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方法文章

用于动态研究红细胞聚集的可控微流控环境

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DOI：

10.3791/52719

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2015年6月4日

 ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

本文内容

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摘要

本文所述方案详细介绍了一种基于图像处理技术，在受控且恒定的剪切速率下定量红细胞（RBC）聚集体的实验方法。该方案的目标是在可控的微流控环境中，将红细胞聚集体的大小与相应的剪切速率关联起来。

摘要

血液作为一种非牛顿生物流体，是血液流变学领域众多研究的核心。血液的组成包括悬浮在血浆中的红细胞、白细胞和血小板。由于红细胞（RBCs）在血液中含量丰富（占血液体积的40%至45%），其行为尤其在微循环中主导了血液的流变特性。在极低剪切速率下，红细胞会聚集并形成称为聚集体的结构，从而导致血液表现出非牛顿流体行为。理解红细胞聚集体形成的条件，对于阐明微循环中的血液流变学特性至关重要。本文所述的实验方案详细介绍了基于图像处理技术，在恒定剪切速率条件下定量测定微循环中红细胞聚集体的实验方法。为此，将红细胞悬浮液置于120 × 60 µm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道中进行测试与分析。通过引入第二股流体驱动红细胞悬浮液，可在血液层内形成线性速度分布，从而实现广泛范围内的恒定剪切速率。剪切速率由微粒子图像测速系统（µPIV）测定，而红细胞聚集体则通过高速相机进行可视化观察。利用图像处理技术对所采集的红细胞聚集体视频进行分析，以根据图像灰度强度确定聚集体的尺寸。

引言

红细胞（RBC）在决定血液的流变学行为方面起着关键作用。它们几乎单独决定了血液在体外和体内的特殊性质。in vitro 和 in vivo。在生理条件下，红细胞占血液总体积的40%至45%。在微循环中，由于血管直径较小以及血浆偏流效应，红细胞仅占血液体积的20%左右1。微循环中血浆减少的现象被称为Fåhræus效应。在低剪切速率下，红细胞能够相互连接，形成一维或三维结构，称为“缗钱状结构”（rouleaux）或聚集体，从而导致血液的非牛顿流体行为。然而，红细胞聚集的机制尚未完全阐明。目前存在两种理论用于解释红细胞的聚集：一种是由于大分子交联导致的细胞桥接理论2，另一种是由于渗透梯度引起分子耗尽而产生的耗竭力吸引理论3。

通常，对于人血而言，聚集体在非常低的剪切速率下形成，范围为1至10秒-14。超过此范围，红细胞倾向于解聚，并在血管内单独流动。

了解聚集体形成的条件对于血液流变学领域具有重要意义，有助于定义血液的流变行为。这些聚集体通常出现在宏观循环水平（直径>300 µm）5。在此尺度下，血液被视为牛顿流体和均质混合物。然而，在毛细血管水平（直径4–10 µm）很少观察到这些聚集体，其出现通常提示存在糖尿病6和肥胖等病理状态。其他可能改变红细胞聚集的病理状态包括炎症或感染性疾病、心血管疾病（如高血压或动脉粥样硬化）、遗传性疾病以及慢性疾病7。因此，理解红细胞聚集机制并分析这些聚集体（通过定义聚集体大小与流动条件之间的关系），有助于揭示血液的微观流变行为，进而将其与临床应用相关联。

红细胞聚集可受到多种因素的影响，例如红细胞压积（血液中红细胞的体积）、剪切速率、血管直径、红细胞膜刚性以及悬浮介质的组成8-10。因此，为了有效分析红细胞聚集，需要在受控条件下进行。多种方法可通过提供静态聚集测量值（聚集指数）来分析聚集形成，从而获得有关血液行为的相关信息。这些方法包括但不限于红细胞沉降率法11、光透射法12、光反射法13和低剪切黏度法14。

很少有研究尝试在受控流动条件下研究红细胞聚集并确定其聚集程度15-17。然而，这些研究通过显微血液图像测量剪切系统中占据空间的比例，间接评估红细胞聚集体的大小，从而提供有关聚集程度及局部黏度的信息。Chen et al.18 提出了一种直接测量红细胞聚集体大小的技术，并通过改变悬浮液的流速同时监测流动室两端的压力降，获得了不同剪切应力下的红细胞聚集体大小分布。剪切应力是基于监测到的压力，利用斯托克斯方程计算得出的18。

