关联气孔导度与叶片功能性状

摘要

解析生理学与形态学之间的关联，有助于深入理解植物叶片的机制性功能。本文介绍了一种从气孔导度测量中推导气孔调节参数的方法，并探讨了这些参数与传统叶片功能性状之间的相关性。

摘要

叶片功能性状之所以重要，是因为它们反映了植物的生理功能，例如蒸腾作用和碳同化作用。特别是，叶片的形态性状能够综合概括植物在水分利用效率、生长模式和养分利用等方面的战略策略。叶片经济谱（LES）是功能植物生态学中一个公认的研究框架，它体现了一个梯度变化趋势：比叶面积（SLA）、叶片氮、磷和阳离子含量逐渐增加，而叶片干物质含量（LDMC）和碳氮比（CN）则逐渐降低。LES描述了从单位叶质量具有高光合能力的短寿命叶片到单位质量碳同化速率较低的长寿命叶片的不同生存策略。然而，未被纳入LES的性状可能为物种生理特征提供额外信息，例如与气孔调控相关的性状。本文介绍了一系列广泛的叶片功能性状测定方案，既包括属于LES的性状，也包括独立于LES的其他性状。特别地，本文引入了一种新方法，用于描述植物气孔导度对水汽压差（vapor pressure deficit, vpd）的调节行为。由此获得的气孔调节参数可与LES及其他植物功能性状进行比较。结果表明，LES中的叶片功能性状同样能有效预测气孔调节参数。例如，叶片碳浓度与导度-vpd曲线拐点处及最大值处的水汽压差呈正相关关系。然而，未包含在LES中的性状在解释气孔调控参数方面提供了额外信息：在气孔密度较高和气孔指数较高的物种中，导度-vpd曲线拐点对应的水汽压差更低。总体而言，气孔和叶脉相关性状在解释气孔调节机制方面比LES所使用的性状具有更强的预测能力。

引言

为了深入理解植物叶片的功能，近年来许多研究尝试将叶片的形态学、解剖学和化学性状与生理响应（如叶片气孔导度（g_S) ^1-4此外，除了叶片性状外，气孔导度还受到光合有效光子通量密度、空气温度和水汽压差（vpd）等环境条件的强烈影响。 ⁵已提出多种方法来模拟 gs 与 vpd 的关系曲线^6-8 主要基于 gs 对 vpd 的线性回归 ⁶相比之下，本研究提出的模型回归了相对气孔导度的logits值（即， g 的比值_S 至最大气孔导度 g_SMAX) 对 vap（水汽压差）进行建模，并通过将 vap 作为二次回归项引入以考虑其非线性效应。

与其他模型相比，新模型能够推导出描述在水分亏缺条件下气孔导度（g_S）下调时的水汽压差（vpd）参数。同样，也可获得气孔导度（g_S）达到最大值时对应的水汽压差（vpd）。由于这些生理参数预计与碳同化过程密切相关^9,10，因此这些模型参数与叶片经济谱（LES）所反映的关键叶片性状在养分和资源分配策略上的关联也应十分紧密^3,11。因此，气孔调节策略与LES性状之间也应存在密切关系。这种关系尤其可能体现在叶片习性（常绿与落叶）上，因为叶片习性既与叶片经济谱相关，也与水分利用效率相关^12,13。常绿物种通常生长较慢，但在养分贫瘠的环境中具有更高的利用效率¹⁴。因此，叶片习性应表现为不同的气孔调节模式，常绿物种相较于落叶物种会采取更为保守的水分利用策略。

在共同园艺条件下对大量阔叶树种进行比较，检验了以下假设：1）气孔导度（g_S）与水汽压差（vpd）模型的参数与叶片经济谱相关的叶片性状存在关联。2）常绿树种的平均气孔导度（g_S）和最大气孔导度（g_SMAX）值低于落叶树种。

