小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

摘要

初始CD4⁺ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4⁺ T细胞向不同效应亚群分化，可通过添加T细胞受体刺激信号和特定的细胞因子信号实现。

摘要

抗原未暴露（初始）CD4⁺ T细胞在T细胞受体（TCR）识别由MHC II类分子呈递的同源抗原时，会发生扩增并分化为效应亚群。TCR激活时微环境中存在的细胞因子信号是决定初始CD4⁺ T细胞效应命运的主要因素。⁺ T细胞。尽管初始T细胞活化过程中的细胞因子环境可能十分复杂，并涉及冗余和相互拮抗的信号 体内，不同细胞因子组合的添加在初始CD4⁺ T细胞激活 体外 可有效促进效应T辅助细胞谱系的建立，并表现出特征性的细胞因子和转录因子表达。此类分化实验通常被用作评估被认为可促进或抑制特定CD4⁺ T细胞亚群发育的靶点的第一步。⁺ 辅助性T细胞亚群。在分化过程中加入信号激动剂、拮抗剂或其他细胞因子等调节分子，也可用于研究特定靶点对T细胞分化的影响。本文描述了一种从小鼠中分离初始T细胞的基本实验方案，以及将初始T细胞极化为不同辅助性T细胞效应亚型所需的后续步骤。 体外.

引言

CD4细胞不同谱系或亚群的概念⁺ 辅助性T细胞（Th细胞）自20世纪后半叶以来一直被研究^th 世纪¹在共刺激信号存在的条件下，识别同源抗原可导致细胞经历多轮增殖，最终分化为效应性Th细胞。在此过程中生成的Th细胞类型取决于激活时所处的细胞因子环境。²最初，初始型 Th 细胞被认为在 T 细胞受体（TCR）激活、共刺激分子 CD28 结合以及细胞因子信号传导后，会极化为两种不同的谱系。1 型辅助细胞（Th1）的特征是在分化过程中依赖 IL-12 信号通路，并以效应因子形式产生细胞因子 IFNγ^3,4最终发现，已分化的 Th1 细胞具有一种最显著的遗传特征，即表达 T 盒家族转录因子。 Tbx21 （T-bet），被认为是Th1遗传程序的主要调控因子⁵此外，IL-12 和 IFNγ 均可促进 T-bet 的表达。^6,7在免疫应答中，Th1细胞对于宿主抵御胞内病原体具有重要作用，同时也是自身免疫性炎症的强效促进者。相比之下，2型辅助细胞（Th2）的发育依赖于IL-4，其效应细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13，在驱动B细胞应答中发挥关键作用，并在过敏反应中具有致病性。^8,9与Th1细胞类似，Th2细胞也被发现表达其特有的主要转录调控因子，称为GATA-3。^10,11有趣的是，极化性细胞因子的存在以及特定Th细胞谱系的形成会抑制其他谱系的发育^2,12，表明在免疫应答过程中可能仅有一类特定的Th亚群占据主导地位。

自从Th1和Th2细胞谱系被发现以来，后续研究进一步揭示了更多独特的辅助性T细胞亚群，包括滤泡辅助性T细胞（TFH）、产生IL-9的T细胞（Th9）以及产生IL-22的T细胞（Th22）（近期综述见¹³）。出于以下目的 体外 分化实验，本方案将仅聚焦于另外两种T细胞亚群，即调节性T细胞（Treg）和产生IL-17的CD4⁺ T细胞（Th17）。CD25⁺ 调节性T细胞可自然地在胸腺中产生（nTreg）；初始Th细胞也可在外周被诱导（iTreg）转化为具有调节功能的T细胞（综述见^14,15两种调节性T细胞均表达一种特征性转录因子，称为叉头框P3（Foxp3），该因子对其效应抑制机制至关重要，这些机制包括分泌可溶性抗炎介质、消耗IL-2以及依赖细胞接触的抑制作用。^14,15Foxp3表达的缺失会导致一种严重的多器官自身免疫性疾病，称为免疫失调、多内分泌病、肠病、X连锁综合征（IPEX），这表明该Th细胞亚群在缓解炎症及调控对外周自身抗原耐受中的关键作用。¹⁶体外，初始CD4⁺ 辅助性T细胞在IL-2和TGF-β刺激下上调Foxp3表达，并定向分化为调节性T细胞（Treg）程序 关键词：辅助性T细胞，Foxp3，IL-2，TGF-β，调节性T细胞，Treg程序^14,15. CD4 可能具有中等至显著的可塑性⁺ T细胞谱系，尤其是仅考虑细胞因子产生时（综述见 ^17,18）。然而，出于以下目的 体外 分化方案，我们将每种亚群视为独立的谱系进行讨论。

