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方法文章

高分辨率红外热成像技术（HRIT）在植物冰核形成与冰晶传播研究中的应用

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DOI：

10.3791/52703

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2015年5月8日

 ,  , 
1U.S Department of Agriculture, Agricultural Research Service (USDA-ARS), Kearneysville, WV, 2Institute of Botany, University of Innsbruck, 3Department of Plant Science, University of Saskatechewan

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用高分辨率红外热成像技术（HRIT）来观察植物中冰晶形成位点及冰晶传播路径的实验方案。

摘要

当植物处于活跃生长期时发生的霜冻事件可能是致命的，特别是对于缺乏耐冻性的植物而言。这类霜冻事件常常对农业生产造成毁灭性影响，同时也在自然植物种群的群落结构形成中发挥重要作用，尤其是在高山、亚北极和北极生态系统中。因此，更深入地理解植物中的结冰过程，对于研发防霜技术以及阐明避冻机制具有重要意义。本文描述了一种利用高分辨率红外热成像技术（HRIT）可视化植物结冰过程的实验方案。该技术的使用可帮助确定植物中冰晶形成的主要位点、冰的传播方式以及冰屏障的存在。此外，它还可用于研究外源性和内源性冰核在决定植物结冰温度方面的作用，并评估各种化合物是否能够影响结冰过程或提高耐冻性。利用HRIT技术，可以直观呈现植物在进化过程中形成的多种适应性特征，这些特征直接或间接地影响结冰过程，最终使植物能够存活于霜冻事件中。

引言

当植物处于活跃生长期时，遭遇冰点温度可能是致命的，特别是对于那些抗冻能力极低或完全缺乏抗冻性的植物而言。此类霜冻事件通常会对农业生产造成毁灭性影响，同时也会在自然植物种群的群落结构形成中发挥重要作用，尤其是在高山、亚北极和北极生态系统中1-6。近年来，严重的春季霜冻对美国和南美洲的果树生产造成了重大影响7-9，而这种影响因异常早来的暖冬天气随后又出现接近常年平均的低温而加剧。早期的温暖天气促使芽体萌发，启动新生枝条、叶片和花朵的生长，而这些新生组织几乎不具备抗霜冻能力1,3,10-12。此类不稳定的天气模式被认为是当前气候变化的直接体现，并预计在可预见的未来将成为一种常见的气候现象13。尽管人们已努力开发经济、有效且环境友好的管理技术或农用化学品以提高植物的抗冻能力，但由于多种原因，这些尝试收效甚微，部分原因在于植物的抗冻机制和避冻机制本身具有高度复杂性14。

植物与霜冻存活相关的适应机制传统上分为两类：耐冻性和避冻性。前者与由特定基因调控的生化机制相关，使植物能够耐受组织中冰晶存在及其脱水效应所带来的胁迫。而后者通常（但不仅限于）与植物的结构特征相关，这些特征决定了冰晶在植物体内是否形成、何时形成以及在何处形成14。尽管避冻性作为一种适应机制十分普遍，但近年来针对其潜在机制及调控过程的研究仍十分有限。有关该主题的更多细节，读者可参考最近的一篇综述15。

尽管在低温下结冰看似是一个简单的过程，但许多因素共同决定了植物组织中冰核形成的温度以及冰在植物体内的扩展方式。这些因素包括外源性和内源性冰核物质的存在、异质性与均质性成核事件、热滞（抗冻）蛋白、特定糖类及其他渗透调节物质的存在，以及植物的多种结构特征，均在植物冻结过程中发挥重要作用。总体而言，这些参数影响着植物的冻结温度、冰的起始位置及其生长方式，还可能影响所形成冰晶的形态。在实验室条件下，已有多种方法被用于研究植物的冻结过程，包括核磁共振波谱法（NMR）16、磁共振成像（MRI）17、冷冻显微技术18-19以及低温扫描电子显微镜（LTSEM）20。然而，在实验室和田间条件下对整株植物的冻结过程监测，主要仍依赖热电偶。利用热电偶研究冻结过程的原理是水从液态转变为固态时会释放热量（熔化焓），因此冻结过程表现为一个放热事件21-23。尽管热电偶是研究植物冻结的常用方法，但其应用存在诸多局限性，限制了在冻结事件中所能获取的信息量。例如，使用热电偶几乎难以确定冰在植物中的起始位置、传播方式、传播速度是否均匀，以及某些组织是否保持无冰状态。

