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从成年大鼠和人类脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞

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DOI：

10.3791/52732

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2015年5月14日

 , 
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

本文内容

摘要

成年哺乳动物脊髓中含有可分离并在体外扩增培养的神经干细胞/祖细胞（NSPCs）。本实验方案描述了从大鼠及人类器官移植供体的成年脊髓室管膜下区获取、分离、培养以及传代NSPCs的方法。

摘要

成年大鼠和人类脊髓神经干细胞/祖细胞 (在富含生长因子的培养基中培养的神经干细胞/前体细胞（NSPCs）能够增殖，产生具有多向分化潜能、自我更新能力和可扩增性的神经干细胞。在含血清的条件下，这些多能性NSPCs会分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。收获的组织在木瓜蛋白酶-EDTA溶液中进行酶解离，随后通过机械解离并利用不连续密度梯度离心分离，获得单细胞悬液，接种于添加表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝素的神经基础培养基中。成年大鼠脊髓NSPCs以悬浮神经球形式培养，而成年人类脊髓NSPCs则以贴壁培养方式生长。在此培养条件下，成年脊髓NSPCs可持续增殖，表达前体细胞标志物，并可在传代过程中不断扩增。这些细胞可用于研究 体外 在受到各种刺激时，可利用外源性因素促进谱系限制，以研究神经干细胞的分化。多能性NSPCs或其子代细胞也可被移植到多种动物模型中，以评估再生修复能力。

引言

神经干细胞/祖细胞（NSPCs）是一类具有多向分化潜能的细胞，属于神经谱系，能够在体外自我更新并快速扩增。in vitro。我们将这些细胞称为神经干细胞/祖细胞的混合群体，因为它们既表现出自我更新的多能干细胞特性，也具有更为局限的祖细胞特征。NSPCs 存在于胎儿及成体的脑和脊髓中1,2。在成体中，NSPCs 通常处于静息状态，定位于特定的微环境，包括侧脑室壁的室下区2-4，以及脊髓中央管周围的室管膜周区域5,6。

通常，神经干细胞/前体细胞（NSPCs）在添加了表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）这两种可筛选干细胞/前体细胞群体的有丝分裂原的无血清培养基中，以悬浮的神经球形式或贴壁的单层形式进行培养。由Reynolds和Weiss最初建立的神经球实验方法2，是目前最常用的神经干细胞培养与扩增方法。当NSPCs被接种于不含生长因子但含有血清的培养基中时，可表现出多向分化潜能，分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。当培养的组织包含中央管区域时，可从成年啮齿类动物脊髓中分离并培养出具有多向分化能力和自我更新能力的NSPCs6,7。相较于从其他区域获取的细胞，利用成年脊髓来源的NSPCs的一个潜在优势在于，这些组织特异性的细胞与脊髓中因损伤或疾病而丢失或受损的细胞最为相似。

先前的研究表明，源自成人脊髓的神经球无法进行长期传代或扩增以获得足够数量的细胞8,9。然而，通过培养条件的改进，我们此前报道了成人脊髓来源的神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的扩增与移植，证明了可从器官捐献者的成人脊髓中分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的NSPCs10。关键改进主要包括在解剖过程中去除大部分白质，并将细胞接种于含有生长因子的培养基中的贴壁基质上，从而选择性促进成人脊髓NSPCs的增殖。在本方案中，我们描述了从成年大鼠及人类器官捐献者获取脊髓组织、分离室管膜下区组织，以及NSPCs的分离、培养与扩增过程。

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方案

所有动物实验程序均经加拿大安大略省多伦多市大学健康网络动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会制定的《实验动物护理与使用指南》中的政策规定。获取人类脊髓组织的批准来自大学健康网络研究伦理委员会以及负责安大略省器官捐献的Trillium-Gift of Life基金会。

1. 解剖缓冲液和培养基的配制

  1. 分离大鼠脊髓时，准备 100 ml 解剖缓冲液（1x PBS + 0.6% 葡萄糖 + 2% 青霉素-链霉素），并冷藏。分离人脊髓时，准备 100 ml 解剖缓冲液（1x HBSS + 0.6% 葡萄糖 + 2% 青霉素-链霉素），并冷藏。
  2. 准备 100 ml 无血清培养基（SFM），并在 37 °C 预热。配制 SFM 时，向 Neurobasal-A 培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/ml 青霉素-链霉素、2% B27 和 10% 激素混合液。配制激素混合液时，配制 1 : 1 的 DMEM/F12 培养基，其中包含 0.6% 葡萄糖、3 mM NaHCO3、5 mM HEPES、25 µg/ml 胰岛素、100 µg/ml 脱铁转铁蛋白、10 µM 腐胺、30 nM 硒和 20 nM 孕酮。
  3. 配制 EFH 生长因子富集的铺板培养基（在 SFM 中加入 20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF 和 2 µg/ml 肝素），并在 37 °C 预热。确保人源 EFH 中含有人重组生长因子（见材料表）。