最近，一群能够产生IL-17细胞因子的Th17细胞被鉴定为具有促炎功能的独特谱系，这类细胞在自身免疫性炎症过程中尤其具有致病性^19-21Th17细胞表达一种独特的转录因子，称为视黄酸相关孤儿受体γt（RORγt），该因子协调Th17细胞的遗传程序²²TGFβ 通过诱导 RORγt 的表达，在 Th17 细胞谱系的生成中发挥重要作用。然而，TGFβ 信号的作用被认为只有在与 IL-6 协同作用时才能诱导 Th17 细胞的命运决定（详见综述于¹²）。进一步研究表明，多种其他信号可正向调控Th17细胞的分化，包括IL-1β、钠离子浓度升高以及TLR信号。^23-26. 其他研究报告表明，致病性 Th17 细胞 体内 是那些实际绕过TGFβ信号通路，并依赖IL-1、IL-6和IL-23的组合来分化的细胞²⁷因此，Th17细胞可由多种信号通路诱导产生；本实验方案将介绍常用于Th17细胞谱系分化的（TGFβ和IL-6）通路。

下述所有效应细胞谱系的分化方案均依赖于在整个实验过程中使用固定化的抗体作为TCR和CD28的刺激物。然而，其他研究已表明，使用抗原呈递细胞激活TCR²⁸，或使用仓鼠抗体交联抗CD3和抗CD28抗体刺激2天²⁹，同样是诱导生成多种Th亚群的有效方法。本文所述方案基于先前报道的从小鼠次级淋巴器官分离CD4⁺ T细胞³⁰以及诱导Th17细胞生成的方法³¹。其中一个主要区别在于，本方案依赖流式细胞分选仪从淋巴组织中分离初始型CD4⁺ T细胞。然而，目前许多公司已提供可快速富集初始型CD4⁺ T细胞的分离试剂盒，根据具体实验需求，可能无需进行细胞分选。本方案中所列的方法与试剂均为我们常规使用且发现最为有效的组合。但需注意，以下各步骤中许多环节均存在其他可替代的试剂与方法，具体选择应由各实验室根据自身研究目的自行确定。

方案

所有实验操作均按照罗莎琳德·富兰克林医学与科学大学环境健康与安全部门批准的方案进行。本方案所用的C57BL/6小鼠（购自NCI）饲养于特定病原体-free环境中，所有动物实验均按照罗莎琳德·富兰克林医学与科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 仪器、耗材和试剂的准备

1. 在无菌 PBS 中用抗 CD3 和抗 CD28 抗体包被 48 孔或 24 孔板（表 1），覆盖后用封口膜包裹以防止蒸发和污染，于 T 细胞分离前一日在 4 ^oC 过夜孵育。或者，可在 37 ^oC 孵育 1 小时完成包被。进行 Th0、Th1、Th2 和 iTreg 条件时，在 0.5–1 ml 总体积（48 孔板）中以每种抗体 1 μg/ml 的浓度包被抗 CD3 和抗 CD28。对于 Th17 条件，通常使用 2 μg/ml 抗 CD3 和 1 μg/ml 抗 CD28 进行包被。
   注意：我们发现较低浓度的抗 CD3 更有利于 Th1、Th2 和 iTreg 的生成，而较高浓度的抗 CD3 更有利于 Th17 的生成。因此，抗 CD3 和抗 CD28 的浓度应根据各实验室的具体情况进行滴定和优化（表 2）。
2. 通过高压灭菌或消毒液对一套解剖器械（剪刀和镊子）进行灭菌。在每次解剖之间，需准备一个装有 70% 乙醇的试管或小烧杯用于工具的快速消毒。此外，还需准备一个装有 70% 乙醇的喷雾瓶，用于在解剖前对小鼠体表进行消毒。
3. 将一块平板泡沫塑料或软木板用铝箔包裹，作为解剖操作台。使用解剖针或针头固定动物位置。
4. 准备用于组织收集的培养皿或板。若需合并组织样本，为脾脏和淋巴结组织分别准备含有 3 ml 无菌 PBS + 1% FBS（PBS+）的 60 mm 培养皿即可。若需保留每只小鼠的组织独立分离，则准备 24 孔板，在所需数量的孔中每孔加入 1 ml PBS+。
5. 配制完全 RPMI 培养基用于细胞培养，并在使用前预热（表 1）。
   注意：我们常规使用 RPMI 培养基，但其他培养基如 IMDM 和 DMEM 可能根据实验室和实验条件的不同而具有同等甚至更优的效果。
6. 裁剪 120 μm 孔径的尼龙网成 2×2 cm 的方块，并通过高压灭菌进行消毒（表 1）。
7. 可选：若使用高速磁性细胞分选系统（如 autoMACS）进行 CD4⁺ 细胞富集，需将运行缓冲液和冲洗缓冲液在 37 ^oC 水浴中预热，以防止对仪器造成损害。
8. 注意：建议进行富集以提高分选得率并缩短分选时间。
9. 除解剖步骤外，所有准备工作均应在无菌细胞培养超净台中进行。