因此，我们提出一种新方法，可在受控的微流体环境中，针对特定、恒定且可测量的剪切速率，动态地直接量化红细胞（RBC）聚集体。剪切系统中的血流被直接观察（垂直于流动方向），相较于以往研究15,18，提供了不同的流动观测角度，并实现了对整个目标区域的可视化。红细胞悬浮液在双Y型微通道（如图1所示）中与磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液共同引入，从而在血液层中形成剪切流动。在此血液层内可实现恒定的剪切速率。红细胞悬浮液在不同红细胞压积（H）水平（5%、10% 和 15%）以及不同剪切速率（2–11 sec-1）下进行测试。通过微粒子图像测速系统（µPIV）测定血液流速和剪切速率，同时利用高速相机对流动过程进行可视化。所获得的结果通过基于图像强度的MATLAB程序进行处理，以识别红细胞并确定聚集体的尺寸。

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方案

血液采集自健康个体，已获得渥太华大学伦理委员会（H11-13-06）的批准。

1. 微通道制备

微通道的制备基于标准的光刻方法19。

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微通道几何结构，并将该构型打印在透明光刻掩模上。这些掩模至关重要，因为它们决定了制造过程中的光照路径。本例中，微通道的尺寸为厚度120 µm、深度60 µm、长度7 mm。
  2. 在洁净室环境中，以2,000 rpm的转速在硅片上旋涂环氧基负性光刻胶30秒，以获得所需的微通道深度（60 µm）。
  3. 将硅片与光刻掩模置于紫外灯下，以650 mJ/cm2的剂量照射70秒。确保仅使掩模的透明区域暴露于紫外光下。透明区域的曝光会引发链式聚合反应，导致光刻胶硬化。随后将硅片浸入显影液中，以去除多余的光刻胶。
  4. 模具制备完成后，按10:1的比例混合硅基弹性体与固化剂，形成聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。将PDMS溶液放入真空腔中脱气。随后将其倒入模具中，在60 °C下加热90分钟以形成微通道。然后使用氧气等离子体键合技术将各微通道与载玻片键合90秒。
    注意：PDMS脱气过程旨在消除混合过程中产生的气泡。
  5. 确保微通道的尺寸能够支持有效的测试。在本实验方案中，微通道具有120 × 60 µm的矩形横截面。相比之下，平均红细胞（RBC）的直径为8 µm，厚度为2 µm。因此，该微通道宽度足以观察到良好的聚集现象，并准确测定速度分布剖面。

2. 血液制备

  1. 在获得伦理委员会批准后，从健康志愿者供体采集血液。使用采血管中含有的乙二胺四乙酸（EDTA）处理血液（每4 ml血液中含有7.2 mg EDTA）。
    注意：EDTA用于防止血液凝固。
  2. 将血液样本以1,400 × g（3,000 rpm）离心10分钟，共进行三次，以分离血液成分。离心后可观察到三个不同的层次。
    注意：这三个层次分别为红细胞层（位于试管底部）、白膜层（由位于红细胞层上方的白细胞和血小板组成）以及血浆层（位于所有其他成分的最上层）。
    1. 第一次离心后，使用血细胞计数吸管收集血浆，避免与白膜层接触。
    2. 将白膜层收集后置于含10%稀释漂白剂的容器中处理。
    3. 向含有剩余红细胞层的每个试管中加入3 ml pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS），并确保离心机配平正确。轻轻混匀试管后，再次以1,400 × g（3,000 rpm）离心10分钟。
      注意：确保PBS溶液中不含镁或钙离子，因为它们可能影响细胞黏附。
    4. 第二次离心后弃去试管中的PBS，并清除残留的白膜层（如有）。重复步骤2.2.3和2.2.4进行第三次离心，以获得纯净的红细胞。
  3. 将所需量的纯净红细胞（0.05、0.1和0.15 ml）与血浆（0.95、0.9和0.85 ml）在1 ml试管中混合，以制备相应血细胞比容为5%、10%和15%的红细胞悬液。使用微量离心机检测血细胞比容。

3. 液体配制

在双Y形微通道中引入两种流体：红细胞悬液和磷酸盐缓冲液（PBS）。

  1. 加入60 µl荧光示踪颗粒溶液（1%固体， d颗粒 = 0.86 µm，λabs = 542 nm 和 λ发射 = 612 nm）加入1 ml红细胞悬液管中。
    注意：荧光示踪粒子（内染色的聚苯乙烯粒子）用于测量微通道内流体的流速。当暴露于相应波长的激光束（λ = 542 nm）时，这些粒子会发出荧光。
  2. 配制 pH 7.4 的 PBS 溶液，并在 1 ml 该 PBS 溶液中加入 60 µl 相同的荧光示踪颗粒溶液。