2. 成年大鼠脑室周围脊髓组织的采集与解剖

  1. 将解剖器械在乙醇中灭菌，并用无菌生理盐水冲洗，或预先进行高压灭菌。对大鼠（6–8 周龄）注射致死剂量的戊巴比妥钠（1 cc，65 mg/ml）或过量麻醉剂即，4% 异氟烷），具体操作遵循所在机构批准的动物实验方案。用 70% 乙醇浸湿大鼠背部，使用大型解剖剪剪除背部皮肤。
  2. 将剪刀垂直于背侧表面，在后肢上方横向剪断脊柱。使用较小的剪刀，从脊柱背侧肌肉处开始，沿头侧方向纵向剪开，以暴露棘突。
  3. 从暴露的尾端开始，将咬骨钳或小型钝头骨切割器械经硬膜外插入椎管侧壁，置于脊髓与椎骨之间的间隙。在椎板（位于每节椎骨棘突左右两侧的骨性弓状结构）上进行小范围切割，并小心剥离椎板，以暴露脊髓。图1A-D确保刀片的角度平缓，并与脊髓平行，以免损伤下方的脊髓组织。
  4. 继续向头侧方向进行椎板切除术，以暴露胸段和颈段脊髓。
  5. 用钝头组织镊子轻轻从椎骨中剥离脊髓，并使用显微剪仔细切断神经根以释放脊髓。将剥离的脊髓置于含有4 mL预冷人工脑脊液的培养皿中 °C 无菌大鼠解剖缓冲液（如上文 1.1 所述）。用新鲜配制的 4 °C 解剖缓冲液中，用剪刀将脊髓横向切成1厘米长的节段（图1E).
  6. 对于每一段组织，用一只手用精细镊子夹住组织，另一只手在解剖显微镜下用显微剪仔细去除覆盖的脑膜、白质以及大部分灰质。或者，使用精细镊子（Dumont #4）剥离大部分灰质和白质，仅保留脊髓的室管膜周围区域，该区域包括室管膜及少量周围的灰质。图1F-H).
  7. 将解剖得到的室管膜下组织收集至一个含有冷的大鼠解剖缓冲液的10 cm无菌培养皿中。

3. 成人人类脑室周围脊髓组织的采集与解剖

注意：人脊髓组织取自成年器官捐献者（捐献者年龄范围为2至60岁），在其他器官已被摘取用于器官移植后获取。Trillium-Gift of Life项目从患者家属处获得用于研究目的的组织摘取同意，并及时通知我们的组织采集团队，使我们能够在主动脉交叉阻断后2小时内完成脊髓的采集。接受血清学检测阴性且无感染的成年男性和女性捐献者。

  1. 在手术室中，通过前路以无菌方式获取组织，使用器官移植采集团队已解剖出的相同前侧入路进行操作。
  2. 使用大型肋骨牵开器和大型板状牵开器，将残留的组织和器官（包括大血管）向两侧牵拉，暴露前部脊柱结构。
  3. 使用安装长刀片的胸骨锯，在拟切除椎体节段的头端和尾端穿过椎间盘进行切割。将锯片向内侧倾斜约45°，从椎体侧部切出一个三角形沟槽，至接近但不穿透椎管为止。
  4. 借助弯头骨凿和锤子，整块切除目标节段椎体的内侧部分，注意避免损伤硬脊膜。然后用有齿镊子轻轻抬起被硬脊膜覆盖的脊髓，锐性切断脊髓的头端和尾端。使用长剪刀和镊子，双侧逐一切断各个神经根。
  5. 将切除的脊髓节段放入盛有4 °C无菌缓冲液（1× HBSS + 0.6%葡萄糖 + 2%青霉素-链霉素）的大试管中，用于转运至组织培养室。

