小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

摘要

初始CD4⁺ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4⁺ T细胞向不同效应亚群分化，可通过添加T细胞受体刺激信号和特定的细胞因子信号实现。

摘要

抗原未暴露（初始）CD4⁺ T细胞在T细胞受体（TCR）识别由MHC II类分子呈递的同源抗原时，会发生扩增并分化为效应亚群。TCR激活时微环境中存在的细胞因子信号是决定初始CD4⁺ T细胞效应命运的主要因素。⁺ T细胞。尽管初始T细胞活化过程中的细胞因子环境可能十分复杂，并涉及冗余和相互拮抗的信号 体内，不同细胞因子组合的添加在初始CD4⁺ T细胞激活 体外 可有效促进效应T辅助细胞谱系的建立，并表现出特征性的细胞因子和转录因子表达。此类分化实验通常被用作评估被认为可促进或抑制特定CD4⁺ T细胞亚群发育的靶点的第一步。⁺ 辅助性T细胞亚群。在分化过程中加入信号激动剂、拮抗剂或其他细胞因子等调节分子，也可用于研究特定靶点对T细胞分化的影响。本文描述了一种从小鼠中分离初始T细胞的基本实验方案，以及将初始T细胞极化为不同辅助性T细胞效应亚型所需的后续步骤。 体外.

引言

CD4细胞不同谱系或亚群的概念⁺ 辅助性T细胞（Th细胞）自20世纪后半叶以来一直被研究^th 世纪¹在共刺激信号存在的条件下，识别同源抗原可导致细胞经历多轮增殖，最终分化为效应性Th细胞。在此过程中生成的Th细胞类型取决于激活时所处的细胞因子环境。²最初，初始型 Th 细胞被认为在 T 细胞受体（TCR）激活、共刺激分子 CD28 结合以及细胞因子信号传导后，会极化为两种不同的谱系。1 型辅助细胞（Th1）的特征是在分化过程中依赖 IL-12 信号通路，并以效应因子形式产生细胞因子 IFNγ^3,4最终发现，已分化的 Th1 细胞具有一种最显著的遗传特征，即表达 T 盒家族转录因子。 Tbx21 （T-bet），被认为是Th1遗传程序的主要调控因子⁵此外，IL-12 和 IFNγ 均可促进 T-bet 的表达。^6,7在免疫应答中，Th1细胞对于宿主抵御胞内病原体具有重要作用，同时也是自身免疫性炎症的强效促进者。相比之下，2型辅助细胞（Th2）的发育依赖于IL-4，其效应细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13，在驱动B细胞应答中发挥关键作用，并在过敏反应中具有致病性。^8,9与Th1细胞类似，Th2细胞也被发现表达其特有的主要转录调控因子，称为GATA-3。^10,11有趣的是，极化性细胞因子的存在以及特定Th细胞谱系的形....

方案

所有实验操作均按照罗莎琳德·富兰克林医学与科学大学环境健康与安全部门批准的方案进行。本方案所用的C57BL/6小鼠（购自NCI）饲养于特定病原体-free环境中，所有动物实验均按照罗莎琳德·富兰克林医学与科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 仪器、耗材和试剂的准备

1. 在无菌 PBS 中用抗 CD3 和抗 CD28 抗体包被 48 孔或 24 孔板（表 1），覆盖后用封口膜包裹以防止蒸发和污染，于 T 细胞分离前一日在 4 ^oC 过夜孵育。或者，可在 37 ^oC 孵育 1 小时完成包被。进行 Th0、Th1、Th2 和 iTreg 条件时，在 0.5–1 ml 总体积（48 孔板）中以每种抗体 1 μg/ml 的浓度包被抗 CD3 和抗 CD28。对于 Th17 条件，通常使用 2 μg/ml 抗 CD3 和 1 μg/ml 抗 CD28 进行包被。
   注意：我们发现较低浓度的抗 CD3 更有利于 Th1、Th2 和 iTreg 的生成，而较高浓度的抗 CD3 更有利于 Th17 的生成。因此，抗 CD3 和抗 CD28 的浓度应根据各实验室的具体情况进行滴定和优化（表 2）。
2. 通过高压灭菌或消毒液对一套解剖器械（剪刀和镊子）进行灭菌。在每次解剖之间，需准备一个装有 70% 乙醇的试....