然而，高分辨率红外热成像技术（HRIT）的进步24-27显著提高了获取整株植物冻结过程信息的能力，尤其是在采用差分成像模式时效果更为显著28-33。在本报告中，我们描述了利用该技术研究植物中冰晶形成的位置及起始温度等冻结过程的多个方面及相关影响参数。本文将提供一项实验方案，用于展示冰核活性细菌Pseudomonas syringae（Cit-7）作为外源性冰核因子，可在较高的亚零温度下诱导草本植物发生冻结的能力。

高分辨率红外相机

本报告中记录的实验方案及示例采用了一台高分辨率红外视频辐射计。该辐射计（图1) 提供红外光谱和可见光谱图像以及温度数据。该相机的光谱响应范围为7.5至13.5 µm，分辨率为640 x 480像素。内置相机生成的可见光图像可与红外图像实时融合，有助于解释复杂的热图像。可使用多种相机镜头进行特写和显微观察。该相机既可独立使用，也可通过专用软件与笔记本电脑连接并受其控制。该软件可用于提取记录视频中包含的多种热数据。需要注意的是，市面上有多种不同类型的红外辐射计可供选择。因此，研究人员必须就其预期应用与熟悉产品的工程师进行沟通，并测试所选辐射计是否能够提供所需信息。本方案中使用的成像辐射计置于一个丙烯酸盒内图2） 用聚苯乙烯泡沫隔热 i为防止在升温和降温过程中暴露于冷凝环境。并非所有相机或应用都需要此保护措施。

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方案

1. 植物材料的准备

  1. 使用供试植物材料（Hosta spp. 或 Phaseolus vulgaris）的叶片或整株植物。

2. 含冰核活性（INA）细菌的水溶液的制备

  1. 在25 °C条件下，将INA细菌Pseudomonas syringae（菌株Cit-7）接种于培养皿中，使用按厂家说明添加了10 g/L 100%甘油的假单胞菌琼脂F培养基进行培养。
  2. 待菌落充分生长后，置于4 °C保存备用；为确保较高的冰核活性，需在使用前于4 °C持续保存两天。
  3. 使用塑料、一次性或可重复使用的金属刮铲，在使用时从单个平板的琼脂表面刮取细菌，并将其放入装有10–15 ml去离子水的25 ml一次性比色皿中。细菌浓度应在1 × 107 至 1 × 109 · ml-1 范围内。溶液将呈现浑浊状态。无需使用血细胞计数板或分光光度计精确测定浓度，因浓度仅需大致准确即可。
  4. 将比色皿涡旋振荡至少10秒，以充分分散细菌。
    注意：所得INA菌悬液的具体浓度并不关键，上述操作步骤所提供的冰核活性已完全足够。此INA细菌与水的混合液将在后续的冰核实验中使用。