  6. 注意：通常在循环停止后尽快于手术室无菌条件下获取一段3–6 cm长的上胸段和/或中下胸段脊髓，并立即置于冷的无菌缓冲液中。从循环停止到脊髓取出之间的时间间隔取决于器官捐献采集所需时间，通常为45分钟至2小时。若心脏和肺脏也已被摘除，则可向前路更靠头端方向解剖，同时获取部分下颈段脊髓。
  7. 获取后应尽快解剖人脊髓组织，通常在3小时内完成。用镊子去除硬脊膜及其他脑膜结构。将脊髓组织在新配制的4 °C解剖缓冲液中冲洗，并横向切成1 cm长的节段。
  8. 在解剖显微镜下，对每个组织节段使用组织镊、精细镊和显微剪，剔除其表面的脑膜、白质以及大部分灰质。将解剖所得的室管膜周围组织（包括室管膜及少量周围灰质）收集至一个含有冷的人体解剖缓冲液的10 cm无菌培养皿中。

4. 成年大鼠和人类脊髓NSPCs的分离与培养

  1. 在超净工作台中无菌操作执行以下步骤。
    1. 将解剖所得的大鼠或人类室管膜周围组织切成 1 mm 的小块3 用显微剪将组织剪成小块。
    2. 使用材料/试剂表中列出的木瓜蛋白酶解离试剂盒，用蛋白水解酶对切碎的组织进行酶解离。注意：试剂组分包括4个小瓶；小瓶1：Earle's平衡盐溶液（EBSS），小瓶2：含L-半胱氨酸和EDTA的木瓜蛋白酶，小瓶3：脱氧核糖核酸酶I（DNase），小瓶4：含牛血清白蛋白（BSA）的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂。
      注意： 注意：木瓜蛋白酶是一种具有广泛蛋白质底物特异性的巯基蛋白酶。本文中的木瓜蛋白酶来源于乳胶 番木瓜 植物来源的蛋白酶对大多数蛋白质底物的降解作用比胰蛋白酶更广泛。在组织解离过程中，部分细胞会受到损伤，导致DNA释放到解离液中，从而增加液体黏度，使移液操作变得困难。因此，在细胞分离过程中需加入DNase以降解游离DNA，同时不损伤完整细胞。卵类黏蛋白（ovomucoids）是一类糖蛋白类蛋白酶抑制剂，用于在解离步骤后抑制木瓜蛋白酶的活性。
  2. 首次使用时，用32 ml EBSS（小瓶1）重悬白蛋白-卵黏蛋白抑制剂混合物（小瓶4），然后于4℃保存 °C，并用于后续的分离。注意：此溶液的有效浓度为每毫升含10 mg卵黏蛋白抑制剂和10 mg白蛋白。
  3. 向木瓜蛋白酶小瓶（小瓶2）中加入5 ml EBSS（小瓶1），配制成每毫升含20单位木瓜蛋白酶、1 mM L-半胱氨酸和0.5 mM EDTA的溶液。确保木瓜蛋白酶溶液完全溶解后呈澄清状态，否则将小瓶置于37 °在37°C水浴中孵育十分钟，直至木瓜蛋白酶完全溶解，以确保酶的完全活性。
  4. 加入500 µ将 EBSS（1 号小瓶）加入脱氧核糖核酸酶小瓶（3 号小瓶）中，轻轻混匀，因为脱氧核糖核酸酶对剪切变性敏感。加入 250 µ将 DNase 溶液加入含有木瓜蛋白酶的西林瓶中，终浓度约为 20 单位/毫升木瓜蛋白酶和 0.005% DNase。剩余的 DNase 西林瓶保存备用。
  5. 将上述第4.4步配制好的木瓜蛋白酶溶液中加入切碎的大鼠或人组织。对于人组织的分离，将切碎的组织均分至两支木瓜蛋白酶管中（每管约0.2 g）。
  6. 37℃孵育 °在摇床平台上持续振荡，使组织在活化的木瓜蛋白酶溶液中解离。大鼠组织孵育45分钟至1小时，人组织孵育1至2小时，具体时间根据组织量而定，分别约为0.2–0.4 g。
  7. 用10 ml移液器吹打混合物，以解离任何残留的组织块，得到浑浊的细胞悬液。将细胞悬液（勿转移未解离的组织块）转移至无菌15 ml锥形离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。
  8. 将沉淀的细胞重悬于含有卵类粘蛋白（一种木瓜蛋白酶抑制剂）的培养基中。
    1. 通过将 2.7 ml EBSS（小瓶 1）与 300 µ将15 ml重建的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（4号小瓶）加入15 ml锥形管中。加入150 µ上一步骤4.4中保存的DNase溶液（小瓶3）的量
    2. 弃去细胞沉淀的上清液，并立即用稀释的DNase-白蛋白抑制剂混合液重悬细胞沉淀。 
  9. 通过单步不连续密度梯度离心法将完整细胞与细胞膜分离。
    1. 通过将5 ml白蛋白-抑制剂溶液（小瓶4）加入15 ml离心管中，制备不连续密度梯度；使用5 ml移液器，将细胞悬液（按上述步骤4.8制备）缓慢而轻柔地叠加在白蛋白-抑制剂溶液上方。
    2. 在室温下以 70 × g 离心 6 分钟。
    3. 注意：梯度的两层之间界面应清晰可见，尽管该边界处的轻微混合不会影响结果。膜碎片停留在界面处，而解离的细胞则沉淀于管底。 
  10. 对于大鼠细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1 ml大鼠EFH培养基中（预热至37℃） °C）使用血细胞计数板计数活细胞密度，并以每平方厘米10个细胞的密度将细胞接种至T25培养瓶中µl 在 EFH 中。从大鼠组织中获得的细胞典型产量约为 2 x 106 细胞存活率约为80%。若需获得单克隆培养物，应以每平方厘米少于10个细胞的密度接种细胞µl. 将培养瓶在37℃孵育 °C，5% CO₂2 培养1周，期间避免扰动，以防类球体聚集。
  11. 对于人源细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml预热至37℃的人源EFH培养基中 °C). 将细胞悬液通过40 μm细胞滤网过滤 µm 尼龙细胞滤网过滤，并用 30 ml EFH 洗涤以去除髓鞘和细胞膜碎片。在 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于 1 ml EFH 培养基中。
  12. 使用血细胞计数板计数活细胞密度，并以每平方厘米10个细胞的密度将人源细胞接种至6孔培养板中5 每孔5 ml EFH中接种细胞/孔。从人体组织中获得的细胞典型产量约为1 x 106 存活率约为70%的细胞。使用基底膜基质胶（Matrigel）等贴壁基质预包被培养板孔（见下文注释）。按40的比例稀释 µl Matrigel : 1 ml 无血清培养基（SFM）
  13. 注意： 或者，也可使用其他粘附基质，如聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白、纤连蛋白或胶原蛋白。
  14. 将培养板在37℃孵育 °C，5% CO₂2 并静置培养物，使其不受干扰地生长1周。