方案

1. 气孔导度

1. 气孔导度的测量
   注意：作者使用了一种简单的稳态式气孔计（Decagon SC1）。该气孔计具有体积小、操作直观、可靠性高的优点。在野外测量气孔导度时，应尽量缩短重复测量循环中各测定个体之间的距离，以实现最高的测量效率。
2. 根据可重复的模式选择不同物种和个体的叶片（相同的高度、相同的光照条件、植株内相同的位置，尽可能仅来自同一节位，且仅来自一类叶片：阳生叶或阴生叶）， 等等。).
   1. 仅测量健康、无损伤且完全展开的叶片。在个体上标记待测叶片（例如， 使用扎带或彩色胶带标记，以确保重复测量在同一片叶片上进行。
      注意：测量气孔导度时，应仅在叶片表面进行，避免中脉和明显的叶脉区域。
   2. 在日出前的清晨开始测量，重复测定5到10次，持续至中午气孔导度值明显下降。
      注意：每日连续测量可获得用于分析VPD与气孔导度之间关系的良好数据。
3. Vpd 测量
   1. 每次给药_S 测量，最好使用便携式记录仪记录温度和相对湿度，以直接测量同一叶片位置的环境条件。计算蒸气压差时，采用August-Roche Magnus公式¹⁵.

e_s=饱和水蒸气压 [hPa]

T=温度 [°C]

4. 模拟气孔导度（g_S）对水汽压差（vpd）的响应
   1. 将各物种的全部 g_S 数据按物种分别对 vpd 作图，将同一物种不同叶片的所有日变化过程合并为一个分析。通过查找气孔导度数据中的最大值，提取观测到的最大值。为实现物种间的可比性，将观测值除以该物种观测到的最大值（g_S/g_SMAX），以进行模型标准化。
   2. 对每个物种，使用具有二项误差分布的广义线性模型，将 g_S（g_S/g_SMAX）的 logit 值对 vpd 及其二次项进行回归分析（其中 a、b 和 c 代表回归参数）：

图1. 气孔导度（g_S）与水汽压差（vpd）关系的绘图示例及模型拟合结果。 气孔导度以水汽压差为自变量，针对Liquidambar formosana物种进行绘制。空心圆点表示观测值。（A）最大气孔导度、达到最大气孔导度时的水汽压差以及平均气孔导度均从绝对值（未标准化）的气孔导度（g_S）数据中提取。（B）标准化后的气孔导度数据（g_S/g_SMAX）用于提取相对参数（以实心圆点表示）²⁰。转载已获授权²⁰。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 所有物种的拟合模型。 所有物种的气孔导度数据对蒸气压差（vpd）回归的模型图。常绿物种用黑线表示，落叶物种用红线表示²⁰。经许可转载自²⁰。

注意：使用logits而非直接将g_S回归到vpd，可使模型模拟的最大值不超过g_SMAX，且在高vpd条件下g_S趋近于0。

5. 提取每个物种的气孔调节参数
   1. 计算模拟的绝对 g_SMAX 值（见图 1B中的 MaxFit）。具体方法为：将 1.4.2 步骤中的公式一阶导数设为零，求得气孔导度最大时对应的 vpd 值，即 vpd_gsMaxFit = -b/2a。将 vpd_gsMaxFit 代入 1.4.2 步骤的公式，并对结果取自然指数 e，得到 MaxFit。再计算每个物种所有导度测量值的平均值（见图 1A）。
      注：使用统计软件 R（http://www.r-project.org）。
   2. 为计算相对值，从标准化模型（g_S/g_SMAX）中提取以下两个点的气孔导度和 vpd 值：（1）模型峰值处的气孔导度与 vpd 值（MaxFit）；（2）曲线上第二个拐点处的 vpd 值（见图 1B）。将这些值乘以 g_SMAX，从而获得这两个点对应的绝对 g_S 值。所有 39 个物种的单个模型完整叠加结果见图 2。