3. 设置冷冻实验

  1. 将高分辨率红外相机（SC-660）放入防护丙烯酸箱内，使镜头从前端开口伸出，连接相机与笔记本电脑或记录设备的线缆从箱体后端开口引出。固定箱盖，并将该箱体置于环境培养箱或冷冻柜内，放置位置应确保能够观察到待测植物材料。
    1. 在成像室壁上衬以黑色建筑纸，为植物材料提供暗色背景，以防止反射的红外能量造成干扰。
    2. 使用LED照明装置装配培养室，以在需要记录可见光波长图像时将光源产生的热量降至最低。仅需最低限度的照明，例如电池供电的壁橱灯或其他小型LED设备，即可使植物被相机清晰可见。
      1. 拍摄完植物材料的可见图像后，关闭LED照明。通过暗箱上的端口或其他开口，将所有外部有线连接（如火线接口连接至计算机、电源线等）引出至相机。
    3. 用隔热泡沫材料填充端口或开口中的任何多余空间，以避免或减少腔室内的温度梯度。将腔室的初始温度设置为 1 °C。
  2. 将植物或植物部分摆放整齐，使植物材料位于相机视野范围内，并确保植物材料在远程观察屏幕或所选软件中清晰可见。
  3. 让植物材料在1 °C下平衡30分钟至1小时，具体时间根据植物材料的大小而定，然后再开始进行控制性冷冻实验。这可确保在冷冻实验开始后，植物材料的温度不会比空气温度滞后数度。当植物材料的温度与空气温度相差在0.5 °C以内时，即达到平衡。
    1. 在使用盆栽植物时，于盆土表面覆盖一层聚苯乙烯泡沫隔热材料。待植物达到平衡状态后，开始对培养室进行降温。
      注意：花盆中土壤表面的隔热层可减少花盆向植物周围空气中持续散失的热量，防止根部结冰；在自然霜冻事件中，由于土壤中存在大量的残余热量储备，根部通常不会冻结。
  4. 设置所需的相机参数（调色板、温度范围、特定兴趣区域， 等。），如3.4.1-3.4.4节所述。
    1. 选择彩虹色板以在查看实时图像时显示温度变化。
    2. 通过调节软件中图像下方的温度条，将温度范围设置为 5 °C。
    3. 选择线性标度（算法），以根据选定的调色板（彩虹）将红外数据转换为伪彩色图像，并将温度范围设置为5 °C，同时基于图像自动跟踪温度范围。或者，在实验过程中可手动调整设定的温度范围。
      1. 使用软件提供的感兴趣区域内特定点的温度或该区域的平均温度。从记录的视频序列或图像文件中嵌入的信息提取所有像素的温度数据。 图3 显示 ResearchIR 软件内的典型截图。
    4. 在植物组织上选择一个代表特定兴趣点的位置放置光标。将感兴趣区域定义为点（1-3像素大小）、方框、线条、椭圆或圆形。可在图像上设置多个点或形状的组合。
  5. 录制视频序列
    1. 将相机设置为以60 Hz的频率进行录制，并手动停止录制。
    2. 指明录制的视频文件将保存在计算机或外部驱动器上的位置。
    3. 开始记录。
      注意：由于将生成较大的视频文件，强烈建议将数据记录到外接硬盘中。录制的视频文件后续可进行编辑，仅保留包含必要信息的部分，这将显著减小文件大小。
    4. 逐步将腔室温度降低0.5–1.0 °C。待植物温度与空气温度达到平衡后，再次降低0.5–1.0 °C。根据所观察植物组织的质量及其形态，平衡过程可能需要10至15分钟，因此冷却速率约为4 °C/小时。
    5. 以相同方式继续，直至植物完全冻结且观察完成。当冻结过程结束后，停止记录。
      注意：当植物材料与背景颜色相同时，表明植物组织已与空气温度达到平衡，因为二者处于相同的温度。由于背景温度与植物组织温度相同，此时可能难以观察到植物材料，直至再次降低温度，使植物组织与空气温度之间产生温差。

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结果

冰核活性细菌Pseudomonas syringae（菌株Cit-7）的冰核活性

在玉簪叶（Hosta spp.）的下表面分别放置一滴10 µl的纯水和一滴含有P. syringae（Cit-7）的10 µl水溶液（图4）。如图所示，含有INA细菌的水滴首先结冰，并引发叶片组织冻结，而叶片表面的纯水滴仍保持液态。

木本植物中冰冻与冰晶传播

图5 展示了橡树（Quercus robur）茎中冰晶的成核与扩展过程。冰的形成始于茎的维管形成层/韧皮部区域，并沿茎的周向扩展。在木本植物茎中，冰的扩展速率在纵向远高于横向和周向。31

冰晶传播速率及冰晶传播屏障

在菜豆植株（P. vulgaris）茎部接...

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讨论

水能够在远低于0 °C的温度下发生过冷，而水的冻结温度具有较大的可变性。36 纯水过冷的温度极限约为-40 °C，该温度被称为均质成核点。当水在高于-40 °C的温度下结冰时，是由于存在异质成核剂，这些成核剂可促使微小冰胚的形成，进而催化冰晶的生成与生长。37 自然界中存在多种高效的冰核形成分子，因此自然界中大多数水的冻结发生在略低于0 °C的温度。调控或影响异质成核剂活性的能力，为植物防霜冻提供了一种全新的潜在策略。理解冰在冻敏感植物和耐冻植物中如何形成并扩展，是实现这一目标的关键。

如引言所述，已有多种方法被用于在实验室条件下研究植物的结冰过程，然而，自然界中植物的结冰过程主要通过热电偶进行监测。高分辨率红外热成像技术（HRIT）24-28,34 在研究植物结冰过程方面具有若干显著优势。HRIT 能够使研究者观察到冰晶形成的初始位点、冻结整株植物所需的结冰事件次数，实际观测冰在植物体内的传播方式以及是否存在阻碍冰传播的屏障，并确定植物的某些部位是否保持无冰状态。最重要的是，该技术使研究者能够在整株植物上观察结冰过...

