从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

摘要

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。

摘要

无论是研究针对中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病（例如实验性自身免疫性脑脊髓炎，EAE，1），还是研究对中枢神经系统感染（例如脊髓灰质炎、莱姆神经伯氏疏螺旋体病或神经性梅毒）的免疫反应，通常都需要分离浸润到中枢神经系统的免疫细胞。

在本视频方案中，我们演示如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的大鼠中枢神经系统（CNS）中分离单个核细胞（MNCs）。该操作的第一步是用生理盐水对啮齿动物进行心脏灌注，以确保灌注中枢神经系统的血管中无残留血液。任何血液污染都会人为地增加表观CNS浸润MNCs的数量，并可能改变免疫细胞浸润群的表观组成。随后，我们演示如何取出大鼠的脑和脊髓，进行后续的机械性破碎，以制备单细胞悬液。该悬液通过两层Percoll密度梯度离心法分离以获取MNCs。经洗涤后，这些细胞即可用于后续所需的任何实验操作。

通过该方法分离的单个核细胞具有活性，可用于电生理学、流式细胞术（FACS）或生物化学实验。若在无菌条件下操作（使用无菌器械并在组织培养罩内进行），这些细胞也可在组织培养基中进行培养。特定的细胞群体可进一步通过磁性分离方法或流式细胞术进行纯化。

方案

1. 深度麻醉大鼠。用70%乙醇喷洒，并通过左心室灌注PBS 10分钟以清除血管中的细胞（剪开右心房，从左心室进行灌注）。
2. 取出脑和脊髓，置于含有冰上预冷PBS的50 ml离心管中。将脑和脊髓组织置于放置在含10 ml冰上预冷PBS的10 cm培养皿中的70 mm细胞筛网上，使用无菌1 ml注射器活塞背面将每块组织压过细胞筛网。将获得的单细胞悬液收集至冰上预冷的50 ml离心管中。用PBS冲洗细胞筛网，并将冲洗液加入离心管中，直至溶液澄清。
3. 以390 g离心8–10分钟。
4. 将细胞重悬于20 ml PBS + 30% Percoll溶液中，然后铺在10 ml PBS + 70% Percoll溶液之上。
5. 室温下以390 g离心20分钟。
6. 去除管顶的脂肪层。收集界面处的细胞，用PBS洗涤两次，计数。

讨论

该操作步骤以及所有涉及活体动物的操作步骤，均须获得您所在机构的动物使用与护理委员会的批准。我们建议在首次进行心脏灌注时，应有兽医或兽医技术人员在场，以确保动物在操作前和操作过程中接受足够水平的麻醉，并确保动物不会遭受不必要的疼痛或痛苦。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS，1×，无菌	试剂	GIBCO, by Life Technologies	14190-250
细胞滤网，70 µm	工具	Fisher Scientific	08-771-2
Percoll	试剂	Sigma-Aldrich	P1644