成年哺乳动物脊髓中含有可分离并在体外扩增培养的神经干细胞/祖细胞（NSPCs）。本实验方案描述了从大鼠及人类器官移植供体的成年脊髓室管膜下区获取、分离、培养以及传代NSPCs的方法。
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本文内容
摘要
摘要
成年大鼠和人类脊髓神经干细胞/祖细胞 (在富含生长因子的培养基中培养的神经干细胞/前体细胞（NSPCs）能够增殖，产生具有多向分化潜能、自我更新能力和可扩增性的神经干细胞。在含血清的条件下，这些多能性NSPCs会分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。收获的组织在木瓜蛋白酶-EDTA溶液中进行酶解离，随后通过机械解离并利用不连续密度梯度离心分离，获得单细胞悬液，接种于添加表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝素的神经基础培养基中。成年大鼠脊髓NSPCs以悬浮神经球形式培养，而成年人类脊髓NSPCs则以贴壁培养方式生长。在此培养条件下，成年脊髓NSPCs可持续增殖，表达前体细胞标志物，并可在传代过程中不断扩增。这些细胞可用于研究 体外 在受到各种刺激时，可利用外源性因素促进谱系限制，以研究神经干细胞的分化。多能性NSPCs或其子代细胞也可被移植到多种动物模型中，以评估再生修复能力。
引言
神经干细胞/祖细胞（NSPCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，属于神经谱系，能够在体外自我更新并快速扩增。in vitro。我们将这些细胞称为神经干细胞/祖细胞的混合群体，因为它们既表现出自我更新的多能干细胞特性，也具有更为局限的祖细胞特征。NSPCs 存在于胎儿及成体的脑和脊髓中1,2。在成体中，NSPCs 通常处于静息状态，定位于特定的微环境，包括侧脑室壁的室下区2-4，以及脊髓中央管周围的室管膜周区域5,6。
通常，神经干细胞/前体细胞（NSPCs）在添加了表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）这两种可筛选干细胞/前体细胞群体的有丝分裂原的无血清培养基中，以悬浮的神经球形式或贴壁的单层形式进行培养。由Reynolds和Weiss最初建立的神经球实验方法2，是目前最常用的神经干细胞培养与扩增方法。当NSPCs被接种于不含生长因子但含有血清的培养基中时，可表现出多向分化潜能，分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。当培养的组织包含中央管区域时，可从成年啮齿类动物脊髓中分离并培养出具有多向分化能力和自我更新能力的NSPCs6,7。相较于从其他区域获取的细胞，利用成年脊髓来源的NSPCs的一个潜在优势在于，这些组织特异性的细胞与脊髓中因损伤或疾病而丢失或受损的细胞最为相似。
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方案
所有动物实验程序均经加拿大安大略省多伦多市大学健康网络动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》中的政策规定。获取人类脊髓组织的批准来自大学健康网络研究伦理委员会以及负责安大略省器官捐献的Trillium-Gift of Life基金会。
1. 解剖缓冲液和培养基的配制
- 分离大鼠脊髓时，准备 100 ml 解剖缓冲液（1x PBS + 0.6% 葡萄糖 + 2% 青霉素-链霉素），并冷藏。分离人脊髓时，准备 100 ml 解剖缓冲液（1x HBSS + 0.6% 葡萄糖 + 2% 青霉素-链霉素），并冷藏。
- 准备 100 ml 无血清培养基（SFM），并在 37 °C 预热。配制 SFM 时，向 Neurobasal-A 培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/ml 青霉素-链霉素、2% B27 和 10% 激素混合液。配制激素混合液时，配制 1 : 1 的 DMEM/F12 培养基，其中包含 0.6% 葡萄糖、3 mM NaHCO3、5 mM HEPES、25 µg/ml 胰岛素、100 µg/ml 脱铁转铁蛋白、10 µM 腐胺、30 nM 硒和 20 nM 孕酮。
- 配制 EFH 生长因子富集的铺板培养基（在 SFM 中加入 20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF 和 2 µg/ml 肝素），并在 37 °C 预热。确保人源 E....