4. 聚集体尺寸测量

  1. 使用25 µl和100 µl的玻璃注射器将液体（红细胞悬液和PBS）注入微通道，以降低系统的顺应性。通过与入口孔匹配的管路和连接器将微通道与注射器相连。利用液体容器与注射器之间的压力差将液体吸入玻璃注射器。确保系统中无气泡存在。作为替代方法，可采用压力控制系统驱动两种液体进入微通道。
  2. 将微通道置于连接高速相机和显微粒子图像测速（µPIV）系统的倒置显微镜载物台上。设定注射泵至所需的流速（例如， Q = 2 µl/hr 用于血液，从而产生 Q = 8 µl/hr 的 PBS 流速。
    注意：仅使用一台注射泵。通过两个不同内径的玻璃注射器，可调节进入Y形微通道各分支的流速。
  3. 从不同的入口支路将两种流体分别注入双Y型微通道，并以不同的流速进样，如图所示。 图1为了测试不同的剪切速率，可调节泵的流速。这将保持两支路之间相同的适当比例（本例中为4）。20 (图2 和 3）。在采集测量数据前，等待流动达到稳态：通过目视检查高速相机图像，确认流动平滑。
    注意：该比例对于在血层内获得线性速度分布至关重要。
  4. 使用高速相机观察红细胞。将相机连接至计算机，以控制、记录并保存流体流动的图像。当两股流体流动均达到稳态后，开始记录。
    1. 获取多幅图像以获得更佳的处理结果。确定相机的最佳曝光时间，以获得聚集体的清晰图像。
      注意：本案例中相机的曝光时间为0.5毫秒。每帧之间时间间隔的选择取决于相机帧率和微通道中的流速。本方案中处理的每帧之间的时间间隔为60毫秒，因此具备每秒记录18帧能力的相机已足够。
      注意：避免血液在试管和注射器中沉降，以免导致测量结果出现误差。
  5. 使用图像处理技术（本例中为 MATLAB 程序）改善图像质量，并根据像素强度在每幅图像中检测聚集体（如图所示） 图4如下所示：
    1. 使用直方图均衡化方法增强图像对比度，以获得每帧更佳的图像质量。
    2. 将灰度图像转换为二值图像。为此，设置一个介于0到1之间的阈值，用于决定每个像素的转换。图像中低于该阈值的像素将被识别为黑色像素，而高于该阈值的像素将被识别为白色像素。
    3. 如有必要，填充单个聚集体内部空隙对应的孔洞，以获得更佳结果。
    4. 通过在二值图像中确定相邻的白色像素来检测细胞，使相邻的细胞被识别为聚集体。
    5. 标记检测到的不同聚集体，并将二值图像转换为红-绿-蓝（RGB）图像以实现更佳的可视化效果。将原始图像帧与各自对应的处理后图像合并，以验证图像处理技术的有效性，并确保所有细胞均被纳入分析，如图所示 图5对所有捕获的图像帧执行步骤 4.5.1、4.5.2、4.5.3、4.5.4 和 4.5.5。
    6. 根据检测到的像素数量计算每帧中每个聚集体的面积。根据所用镜头的放大倍数，使用校准测微尺计算转换系数，并将结果转换为 µm。2将每帧中检测到的聚集体尺寸取平均值，然后对所有帧的结果进行平均，以获得每份红细胞悬液录像的平均聚集体尺寸。
    7. 计算单个红细胞的面积，以确定每个检测到的聚集体内具有代表性的估算红细胞数量。根据这些结果，计算每个聚集体内红细胞所占百分比的分布随聚集体大小（以每个聚集体的估算细胞数表示）的变化关系，如图所示。 图6.
      注意：可使用 ImageJ 软件（替代 MATLAB）对每一帧执行相同的红细胞聚集体测量任务。

5. 流体速度和剪切速率测量

使用 µPIV 系统确定流体速度，进而确定剪切速率。

  1. 使用高速相机获取数据后，切换至用于µPIV系统的双脉冲相机。利用成像软件采集流动图像，并进行图像处理以确定速度场。
  2. 根据激光器的类别采取所有必要的预防措施后，再开启激光器。然后依次开启系统、相机和激光器。
  3. 根据所用镜头的放大倍数校准相机。为此，使用显微镜下精度为10 µm的微尺，设定图像中1像素的尺寸。
  4. 启动激光器，观察两种流体中的粒子。通过聚焦流体中运动最快的粒子，找到微通道的中位平面。即， 最快的粒子应是最亮的。
  5. 设置 dt（连续两帧之间的时间间隔），以确保粒子产生适当的位移。最快粒子在两幅图像之间的移动距离应约为 5 到 10 像素。
  6. 开始记录流动过程。将软件设置为采集100对图像，每对图像间隔5毫秒。针对所有不同红细胞悬液及不同剪切速率，执行步骤5.4、5.5和5.6。
    注：有关该方法学的更多细节见Pitts和Fenech的研究21.
  7. 使用成像软件通过互相关方法处理所获得的 recordings。
    注意：该步骤包括将图像对分割为预设大小的小窗口（窗口尺寸基于用户选择的流体流速和时间间隔），称为互相关窗口，并追踪每个窗口内粒子的位移。
    1. 首先，确定所获取的图像是否需要预处理（包括背景扣除、“基线截取”22 或图像重叠23,24）以实现更优的数据处理。
    2. 然后选择相关窗口的大小和形状，以及图像重叠的百分比。Pitts 进行了一项详细的研究 等25 确定不同通道构型中血流的最优参数及图像预处理技术。将结果表示为基于100对图像计算得到的平均速度场以及速度的均方根（RMS）误差。
  8. 从处理后的数据中提取通道出口处的速度分布，如图所示 图7为了获得更清晰的轮廓，对速度场进行空间平均。
    注意：速度分布图中的柱状条对应于相对于通道宽度所选择的互相关窗口尺寸。速度的均方根误差也一并显示。 图7，代表实验速度估计中的误差。
  9. 完成所有测量和数据处理后，关闭激光器。关闭系统的所有组件：软件、相机、移动平台、计算机和激光器。
  10. 为计算剪切速率，首先根据高速摄像记录检测并估算微通道中血液的厚度。为此，对特定记录中的所有帧进行平均，以获得视频的背景图像。界定血液层（如图所示） 图8 对于在10 µl/hr流速下流动的红细胞悬液（红细胞压积分别为5%、10%和15%），获取相应血液层厚度下的流速值，并通过将流速值除以血液层厚度来计算剪切速率。