结果

分析分化的时点可能因所测试的Th条件以及T细胞受体激活的强度而异。在分化2-3天后，可通过光学显微镜观察细胞，以确定T细胞增殖的程度。若孔中出现明显的增殖和细胞聚团现象，则这些孔很可能在第4天即可进行分析。依赖外源性IL-2添加的分化条件（如Th1和Th2）在培养4天后可能会导致培养基耗尽。为了最大化细胞因子的产生，可对培养基耗尽的孔补充含有IL-2的新鲜RPMI培养基，或将其细胞计数后以每孔1 × 10⁶个细胞的密度重新接种于含IL-2的新鲜RPMI培养基中，从而将分化时间延长一至两天。

讨论

尽管脾脏中含有初始型 Th 细胞，但淋巴结中该细胞群体的比例要高得多。若在本实验方案中未能正确识别并去除淋巴结，将导致初始型细胞得率低下。这一操作在老年小鼠或脂肪组织较多的雄性小鼠中尤其困难。如图1所示，正确固定并展开动物的四肢和皮肤，有助于更清晰地观察体表可及的淋巴结。在获取淋巴结和脾脏组织后，细胞分选是获得高纯度初始型 CD4⁺ T 细胞群体的首选方法。高纯度至关重要，可防止自然调节性 T 细胞（nTregs）或效应型及记忆型 Th 细胞对初始型 T 细胞的分化过程产生干扰。获得高得率初始型 T 细胞的困难通常源于组织收集与处理效率低下，或在分离步骤中细胞丢失。为提高得率，务必使用预冷缓冲液并在冰上进行孵育操作。此外，为防止在富集和/或分选过程中细胞丢失，建议预先优化所用试剂及分离方案。最后，如实验步骤中多处提及，各实验室在开展大规模实验前，应针对自身条件优化细胞分化培养条件（表2）。

如图2所示，初始型CD4⁺ T细胞可轻松区别于自.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全 RPMI 培养基：			在37℃下预热 o使用前将水浴预热至 C
RPMI 1640培养基	Life Technologies	11875119
10 % FBS	Life Technologies	26140-079
1000倍 2-巯基乙醇	Life Technologies	21985023
100X 青霉素-链霉素溶液	Life Technologies	15140122
100X L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030081
120 微米尼龙网筛	亚马逊	CMN-0120-10YD	切成 2 cm2 方格与高压灭菌
替代方案：100 微米细胞滤筛	Fisher	08-771-19	尼龙网切割的替代方法
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi	130-091-221	在37℃下保温 o使用前将水浴锅预热至指定温度
autoMACS 冲洗液	Miltenyi	130-091-222	在37℃下预热 o使用前将水浴锅预热至 C
CD4 磁珠	Miltenyi	130-049-201
ACK裂解缓冲液	Life Technologies	A10492-01
细胞因子：
人（h）IL-2	Peprotech	200-02
重组小鼠（rm）IL-4	Peprotech	214-14
rmIL-6	R & D Systems	406-ML-025
rmIL-12	Peprotech	210-12
hTGFb	R & D Systems	240-B-010
抗体：
2C11（抗-CD3）	BioXcell	BE0001-1
37.51（抗-CD28）	BioXcell	BE0015-1
11B11（抗IL-4）	BioXcell	BE0045
XMG1.2（抗IFNγ）	BioXcell	BE0055
抗-CD62L-FITC	BioLegend	104406	以1:100的比例使用
抗CD25-PE	BioLegend	102008	以1:400使用
抗-CD4-PerCP	BioLegend	100434	使用比例为1:1000
抗CD44-APC	BioLegend	103012	以1:500使用
佛波醇  佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P-8139	用DMSO配制0.1 mg/ml的母液，并分装后于-20℃保存 oC
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I-0634	用DMSO配制0.5 mg/ml的母液，并分装后于-20℃保存 oC
布雷菲德菌素A	eBioscience	00-4506-51	以1:1000比例使用