2. 气孔性状的测量

1. 尽可能从用于气孔导度测量的相同叶片上取样。如果无法做到，则采用与气孔导度测量选叶时相同的选择方法，最好在相同的个体上进行。
2. 在新鲜样品上涂抹一层无色、快干的指甲油（可测试不同品牌，部分品牌比其他品牌更适用）。若样品无法立即处理，应将其保存在70%乙醇中。待指甲油完全干燥后，轻轻将印模从叶片上剥离，并按常规叶片样品的处理方法进行显微分析。  
   注意：对于毛状体密度较高的叶片，可先用氢氧化钠或乙酸与过氧化氢的1:1溶液处理，以获得更佳效果。
3. 光学显微镜分析
   1. 将相机连接至光学显微镜，该显微镜应具备40X至400X的放大倍数。相机连接显微镜后，需将所拍摄图像与显微镜的光学放大倍数及图像分辨率相对应。 例如， 借助天平。
   2. 使用开源图像处理软件（如 ImageJ） ¹⁶ 分析这些图片。
      1. 使用图像分析工具中的形状工具，在无污渍、指纹、破损区域或粗大叶脉的区域绘制一个形状。统计该区域内的气孔数量，总计至少 50,000 µm² 每样品
      2. 测量气孔保卫细胞长度和气孔孔径长度。计算每平方毫米的气孔数量。². 按气孔密度与每平方毫米表皮细胞数量的比值计算气孔指数².

3. 叶脉性状的评估

注意：对于叶片叶脉性状的评估，采用了 Sack 与 Scoffoni¹⁷ 的改良方案。

1. 样品制备
   注意：为了优化叶脉的可见度，需先对叶片进行漂白处理，然后用沙黄和孔雀绿染色。
   1. 为使叶片褪色，将其置于50%的脱色剂溶液中至少72小时（可测试不同品牌，某些品牌效果可能更佳）。或者，可使用5% NaOH溶液、10% KOH溶液或25% H₂O₂ 溶液
   2. 将溶液加热至30°C，或混合步骤3.1.1中的不同溶液以获得更佳效果。随后用清水冲洗数次。根据物种的叶片特性，调整漂白过程。
      注意：较厚的叶片可能需要更长的溶液浸泡时间或使用更强效的溶液。较薄且较嫩的叶片在72小时之内即可漂白至满意程度。
   3. 将叶片置于100%乙醇中进行脱色。随后在1%番红溶液中染色2–30分钟。为增强染色效果，可仅用1%孔雀石绿溶液处理数秒。根据物种不同，调整染色时间与强度以获得最佳效果。之后用清水多次漂洗。若叶片染色过深，可适当使用乙醇或脱色剂处理一段时间。
2. 样品分析
   1. 使用背光扫描仪以指定分辨率扫描叶片 约 1,200 dpi。将扫描分辨率与图片分辨率相匹配。 例如， 借助标尺，确保像素长度可追溯至扫描叶片的绝对长度测量值。
   2. 测量叶片的面积、周长、长度和宽度，计算多个指数， 例如， 长度/宽度和周长²/区域。从图片中央裁剪出一个1 cm × 1 cm的矩形。测量一级和二级叶脉的直径（不包括主中脉）。测量该样方内所有一级叶脉的总长度（叶脉密度）。

4. 其他叶片性状的评估

注意：评估典型叶片性状，如比叶面积（SLA）、叶片干物质含量（LDMC）、叶面积、元素含量、叶习性、叶羽裂性、复叶类型、叶缘类型 等等。 遵循既定方案 ^18,19.

1. 观察性叶片性状
   1. 通过野外观察评估叶片的羽裂情况、复叶类型、叶缘类型以及是否存在腺外蜜腺^18,19。
2. 分析性叶片性状
   1. 采集新鲜叶片样本，最好来自用于其他测量的同一植株，用于测定比叶面积（SLA）、叶面积和叶干物质含量（LDMC）^18,19。在80 °C烘箱中干燥48小时后，最好使用相同叶片测定元素含量及其比值。