2. 小鼠淋巴结和脾脏的分离

1. 使用机构批准的方法对所需数量的动物实施安乐死。选用5-10周龄的C57BL/6雌性小鼠，因其初始T细胞比例较高，且与雄性或年老小鼠相比体脂含量较低。
   注意：体外实验中，雄性小鼠来源的细胞表现相似，且实验步骤保持不变。每只5-10周龄的雌性小鼠通常可获得3-6 × 10⁶个初始CD4⁺ T细胞。然而，使用不同品系的小鼠可能会影响细胞产量和功能表现。例如，C57BL/6小鼠来源的细胞更适合诱导Th1细胞，而Balb/c小鼠来源的细胞则更适合诱导Th2细胞。
2. 展开动物四肢并用针固定，如图1所示。从肛门沿纵轴切开皮肤至下颌，注意避免刺破深层组织。
3. 用镊子撑开皮肤，并用针固定皮肤位置，以便于暴露淋巴结，如图1所示。
4. 采集图1所示位置的可及淋巴结。使用一对镊子夹住淋巴结，同时用另一对镊子分离周围组织，可便于完整取出。将组织置于收集皿中。
5. 采集图1所示位置的脾脏。此步骤需小心切开腹膜以暴露脾脏。将组织置于收集皿中。
6. 若需采集更多组织，可重复上述操作；否则进入下一步。此后所有操作均需在冰上进行，直至分选后的T细胞接种。

3. 组织处理与CD4⁺富集

1. 将淋巴结和脾脏分别在不同的培养皿中处理，以提高得率，因为淋巴结细胞制备无需进行红细胞裂解，而红细胞裂解可能导致少量白细胞死亡。因此，以下步骤描述了一种分别处理脾脏和淋巴结细胞群体，随后在分选标记前合并的方法。
2. 将组织（脾脏或合并的淋巴结）从收集皿中取出，放入一个新的含有3 ml PBS+的60 mm培养皿中。使用无菌镊子将一片无菌尼龙网覆盖在组织上。
3. 取一个注射器活塞（3–10 ml）的拇指端，轻轻将组织在尼龙网上研磨，使几乎所有组织进入悬液状态。或者，也可将组织置于两片经高压灭菌的磨砂玻片之间，研磨成悬液。
4. 用移液器将悬液上下吹打数次，以打散残留的可溶性团块。在15 ml锥形管管口覆盖一片新的尼龙网，过滤悬液以去除残留碎片。
5. 对额外的淋巴结和脾脏组织重复步骤2–4。
6. 待悬液过滤至15 ml离心管后，用PBS+补满管体积，轻轻颠倒混匀数次。在4 ^oC条件下以475 × g离心5分钟。
7. 对于脾脏细胞，离心后吸除上清液，将细胞沉淀用每只小鼠1 ml冰浴的1× ACK溶液重悬，裂解红细胞1分钟。然后加入10 ml PBS+覆盖ACK溶液，颠倒混匀，再在4 ^oC条件下以475 × g离心5分钟。
8. 对于淋巴结细胞，离心后吸除上清液，用2 ml PBS+重悬。如需合并，可在脾脏细胞完成ACK裂解和洗涤步骤后，将淋巴结细胞悬液与之混合。
9. 脾细胞离心后吸除上清液，再用10 ml PBS+重悬。此时，若分选需要合并组织，可将淋巴结悬液加入脾脏悬液中。再次在4 ^oC条件下以475 × g离心5分钟。
10. 现在可对细胞沉淀进行CD4富集处理。若不进行此步骤，则直接进入分选前准备步骤。
11. 若使用高速磁性细胞分选系统进行CD4富集，需用CD4磁珠重悬细胞沉淀。通常每只小鼠的组织使用15 μl磁珠稀释于85 μl PBS+中进行标记。根据需要按比例增加磁珠混合物体积，重悬细胞沉淀，并在4 ^oC孵育15–30分钟。
12. 用10 ml PBS+洗涤细胞，将悬液经尼龙网过滤至新的15 ml离心管以去除碎片，再在4 ^oC条件下以475 × g离心5分钟。
13. 按每只小鼠100 μl PBS+重悬细胞沉淀，随后进行高速磁性细胞分选系统的阳性筛选。若使用手动分离系统，请遵循制造商提供的富集操作说明。或者，也可将样品重悬于FACS缓冲液中：含1 mM EDTA（pH = 8）和1% BSA的PBS溶液，经无菌过滤。
14. 收集阳性组分，并用10 ml PBS+再次洗涤。富集得到的CD4⁺细胞组分现已准备好进行标记分选。

