用于动态研究红细胞聚集的可控微流控环境

摘要

本文所述方案详细介绍了一种基于图像处理技术，在受控且恒定的剪切速率下定量红细胞（RBC）聚集体的实验方法。该方案的目标是在可控的微流控环境中，将红细胞聚集体的大小与相应的剪切速率关联起来。

摘要

血液作为一种非牛顿生物流体，是血液流变学领域众多研究的核心。血液的组成包括悬浮在血浆中的红细胞、白细胞和血小板。由于红细胞（RBCs）在血液中含量丰富（占血液体积的40%至45%），其行为尤其在微循环中主导了血液的流变特性。在极低剪切速率下，红细胞会聚集并形成称为聚集体的结构，从而导致血液表现出非牛顿流体行为。理解红细胞聚集体形成的条件，对于阐明微循环中的血液流变学特性至关重要。本文所述的实验方案详细介绍了基于图像处理技术，在恒定剪切速率条件下定量测定微循环中红细胞聚集体的实验方法。为此，将红细胞悬浮液置于120 × 60 µm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道中进行测试与分析。通过引入第二股流体驱动红细胞悬浮液，可在血液层内形成线性速度分布，从而实现广泛范围内的恒定剪切速率。剪切速率由微粒子图像测速系统（µPIV）测定，而红细胞聚集体则通过高速相机进行可视化观察。利用图像处理技术对所采集的红细胞聚集体视频进行分析，以根据图像灰度强度确定聚集体的尺寸。

引言

红细胞（RBC）在决定血液的流变学行为方面起着关键作用。它们几乎单独决定了血液在体外和体内的特殊性质。in vitro 和 in vivo。在生理条件下，红细胞占血液总体积的40%至45%。在微循环中，由于血管直径较小以及血浆偏流效应，红细胞仅占血液体积的20%左右¹。微循环中血浆减少的现象被称为Fåhræus效应。在低剪切速率下，红细胞能够相互连接，形成一维或三维结构，称为“缗钱状结构”（rouleaux）或聚集体，从而导致血液的非牛顿流体行为。然而，红细胞聚集的机制尚未完全阐明。目前存在两种理论用于解释红细胞的聚集：一种是由于大分子交联导致的细胞桥接理论²，另一种是由于渗透梯度引起分子耗尽而产生的耗竭力吸引理论³。

通常，对于人血而言，聚集体在非常低的剪切速率下形成，范围为1至10秒^-14。超过此范围，红细胞倾向于解聚，并在血管内单独流动。

了解聚集体形成的条件对于血液流变学领域具有重要意义，有助于定义血液的流变行为。这些聚集体通常出现在宏观循环水平（直径>300 µm）⁵。在此尺度下，血液被视为牛顿流体和均质混合物。然而，在毛细血管水平（直径4–10 µm）很少观察到这些聚集体，其出现通常提示存在糖尿病⁶和肥胖等病理状态....

方案

血液采集自健康个体，已获得渥太华大学伦理委员会（H11-13-06）的批准。

1. 微通道制备

微通道的制备基于标准的光刻方法¹⁹。

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微通道几何结构，并将该构型打印在透明光刻掩模上。这些掩模至关重要，因为它们决定了制造过程中的光照路径。本例中，微通道的尺寸为厚度120 µm、深度60 µm、长度7 mm。
2. 在洁净室环境中，以2,000 rpm的转速在硅片上旋涂环氧基负性光刻胶30秒，以获得所需的微通道深度（60 µm）。
3. 将硅片与光刻掩模置于紫外灯下，以650 mJ/cm²的剂量照射70秒。确保仅使掩模的透明区域暴露于紫外光下。透明区域的曝光会引发链式聚合反应，导致光刻胶硬化。随后将硅片浸入显影液中，以去除多余的光刻胶。
4. 模具制备完成后，按10:1的比例混合硅基弹性体与固化剂，形成聚二甲基硅氧烷（PDMS）溶液。将PDMS溶液放入真空腔中脱气。随后将其倒入模具中，在60 °C下加热90分钟以形成微通道。然后使用氧气等离子体键合技术将各微通道与载玻片键合90秒。
   注意：PDMS脱气过程旨在消除混合过程中产生的气泡。
5. 确保微通道的尺寸能够支持有效的测试。在本实验方案中，微通道具有120 × 60 µm的矩形横截面。相比之下，平均红....

结果

在双Y形微通道中，当人红细胞以5%、10%和15%的红细胞压积浓度悬浮并以10 µl/hr流速流动时，其两相流的一个示例如图2所示。图3展示了当红细胞压积为10%时，通道内流速从10 µl/hr降低至5 µl/hr后聚集体尺寸的差异。这定性地反映了在不同红细胞压积和剪切速率条件下聚集体的尺寸变化。图5追踪了四个连续帧中人红细胞聚集体的位移，从而提供了对所需相机帧率的定性评估以及各帧内聚集体分布的定性认识。在图5中，小型聚集体（估计包含8个或更少红细胞）以蓝色显示，中型聚集体（估计包含9至30个红细胞）和大型聚集体（估计超过30个红细胞）则分别以绿色和红色显示。

不同红细胞悬液在通道内的速度分布如图7所示，其中红色、蓝色和绿色曲线分别代表红细胞在5%、10%和15%血细胞比容下悬浮时的速度分布。各红细胞悬液的速度均方根误差也在图7中显示，与速度值相比相对较小，表明速度测量精度较高，从.......

讨论

利用本方法，可在不同的流动条件和红细胞压积下对红细胞聚集体进行定性和定量分析。为了成功进行检测和聚集体识别，关键在于确定微通道入口处两种流体之间的合适流速比。该比值对于获得具有近似线性速度分布的最优血液层厚度至关重要²⁰。

成功检测的另一个关键因素是良好的图像质量。事实上，由于该方法基于图像处理，因此图像背景（通道内的液体）与待检测颗粒之间必须具有足够的对比度。如图2和图3所示，颗粒的亮度低于背景，这有助于聚集体的检测。图像处理技术中最需要考虑的参数是阈值。因此，根据所获得的对比度，选择一个能够将所有聚集体均纳入分析的最优阈值至关重要，如图5所示。本研究采用的图像分割方法在细胞检测与计数中已被广泛应用^26-28。如果图像质量未达预期，且全局阈值不适用，则可采用其他算法来确定最优阈值，例如Otsu方法²⁹，或自适应阈值法（将图像分块，并为每个分块区域计算局部阈值）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基于环氧树脂的负性光刻胶 SU8-50	MicroChem 公司
SU8-50显影液	MicroChem 公司
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Sylgard-184	道康宁	3097358-1004
PE-50系列等离子体系统	等离子体刻蚀	PE-50 系列
含K的采血管2-EDTA（乙二胺四乙酸）	FisherSci	B367861
离心机， 即 Thermo Scientific CL2	赛默飞世尔科技	004260F
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
示踪荧光微粒溶液（15 ml）	FisherSci	R800
血小板聚集仪	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
玻璃注射器（50 µl)	Hamilton	80965
管道（Tygon）	FisherSci	AAA00001
高速相机（Basler）	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	可使用能够以每秒18帧速度录制的相机。
双脉冲相机	LaVision	Imager Intense
显微镜 MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG激光器	New Wave Research	Solo-II
注射泵（Nexus3000 和 PicoPlus）	Chemyx 公司和哈佛仪器公司	Nexus3000 和 PicoPlus
DaVis 软件	LaVision	戴维斯