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结果

在双Y形微通道中，当人红细胞以5%、10%和15%的红细胞压积浓度悬浮并以10 µl/hr流速流动时，其两相流的一个示例如图2所示。图3展示了当红细胞压积为10%时，通道内流速从10 µl/hr降低至5 µl/hr后聚集体尺寸的差异。这定性地反映了在不同红细胞压积和剪切速率条件下聚集体的尺寸变化。图5追踪了四个连续帧中人红细胞聚集体的位移，从而提供了对所需相机帧率的定性评估以及各帧内聚集体分布的定性认识。在图5中，小型聚集体（估计包含8个或更少红细胞）以蓝色显示，中型聚集体（估计包含9至30个红细胞）和大型聚集体（估计超过30个红细胞）则分别以绿色和红色显示。

不同红细胞悬液在通道内的速度分布如图7所示，其中红色、蓝色和绿色曲线分别代表红细胞在5%、10%和15%血细胞比容下悬浮时的速度分布。各红细胞悬液的速度均方根误差也在图7中显示，与速度值相比相对较小，表明速度测量精度较高，从...

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讨论

利用本方法，可在不同的流动条件和红细胞压积下对红细胞聚集体进行定性和定量分析。为了成功进行检测和聚集体识别，关键在于确定微通道入口处两种流体之间的合适流速比。该比值对于获得具有近似线性速度分布的最优血液层厚度至关重要20。

成功检测的另一个关键因素是良好的图像质量。事实上，由于该方法基于图像处理，因此图像背景（通道内的液体）与待检测颗粒之间必须具有足够的对比度。如图2和图3所示，颗粒的亮度低于背景，这有助于聚集体的检测。图像处理技术中最需要考虑的参数是阈值。因此，根据所获得的对比度，选择一个能够将所有聚集体均纳入分析的最优阈值至关重要，如图5所示。本研究采用的图像分割方法在细胞检测与计数中已被广泛应用26-28。如果图像质量未达预期，且全局阈值不适用，则可采用其他算法来确定最优阈值，例如Otsu方法29，或自适应阈值法（将图像分块，并为每个分块区域计算局部阈值）。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。微加工实验在麦吉尔大学麦吉尔纳米工具微加工平台和卡尔顿大学电子系的支持下完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基于环氧树脂的负性光刻胶 SU8-50MicroChem 公司
SU8-50显影液MicroChem 公司
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard-184道康宁3097358-1004
PE-50系列等离子体系统 等离子体刻蚀PE-50 系列
含K的采血管2-EDTA（乙二胺四乙酸）FisherSciB367861
离心机， 即 Thermo Scientific CL2赛默飞世尔科技004260F
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma AldrichP5368-10PAK
示踪荧光微粒溶液（15 ml）FisherSciR800
血小板聚集仪RheoMeditechRheo Scan AnD300
玻璃注射器（50 µl)Hamilton80965
管道（Tygon）FisherSciAAA00001
高速相机（Basler）Graftek Imaging Inc.basler acA2000-340km可使用能够以每秒18帧速度录制的相机。
双脉冲相机 LaVisionImager Intense
显微镜 MITASLaVisionMITAS
Nd:YAG激光器New Wave ResearchSolo-II
注射泵（Nexus3000 和 PicoPlus）Chemyx 公司和哈佛仪器公司Nexus3000 和 PicoPlus
DaVis 软件LaVision戴维斯

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

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剪切速率分析图像处理技术微粒子图像测速法高速相机血流速度测量聚集体尺寸分布聚二甲基硅氧烷微通道荧光示踪微粒
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