5. 成年大鼠和人类脊髓神经干细胞的传代

  1. 大鼠NSPCs在初次接种后约1周内会形成直径约为70 µm的小型神经球；每周传代一次，方法为收集细胞悬液，以300 × g离心5分钟，然后机械吹打细胞沉淀以解离神经球。
  2. 将解离后的细胞接种至含有新鲜大鼠EFH培养基的T25培养瓶中。或者，传代时可使用50%的条件培养基。大鼠NSPCs传代时的典型产量约为5 × 106个细胞，且随传代次数呈指数增长。
  3. 对于人源细胞培养，在初次接种1周后，每周两次更换一半培养基为新鲜EFH培养基，以促进细胞贴附于基质。通常在细胞贴壁后的1–2周内，改为每周两次完全更换培养基为新鲜EFH培养基。
  4. 在培养4–8周期间、细胞达到汇合前进行传代。
    1. 通过酶消化法（参见材料表）将细胞从基质上解离，每孔加入2 ml酶溶液，在37 °C孵育约10分钟。收集细胞悬液，以300 × g离心5分钟，然后将细胞沉淀轻柔重悬于1 ml新鲜配制的EFH培养基中。
    2. 使用血细胞计数板计数活细胞，并以每孔105个细胞的密度将细胞接种至6孔板（如步骤4.12所述预先包被）中，每孔总体积为5 ml EFH培养基。人源NSPCs传代时的典型产量约为2 × 106个细胞，通常传代后数量可翻倍。一般在传代间期，每周2–3次使用50%条件EFH培养基维持培养。

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结果

成年大鼠脊髓细胞在EFH培养基中进行悬浮培养，接种后1周内将形成较小的神经球（未分化细胞的克隆）。在原代培养中，大多数接种的细胞会死亡，而对生长因子有反应的干细胞则会在EFH培养基中增殖并被筛选出来。至第3代时，将出现大量直径约100 µm的悬浮神经球（图2A）。神经球呈圆形且相位明亮，在高倍镜下可见其外层细胞伸出纤毛样微突起，这是神经球的特征，可区别于细胞碎片的团块（图2B）。从大鼠组织中分离细胞的典型得率约为2 × 106个细胞，活力约为80%。神经球接种密度不宜过高，以避免细胞簇聚集。此外，过大的神经球难以解离，且其中心区域的细胞易发生坏死。若传代前培养时间过长，也会出现此类情况。在EFH培养体系中，成年大鼠脊髓神经前体细胞可增殖（图2C），并表达前体细胞标志物nestin（图2D），而成熟神经细胞标志物的表达水平较低（数据未显示）。

成人脊髓NSPC培养物的生长速度不及大鼠NSPC培养物。若将人脊髓细胞最初以悬浮方式培...