结果

气孔导度和气孔调节的多个参数被发现与叶片的形态、解剖和化学性状相关。以下重点讨论与拐点处水汽压差（vpd）的关系，该值随气孔密度的增加而降低（p=0.04），随气孔指数的增加而降低（p=0.03），并随叶片碳含量的增加而升高（p=0.02，见图3）。结果表明，拐点处水汽压差的降低伴随着气孔密度和气孔指数的下降。相比之下，气孔导度的任何参数均未显示出与叶片习性之间的明确关系。两种叶片习性组内的高度变异表明，在常绿和落叶习性组内均存在不同的调控机制。

图3. 气孔导度调节模式与叶片性状之间关联的结果图。 气孔导度（g_S）- 气压亏缺（vpd）曲线上拐点处的气压亏缺值（VpdPoi）与（A）气孔密度、（B）气孔指数以及（C）叶片碳含量之间的关系²⁰。经许可转载自²⁰。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过本文提出的方法提取的气孔调节参数凸显了气孔性状的重要性，例如气孔密度和气孔指数。这些新发现的关系表明，将生理模型中的参数与叶片的形态学、解剖学和化学性状相联系具有重要潜力²⁰。与其他方法相比，本方法的优势在于能够捕捉到一个独特且明确的水汽压亏缺（vpd）值，在该值下气孔导度被下调至模型预测的最大气孔导度（g_s）的一半。

在本实验方案所列的所有步骤中，最关键的步骤是气孔导度的测量。由于气孔导度受到多种因素的调控，环境气象条件对其具有显著影响。在高相对湿度和低光照强度下测得的气孔导度（g_S）可能不可靠^21-23。针对形态学和解剖学性状，该实验方案应始终根据研究中所包含的目标物种进行相应调整。特别是在叶脉密度分析中，叶片的漂白和染色时间应根据叶片结构和坚韧程度进行适当调整。该方法可能存在的局限性包括某些因叶片形态特殊而导致气孔导度测量困难或易出错的物种，例如针叶树和叶片极窄的禾本科植物。

我们的结果部分证实了气孔导度参数与叶片经济谱（LES）的叶片性状之间存在关联的第一条假设，这与其他多项研究结果一致。例如，Poorter 和 Bongers（2006）²⁴ 报道了 g_S 与 LES 所代表的性状之间存在密切关联，e.g.，随着叶片寿命的增加，g_S 降低。相应地，Schulze et al.（1994）¹ 证明了叶片氮含量与 g_SMAX 之间存在明确的关联。类似地，Juhrbandt et al.（2004）²⁵ 发现 g_SMAX 与叶面积及叶片氮含量之间存在显著关系。

我们关于常绿与落叶习性之间存在明显差异的第二个假设未能得到证实。常绿和落叶习性内部在所测参数和性状上表现出的高度变异表明，叶习性并不是叶片经济谱（LES）的良好描述指标。Brodribb 和 Holbrook（2005）²⁶ 指出，叶习性与叶片生理策略之间可能并非必然关联，因为在各类叶习性中，广泛的性状变异均十分常见。

该方法可扩展至叶片以外的植物器官性状和生理特征，例如与木质部水力相关的性状，如木质部比导水率和显微木材性状²⁷。类似地，也可纳入由显微技术获得的其他类型的叶片性状，如栅栏组织结构和表皮蜡质层结构²⁸。

综上所述，本研究证实了叶经济谱（LES）与气孔调节之间的密切关联。此外，本文所采用的方法揭示了与叶经济谱无关的气孔调节模式的若干方面。特别是叶片的特定性状，如气孔大小、密度和指数，以及叶脉长度，值得在未来的功能植物研究中予以更多关注。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SC 1 突变孔计	Decagon		其他任何型号的突变孔计均可使用
用于标记叶片的扎带
塑料样品袋
纸质样品袋
湿度计	Trotec		其他任何型号均可使用
指甲油
Axioskop 2 plus 显微镜	Zeiss		其他任何型号均可使用
乙醇
漂白剂
5% NaOH
10% KOH
25% H2O2
孔雀石绿
沙夫兰