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结果
成年大鼠脊髓细胞在EFH培养基中进行悬浮培养，接种后1周内将形成较小的神经球（未分化细胞的克隆）。在原代培养中，大多数接种的细胞会死亡，而对生长因子有反应的干细胞则会在EFH培养基中增殖并被筛选出来。至第3代时，将出现大量直径约100 µm的悬浮神经球（图2A）。神经球呈圆形且相位明亮，在高倍镜下可见其外层细胞伸出纤毛样微突起，这是神经球的特征，可区别于细胞碎片的团块（图2B）。从大鼠组织中分离细胞的典型得率约为2 × 106个细胞，活力约为80%。神经球接种密度不宜过高，以避免细胞簇聚集。此外，过大的神经球难以解离，且其中心区域的细胞易发生坏死。若传代前培养时间过长，也会出现此类情况。在EFH培养体系中，成年大鼠脊髓神经前体细胞可增殖（图2C），并表达前体细胞标志物nestin（图2D），而成熟神经细胞标志物的表达水平较低（数据未显示）。
成人脊髓NSPC培养物的生长速度不及大鼠NSPC培养物。若将人脊髓细胞最初以悬浮方式培.......
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讨论
在解剖大鼠脊髓组织时，进行椎板切除术应小心避免损伤脊髓。当脊髓节段保持完整时，更易于分离室管膜周围组织。组织节段应完全浸入解剖缓冲液中，可用显微剪刀将覆盖的脑膜和白质以纵向条带形式剪除。 alternatively，也可使用精细的组织镊子剥离白质。
在NSPCs的分离过程中，我们采用木瓜蛋白酶-EDTA消化法结合机械吹打来解离大鼠和人类脊髓组织。与其他蛋白酶相比，木瓜蛋白酶的损伤较小但效果显著，这一点在此前新生大鼠皮层神经元的解离研究中已有报道11。我们发现，仅使用机械吹打的方法（常用于胎儿组织）在成年组织中效果不佳。酶消化后，机械吹打对于破碎残留的组织碎片至关重要。应使用移液器反复吹打细胞以充分分散，直至无完整组织碎片残留，获得浑浊的细胞悬液。然而，吹打力度不宜过大，以免产生气泡导致细胞悬液起泡，进而引起细胞死亡。
传代时，大鼠神经球可通过机械吹打法解离为单细胞悬液，此方法最初已有描述2。然而，也可使用酶法（如胰蛋白酶-EDTA）对神经球进行解离，只要酶处理时间较短，便不会损伤细胞.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢安大略省脊髓损伤协会、安大略省-中国研究与创新基金、多伦多综合医院与西区医院基金会以及医师服务有限公司基金会提供的支持。作者感谢塔斯尼姆·扎希尔博士在人脊髓神经干细胞前体细胞培养方面提供的专业建议，同时感谢辛迪·莫尔斯黑德博士和艾丽斯·库尔巴茨基博士在大鼠脊髓神经干细胞前体细胞分离方面提供的专业指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | 解剖缓冲液 |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | 解剖缓冲液 |
| D-葡萄糖 | Sigma | # G-6152 | 配制30%葡萄糖储备液用于解剖缓冲液和激素混合液 |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | #15140-148 | 解剖缓冲液和培养基 |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | 培养基 |
| L-谷氨酰胺，200 mM | Life Technologies | #25030-081 | 培养基 |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | 培养基 |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | 激素混合液 |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | 激素混合液 |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | 配制7.5% NaHCO3储备液用于激素混合液 |
| HEPES | Sigma | #H9136 | 配制1 M HEPES储备液用于激素混合液 |
| 胰岛素 | Sigma | #I-5500 | 激素混合液 |
| 去铁转铁蛋白 | Sigma | #T-2252 | 激素混合液 |
| 腐胺 | Sigma | # P7505 | 激素混合液 |
| 硒 | Sigma | #S-9133 | 激素混合液 |
| 孕酮 | Sigma | #P-6149 | 激素混合液 |
| EGF，小鼠 | Sigma | #E4127 | 在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基 |
| EGF，人重组 | Sigma | #E9644 | 在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基 |
| bFGF，人重组 | Sigma | #F0291 | 在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基 |
| 肝素，10,000 U | Sigma | #H3149 | 在激素混合液中配制27.3 mg/ml储备液并分装；EFH培养基 |
| 木瓜蛋白酶解离试剂盒 | Worthington Biochemicals | #LK003150 | 包含EBSS、木瓜蛋白酶、DNase、含BSA的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂 |
| 戊巴比妥钠 | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| 组织镊：Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | 带锯齿的标准尖端；也可使用微尖端 |
| 精细镊：Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| 显微剪刀 | Fine Science Tools | #15024-10 | 圆柄Vannas剪 |
| 咬骨钳 | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm 培养皿 | Nunc | 1501 | |
| T25 培养瓶 | Nunc | 156367 | |
| 40 μm 尼龙细胞滤网 | VWR | CA21008-949 | |
| 6孔板 | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel，生长因子减量（100倍浓缩） | Corning | 354230 | 按说明解冻并分装冷冻；使用时按40 μl Matrigel : 1 ml SFM的比例稀释 |
参考文献
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al.<....
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重印与许可