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讨论

在解剖大鼠脊髓组织时，进行椎板切除术应小心避免损伤脊髓。当脊髓节段保持完整时，更易于分离室管膜周围组织。组织节段应完全浸入解剖缓冲液中，可用显微剪刀将覆盖的脑膜和白质以纵向条带形式剪除。 alternatively，也可使用精细的组织镊子剥离白质。

在NSPCs的分离过程中，我们采用木瓜蛋白酶-EDTA消化法结合机械吹打来解离大鼠和人类脊髓组织。与其他蛋白酶相比，木瓜蛋白酶的损伤较小但效果显著，这一点在此前新生大鼠皮层神经元的解离研究中已有报道11。我们发现，仅使用机械吹打的方法（常用于胎儿组织）在成年组织中效果不佳。酶消化后，机械吹打对于破碎残留的组织碎片至关重要。应使用移液器反复吹打细胞以充分分散，直至无完整组织碎片残留，获得浑浊的细胞悬液。然而，吹打力度不宜过大，以免产生气泡导致细胞悬液起泡，进而引起细胞死亡。

传代时，大鼠神经球可通过机械吹打法解离为单细胞悬液，此方法最初已有描述2。然而，也可使用酶法（如胰蛋白酶-EDTA）对神经球进行解离，只要酶处理时间较短，便不会损伤细胞...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢安大略省脊髓损伤协会、安大略省-中国研究与创新基金、多伦多综合医院与西区医院基金会以及医师服务有限公司基金会提供的支持。作者感谢塔斯尼姆·扎希尔博士在人脊髓神经干细胞前体细胞培养方面提供的专业建议，同时感谢辛迪·莫尔斯黑德博士和艾丽斯·库尔巴茨基博士在大鼠脊髓神经干细胞前体细胞分离方面提供的专业指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSLife Technologies#10010023解剖缓冲液
1x HBSSLife Technologies#14175095解剖缓冲液
D-葡萄糖Sigma# G-6152配制30%葡萄糖储备液用于解剖缓冲液和激素混合液
青霉素-链霉素Life Technologies#15140-148解剖缓冲液和培养基
Neurobasal-A Life Technologies#10888-022培养基
L-谷氨酰胺，200 mMLife Technologies#25030-081培养基
B27Life Technologies#12587010培养基
DMEMLife Technologies#11885084激素混合液
F12Life Technologies#21700-075激素混合液
NaHCO3Sigma# S-5761配制7.5% NaHCO3储备液用于激素混合液
HEPESSigma#H9136配制1 M HEPES储备液用于激素混合液
胰岛素Sigma#I-5500激素混合液
去铁转铁蛋白Sigma#T-2252激素混合液
腐胺Sigma# P7505激素混合液
硒Sigma#S-9133激素混合液
孕酮Sigma#P-6149激素混合液
EGF，小鼠Sigma#E4127在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基
EGF，人重组Sigma#E9644在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基
bFGF，人重组Sigma#F0291在B27中配制100 μg/ml储备液并分装；EFH培养基 
肝素，10,000 USigma#H3149在激素混合液中配制27.3 mg/ml储备液并分装；EFH培养基
木瓜蛋白酶解离试剂盒Worthington Biochemicals#LK003150包含EBSS、木瓜蛋白酶、DNase、含BSA的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂
戊巴比妥钠Bimeda – MTC Animal Health IncDIN 00141704
组织镊：AddisonsFine Science Tools#11006-12 带锯齿的标准尖端；也可使用微尖端
精细镊：Dumont #4Fine Science Tools#11241-30
显微剪刀Fine Science Tools#15024-10圆柄Vannas剪
咬骨钳Bausch & LombN1430
10 mm 培养皿 Nunc1501
T25 培养瓶Nunc156367
40 μm 尼龙细胞滤网VWRCA21008-949
6孔板NuncCA73520-906
Matrigel，生长因子减量（100倍浓缩）Corning354230按说明解冻并分装冷冻；使用时按40 μl Matrigel : 1 ml SFM的比例稀释

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