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披露

作者无竞争性财务利益或利益冲突。

致谢

本研究由奥地利科学基金（FWF）：P23681-B16 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
红外相机FLIRSC-660根据应用需求有多种型号可供选择
红外分析软件FLIRResearchIR 4.10.2.53,500 美元
丁香假单胞菌（Cit-7 菌株）由加利福尼亚大学伯克利分校 Steven Lindow 博士惠赠，icelab@berkeley.edu 
假单胞菌琼脂 F菲舍尔科技公司DF0448-17-1

参考文献

  1. Taschler, D., Beikircher, B., Neuner, G. Frost resistance and ice nucleation in leaves of five woody timberline species measured in situ during shoot expansion. Tree Physiol. 24, 331-337 (2004).
  2. Neuner, G., Hacker, J. Ice formation and propagation in alpine plants. Plants in alpine regions: Cell Physiology of adaptation and survival strategies. Lütz, C. , Springer. 163-174 (2012).
  3. Ladinig, U., Hacker, J., Neuner, G., Wagner, J. How endangered is sexual reproduction of high-mountain plants by summer frosts? - Frost resistance, frequency of frost events and risk assessment. Oecologia. 171, 743-760 (2013).
  4. Wisniewski, M. E., Gusta, L. V., Fuller, M. P., Karlson, D. Ice nucleation, propagation and deep supercooling: the lost tribes of freezing studies. Plant Cold Hardiness: from the laboratory to the field. Gusta, L. V., Wisniewski, M. E., Tanino, K. K. , CAB International. 1-11 (2009).
  5. Bokhurst, S., Bjerke, J. W., Davey, M. P., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Laine, K., Callaghan, T. V., Phoenix, G. K. Impacts of extreme winter warming events on plant physiology in a sub-Arctic heath community. Physiol. Plant. 140, 128-140 (2010).
  6. Taulavuori, K., Laine, K., Taulavuori, E. Experimental studies on Vaccinium myrtillus.and Vaccinium vits-idea.in relation to air pollution and global change at northern high latitudes: A review. Env. Exp. Bot. 87, 191-196 (2013).
  7. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Gusta, L., Fuller, M. Using infrared thermography to study freezing in plants. HortScience. 43, 1648-1651 (2008).
  8. Gu, L., et al. The 2007 eastern US spring freeze: increased cold damage in a warming world. BioScience. 58, 253-262 (2008).
  9. Augspurger, C. K. Spring warmth and frost: phenology, damage, and refoliation in a temperate deciduous forest. Func. Ecol. 23, Spring. 1031-1039 (2007).
  10. Neuner, G., Erler, A., Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J. Frost resistance of reproductive tissues in various reproductive stages of high alpine plant species. Physiol. Plant. 147, 88-100 (2013).
  11. Skre, O., Taulavuori, K., Taulavuori, E., Nilsne, J., Igeland, B., Laine, K. The importance of hardening and winter temperature for growth in mountain birch populations. Env. Exp. Bot. 62, 254-266 (2008).
  12. Hänninen, H., Tanino, K. Tree seasonality in a warming climate. Trends in Plant Science. 16, 412-416 (2011).
  13. Katz, R. W., Brown, B. G. Extreme events in a changing climate: variability is more important than averages. Climate Change. 21, 289-302 (1992).
  14. Wisniewski, M., Gusta, L. Understanding plant cold hardiness: an opinion. Physiol. Plant. 147, 4-14 (2013).
  15. Wisniewski, M., Gusta, L., Neuner, G. Adaptive mechanisms of freeze avoidance in plants. A brief update. Env. Exp. Bot. 99, 133-140 (2014).
  16. Burke, M. J., Gusta, L. V., Quamme, H. A., Weiser, C. J., Li, P. H. Freezing and injury in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 27, 507-528 (1976).
  17. Ishikawa, M., Price, W. S., Ide, H., Arata, Y. Visualization of freezing behaviors in leaf and flower buds of full-moon maple by nuclear magnetic resonance microscopy. Plant Physiol. 115 (4), 1515-1524 (1997).