4. 分选初始型CD4⁺ T细胞

1. 使用含有针对 CD62L、CD44、CD25 和 CD4 的荧光抗体的 PBS+ 标记细胞沉淀。如果使用 表 1 中列出的抗体，其各自的稀释比例已在表中提供。每只小鼠的组织染色时，使用 100 μl 抗体混合液。
2. 将沉淀重悬于抗体混合液中，在 4 ^oC 避光孵育 15–30 分钟。
3. 用 10 ml PBS+ 洗涤细胞，在 4 ^oC 以 475 × g 离心 5 分钟。
4. 将混合物再次通过尼龙滤膜或带滤网的离心管帽，以去除残留碎片。用移液器将标记后的细胞转移至适用于流式细胞分选仪的收集管中。分选前将细胞置于冰上并避光保存。
5. 在适用于流式细胞分选仪收集的试管底部加入 1–2 ml 完全 RPMI 培养基或胎牛血清（FBS），以准备收集管。
6. 根据 CD4⁺CD25^-CD62L⁺CD44^- 表型分选初始型 CD4⁺ T 细胞（图 2）。用完全 RPMI 培养基洗涤收集的细胞，并按上述条件离心。
7. 将细胞沉淀重悬于完全 RPMI 培养基中，计数初始型 T 细胞数量，并调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/ml。

5. 设置 体外 分化

1. 吸去抗CD3和抗CD28包被板各孔中的液体，并用1 ml无FBS的无菌PBS洗涤每孔。对于48孔板，每孔加入0.5 ml RPMI培养基，接种0.5 × 10⁶ 个细胞/孔；对于24孔板，每孔加入1.0 ml RPMI培养基，培养1 × 10⁶ 个细胞/孔。
2. 若需检测某种因素（如药物）的影响，可根据实验设计在分化过程前、过程中或后将待测物质加入相应的孔中。随后，根据需要在培养基中补充相应的细胞因子和阻断性抗体：Th0：30 U/ml hIL-2；Th1：15 ng/ml rmIL-12、30 U/ml hIL-2 和 5,000 ng/ml 11B11；Th2：10 ng/ml rmIL-4、30 U/ml hIL-2、2,000 ng/ml 可溶性37.51 和 5,000 ng/ml XMG1.2；iTreg：15 ng/ml hTGFβ、30 U/ml hIL-2、5,000 ng/ml XMG1.2 和 5,000 ng/ml 11B11；Th17：20 ng/ml rmIL-6、3 ng/ml hTGFβ、5,000 ng/ml XMG1.2 和 5,000 ng/ml 11B11。
   注意：上述条件在本研究的分化实验终点检测细胞因子产生时被证实为最优条件（见代表性结果部分）。然而，各实验室应根据自身条件对每种培养体系进行优化（表2）。此外，本实验室发现，在使用包被型抗CD28的基础上额外添加可溶性抗CD28抗体可增强Th2细胞因子的产生，但对其他T细胞亚群无显著影响：
3. 将培养板置于37 ^oC、5% CO₂ 条件下孵育4–5天，之后进行基因表达和细胞因子产生的分析。或者，在TCR刺激2天后将细胞转移，用新鲜培养基调整细胞密度至1 × 10⁶ 个细胞/ml，并接种至新的未包被孔中，以促进细胞增殖并提高最终产量。在此情况下，无需添加新的极化细胞因子和抗体，但应在新培养基中添加10 U/ml IL-2，适用于Th0、Th1、Th2和iTreg培养。

