑微血管内皮细胞的影响，以及其对通透性和紧密连接完整性的改变9然而，我们的研究展示了氧糖剥夺以及再氧合的影响，这更接近于缺血再灌注损伤的情况 体内 缺血性卒中后发生的状况。
已知缺氧-缺血条件可诱导中枢神经系统发生炎症反应，通过增加细胞旁通透性和血管源性水肿，导致血脑屏障（BBB）破坏4。再灌注损伤是一个极为复杂且动态的过程，其特征包括过量的活性氧物质产生、ATP 耗竭、细胞外钾离子浓度升高、兴奋性神经递质释放、内皮细胞和神经元肿胀以及免疫细胞活化。这些变化进一步激活多种炎症通路，导致细胞因子生成、核酸酶和蛋白酶被诱导，从而引发水肿；上述所有过程均被证实可激活多种半胱天冬酶（caspases），最终破坏血脑屏障的完整性5,12。由于内皮细胞含有大量线粒体，因此特别容易受到缺血性损伤。相邻的内皮细胞之间通过紧密连接相互连接，而这些紧密连接由紧密连接蛋...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢斯科特与怀特医院研究资助项目提供的经费支持以及德克萨斯A&感谢#38;M健康科学中心医学院整合成像实验室提供共聚焦激光显微镜的使用支持。感谢Glen Cryer先生在稿件编辑方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Proox 型号 110 | Biospherix | 型号 110 | |
| 无葡萄糖 DMEM | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 兔多克隆抗体 | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌玻璃 载片 | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC 标记的抗兔二抗 | Santa cruz | sc-2090 | |
| 1× DPBS | Thermo scientific | SH 30028.03 | 可使用其他任意可用的 PBS |
参考文献
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重印与许可