  18. Ishikawa, M., Sakai, A. Characteristics of freezing avoidance in comparison with freezing tolerance: a demonstration of extra-organ freezing. Plant cold hardiness and freezing stress. Li, P. H., Sakai, A. , Academic Press. 325-340 (1982).
  19. Buchner, O., Neuner, G. Freezing cytorrhysis and critical temperature thresholds for photosystem II in the peat moss Sphagnum capillifolium. Protoplasma. 243 (1), 63-71 (2010).
  20. Pearce, R. S. Extracellular ice and cell shape in frost-stressed cereal leaves: A low temperature scanning electron microscopy study. Planta. 175, 313-324 (1988).
  21. Ashworth, E. N., Anderson, J. A., Davis, G. A., Lightner, G. W. Ice formation in Prunus persica. under field conditions. J. Am. Soc. Hort. Sci. 110 (3), 322-324 (1985).
  22. Ashworth, E. N., Davis, G. A. Ice formation in woody plants under field conditions. HortSci. 21, 1233-1234 (1986).
  23. Pramsohler, M., Hacker, J., Neuner, G. Freezing pattern and frost killing temperature of apple (Malus domestica.) wood under controlled conditions and in nature. Tree Physiol. 32 (7), 819-828 (2012).
  24. Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. N. Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography. Plant Physiol. 113 (2), 327-334 (1997).
  25. Lutze, J. L., et al. Elevated atmospheric [CO2] promotes frost damage in evergreen tree seedlings. Plant Cell Environ. (6), 631-635 (1998).
  26. Ball, M. C., et al. Space and time dependence of temperature and freezing in evergreen leaves). Func. Plant Biol. 29 (11), 1259-1272 (2002).
  27. Sekozawa, Y., Sugaya, S., Gemma, H. Observations of ice nucleation and propagation in flowers of Japanese Pear (Pyrus Pyrifolia). Nakai) using infrared video. 73 (1), 1-6 (2004).
  28. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in plants visualized at the tissue level by IDTA (infrared differential thermal analysis). Tree Physiol. 27, 1661-1670 (2007).
  29. Hacker, J., Neuner, G. Ice propagation in dehardened alpine plant species studied by infrared differential thermal analysis (IDTA). Arc. Antarc. Alp. Res. 40 (4), 660-670 (2008).
  30. Hacker, J., Spindelböck, J., Neuner, G. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant Cell Environ. 31, 1725-1733 (2008).
  31. Neuner, G., XU, B., Hacker, J. Velocity and pattern of ice propagation and deep supercooling in woody stems of Castanea sativa., Morus nigra. and Quercus robur. measured by IDTA. Tree Physiol. 30, 1037-1045 (2010).
  32. Hacker, J., Ladinig, U., Wagner, J., Neuner, G. Inflorescences of alpine cushion plants freeze autonomously and may survive subzero temperatures by supercooling. Plant Sci. 180, 149-156 (2011).
  33. Kuprian, E., Briceno, V., Wagner, J., Neuner, G. Ice barriers promote supercooling and prevent frost injury in reproductive buds, flowers and fruits of alpine dwarf shrubs throughout the summer. Env. Exp. Bot. 106, 4-12 (2014).
  34. Wisniewski, M., Glenn, D. M., Fuller, M. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants. HortScience. 127, 358-364 (2002).
  35. Aryal, B., &Neuner, G. Leaf wettability decreases along an extreme altitudinal gradient. Oecologia. 162, 1-9 (2010).
  36. Wisniewski, M., Fuller, M. P. Ice nucleation and deep supercooling in plants: new insights using infrared thermography. In: Cold adapted organisms. Ecology, physiology, enzymologyandmolecularbiology. Margesin, R., Schinner, F. , Springer. 105-118 (1999).
  37. Franks, F. Biophysics and biochemistry at low temperatures. , Cambridge University Press. (1985).
  38. Neuner, G., Kuprian, E. Infrared thermal analysis of plant freezing processes. Methods in Molecular Biology: Plant Cold Acclimation. Hincha, D., Zuther, E. , Springer. 91-98 (2014).

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