病毒介导的内侧神经节隆起（MGE）细胞标记与移植 体内 研究

摘要

GABA能皮层中间神经元前体细胞在移植后可扩散、发育并突触整合到宿主皮层中。这些细胞在移植前易于进行转导，可用于基因修饰GABA能前体细胞的体内研究。本文展示了利用现有的Cre品系和Cre依赖型报告基因，通过病毒标记技术靶向特定中间神经元亚群的方法。

摘要

源自胚胎期内侧和尾侧神经节隆起（MGE 和 CGE）的 GABA 能皮层中间神经元在功能和形态上具有高度多样性。尽管在理解不同皮层中间神经元亚群的作用方面已取得进展，但仍有许多机制尚未阐明，这些机制可能参与不同类型 GABA 能细胞的发育与成熟过程。此外，GABA 能信号通路的异常可能与自闭症、精神分裂症和癫痫等疾病的表型相关。特异性的 Cre 驱动小鼠品系已开始用于解析独特中间神经元亚群的功能。然而，尽管小鼠模型取得了进展，利用分子生物学方法高效研究 GABA 能皮层中间神经元前体细胞仍面临挑战。 关键词：GABA 能神经元，皮层中间神经元，神经节隆起，MGE，CGE，Cre 驱动小鼠模型，自闭症，精神分裂症，癫痫，前体细胞，分子机制 体内一种用于研究这些细胞自主编程的重要技术是将MGE细胞移植到宿主大脑皮层中。这些移植的细胞能够广泛迁移、分化并实现功能性整合。此外，MGE细胞在移植前可高效地通过慢病毒进行转导，从而支持多种分子生物学研究方法。本文详细描述了一种在移植前高效转导MGE细胞的实验方案 体内 分析，利用现有的Cre驱动小鼠品系和Cre依赖性表达载体。该方法的优势在于，它将精确的遗传操作与这些细胞在移植后的广泛分布能力相结合，从而实现更高细胞类型特异性的解析度 体内.

引言

GABA能皮层中间神经元约占哺乳动物新皮层神经元的20-30%，其余为兴奋性谷氨酸能主神经元。中间神经元在电生理特性、轴突和树突形态以及突触靶向上具有高度多样性 ¹，且兴奋性/抑制性张力失衡被认为是一些神经/神经精神疾病（包括自闭症、精神分裂症和癫痫）表型的潜在机制 ²本方案的总体目标是在移植前高效地对GABA能皮层中间神经元前体进行遗传学修饰 体内 分析。

皮层GABA能中间神经元起源于内侧和尾侧神经节隆起（MGE和CGE）^3,4，以及视前区⁵。皮层中间神经元前体细胞首先经历长距离的切向迁移，随后进行径向迁移，以到达其最终靶区。到达目的地后，这些中间神经元必须正确整合到已有的神经网络中，而每个独特的中间神经元亚群将以特定方式参与皮层环路的构建。根据分子标记可区分出四个主要亚群：MGE来源的生长抑素（SST）⁺和小清蛋白（PV）⁺亚群，以及CGE来源的血管活性肠肽（VIP）⁺和Reelin⁺;SST^-亚群⁶。不同的皮层中间神经元亚群在胚胎发育不同时段由MGE和CGE产生^7,8。这些及其他皮层GABA能中间神经元标记物已被用于构建多个亚群特异性的Cre驱动小鼠品系^9-11。

方案

伦理声明：以下操作步骤已获得本机构及动物实验方案的批准。在开始实验前，务必确保所有涉及存活手术的操作均已获得批准，并核实所有方案均为最新有效版本。

1. 慢病毒制备（可选步骤）

1. 将每种待制备的慢病毒分别接种于三块10 cm培养板的HEK293T细胞中，每板加入10 ml DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达约60–70%。将细胞置于37℃培养箱中培养。 °C，5% CO₂₂.
2. 转染以下DNA质粒（10 µg 总量）加入到每个孔板中，可使用任何转染试剂：6.4 µg CAG-Flex-GFP 慢病毒载体（DNA 载体序列见表 1），1.2 µpMD2.G（编码VSV-g），1.2 μg µg pRSV-Rev 和 1.2 µg pMDLg/pRRE。这三种慢病毒包装载体可商业获得（表
   注意：本特定方法使用第三代慢病毒载体，但第二代载体及相关质粒同样适用。
3. 在BSL2级认证的生物安全柜中准备一个含有10%次氯酸钠溶液的废液容器，用于灭活接触过或含有慢病毒的溶液或器械。随后，在4–6小时后完全移除培养基 转染后放入漂白溶液中，随后替换为等体积的新培养基，并让细胞继续生长。
4. 4 天后，将培养基收集到 50 ml 锥形管中，在 1,000 × g 离心 15 分钟，以沉淀所....