6. 分化分析

1. 通过流式细胞术进行细胞因子分析时，在含有高尔基体抑制剂（如布雷菲德菌素A）的条件下，用10 ng/ml PMA和1,000 ng/ml离子霉素或1 μg/ml抗CD3抗体对每个孔进行再刺激，持续4–6小时（表1）。根据实验需求进行细胞内细胞因子染色（图3）。
   注意：对于Th17培养体系，应针对每种条件染色非谱系特异性的细胞因子或转录因子，例如IL-4（未展示）和IFNγ（图3），作为阴性对照并评估分化效率。此外，由于添加TGFβ可能诱导Treg细胞的伴随发育，建议对Th17培养物同时染色Foxp3。
2. 对于蛋白质定量，收集各孔的上清液，并使用细胞因子特异性ELISA进行检测（图3）。如果怀疑待测因子相对于对照样本影响了细胞增殖，则可将细胞洗涤、计数并归一化后，再用1 μg/ml抗CD3抗体再刺激24小时，随后收集上清液用于ELISA检测。若检测来自Th2诱导条件下的IL-4，必须进行洗涤和再刺激步骤，以去除初始分化培养中可能残留的IL-4。
3. 通过实时PCR进行基因表达分析时，在孵育结束后收获细胞，洗涤、归一化，并在收获mRNA前用1 μg/ml抗CD3抗体再刺激2–6小时（图3）。

结果

分析分化的时相点可根据所测试的 Th 条件以及 T 细胞受体激活的强度而有所不同。经过 2-3 天的分化后，可通过光学显微镜观察细胞，以确定 T 细胞增殖的程度。增殖显著且细胞成团的孔，通常在第 4 天即可准备进行分析。依赖外源性 IL-2 添加的分化条件（如 Th1 和 Th2）在培养 4 天后可能会耗尽培养基。为了最大化细胞因子的产生，可对培养基耗尽的孔补充含有 IL-2 的新鲜 RPMI 培养基，或将其细胞计数后以每孔 1 × 10⁶ 个细胞的密度重新接种至含 IL-2 的新鲜 RPMI 培养基中，从而将分化时间延长一至两天。

图1. 固定小鼠以分离脾脏和淋巴结时固定针位置的示意图。

讨论

尽管脾脏中含有初始型 Th 细胞，但淋巴结中该细胞群体的比例要高得多。若在本实验方案中未能正确识别并去除淋巴结，将导致初始型细胞得率低下。这一操作在老年小鼠或脂肪组织较多的雄性小鼠中尤其困难。如图1所示，正确固定并展开动物的四肢和皮肤，有助于更清晰地观察体表可及的淋巴结。在获取淋巴结和脾脏组织后，细胞分选是获得高纯度初始型 CD4⁺ T 细胞群体的首选方法。高纯度至关重要，可防止自然调节性 T 细胞（nTregs）或效应型及记忆型 Th 细胞对初始型 T 细胞的分化过程产生干扰。获得高得率初始型 T 细胞的困难通常源于组织收集与处理效率低下，或在分离步骤中细胞丢失。为提高得率，务必使用预冷缓冲液并在冰上进行孵育操作。此外，为防止在富集和/或分选过程中细胞丢失，建议预先优化所用试剂及分离方案。最后，如实验步骤中多处提及，各实验室在开展大规模实验前，应针对自身条件优化细胞分化培养条件（表2）。

如图2所示，初始型CD4⁺ T细胞可轻松区别于自...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全 RPMI 培养基：			在37℃下预热 o使用前将水浴预热至 C
RPMI 1640培养基	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000倍 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985023
100X 青霉素-链霉素溶液	Life Technologies	15140122
100X L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030081
120 微米尼龙网筛	亚马逊	CMN-0120-10YD	切成 2 cm2 方格与高压灭菌
替代方案：100 微米细胞滤筛	Fisher	08-771-19	尼龙网切割的替代方法
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi	130-091-221	在37℃下保温 o使用前将水浴锅预热至指定温度
autoMACS 冲洗液	Miltenyi	130-091-222	在37℃下预热 o使用前将水浴锅预热至 C
CD4 磁珠	Miltenyi	130-049-201
ACK裂解缓冲液	Life Technologies	A10492-01
细胞因子：
人（h）IL-2	Peprotech	200-02
重组小鼠（rm）IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
抗体：
2C11（抗-CD3）	BioXcell	BE0001-1
37.51（抗-CD28）	BioXcell	BE0015-1
11B11（抗IL-4）	BioXcell	BE0045
XMG1.2（抗IFNγ）	BioXcell	BE0055
抗-CD62L-FITC	BioLegend	104406	以1:100的比例使用
抗CD25-PE	BioLegend	102008	以1:400使用
抗-CD4-PerCP	BioLegend	100434	使用比例为1:1000
抗CD44-APC	BioLegend	103012	以1:500使用
佛波醇  佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P-8139	用DMSO配制0.1 mg/ml的母液，并分装后于-20℃保存 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	用DMSO配制0.5 mg/ml的母液，并分装后于-20℃保存 oC
布雷菲德菌素A	eBioscience	00-4506-51	以1:1000比例使用