结果

由于MGE细胞在移植到宿主新皮层时具有独特的迁移和整合能力 ¹⁶，它们为遗传操作提供了极佳的模型系统 体内 研究中。在此，我们展示了如何从E13.5胚胎中分离MGE组织（图1和图2），随后可用慢病毒进行转导 体外 或在移植前快速进行 体内 研究。此前已通过慢病毒对MGE进行标记，利用增强子在GABA能神经元中驱动GFP表达 ¹⁵然而，在移植前于异质性细胞群体中特定亚群内表达基因的能力，将极大促进对这些细胞扩散与整合特性的研究。本文旨在建立一种方法，实现荧光蛋白在特定中间神经元亚群——即表达生长抑素（SST）的中间神经元——中的靶向表达。⁺.

我们首先亚克隆了一种市售的Cre依赖型GFP报告载体（载体信息， 表2将包含两侧带有 loxP 位点的 GFP 表达盒插入慢病毒载体骨架中。该载体的构建首先通过亚克隆从 AAV 载体中获取两侧带有 loxP 位点的 GFP 表达盒，随后将其连接至慢病毒载体骨架.......

讨论

来自胚胎期纹状体隆起（GEs）的GABA能皮层中间神经元前体细胞在基于细胞的治疗多种疾病方面已展现出良好前景^12–14。为了追踪特定中间神经元亚群并使其表达目的基因，需要精确的分子技术。本文提供了一种在移植前利用慢病毒标记胚胎期MGE细胞的详细方案，并展示了该技术如何用于在特定皮层中间神经元亚群中表达目的基因，以进行体内分析。

本文所述方案可被可靠地使用，但为了获得最佳的可重复性，必须遵循几个关键步骤。首先，为了实现高效的病毒转导，必须维持生理温度和pH值。若满足这些条件，MGE细胞可在约30分钟内完成转导。其次，在进行移植前，务必确保获得致密的MGE细胞沉淀。这一点非常重要，因为在不造成组织损伤的前提下，每次注射至新生小鼠脑内的体积有限，且细胞会从注射部位迁移出去，因此移植时细胞的密度并不像预期那样关键。最后，可使用表达荧光报告基因的MGE细胞进行若干预实验，以确定最佳的注射深度。尽管本方案使用了MGE细胞，但CGE细胞也可采用相同的方法进行操作。一个局限性在于，目前尚缺乏能够特异性限制在全部CG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MGE细胞移植所需的试剂与设备
1 ml 注射器	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G 针头	305106	BD, Becton Dickinson and company
精密微量注射针头，用于递送 5 µl（附带推杆）	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm 封口膜	PM-999	Polysciences, Inc.
带臂式支架的体视显微镜 **	MZ6	Leica
数字式小鼠立体定位仪 **	51725D	Stoelting company
单轴油压精细操纵器 **	MO-10	Narishige
金刚石涂层旋转切削仪		自制
针状移液器拉制仪	730	Kopf instruments
矿物油		任意药店或药房
可准确量取 1 µl 体积的移液器及吸头
** 上述为本研究中使用的特定型号，但其他类似设备亦可适用
可选试剂（用于制备慢病毒）
25 mm，0.45 µm 滤膜	09-719B	Fisher Scientific
超透明离心管（25 x 89 mm）	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 （1.5 ml 规格）	11668019	Invitrogen
其他市售试剂
编码 gag/pol 的 pMDLg/pRRE 质粒	12251	Addgene
编码 Rev 的 pRSV-Rev 质粒	12253	Addgene
编码 VSVG 的 pMD2.G 质粒	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene