本文描述了建立同基因型小鼠原位膀胱肿瘤模型的方法，用于评估细菌蛋白HP-NAP的抗肿瘤功效。
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本文内容
摘要
摘要
膀胱癌是泌尿生殖道最常见的恶性肿瘤之一。膀胱内注射卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）是治疗高级别非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的金标准。然而，由于该治疗相关副作用较为显著，因此需要开发具有更佳获益/副作用比的新型生物反应调节剂。
肿瘤微环境可影响肿瘤的发生发展及治疗效果。为了获得良好的模型，最好将肿瘤细胞植入其来源器官中。
在本实验方案中，我们描述了一种在雌性小鼠膀胱腔内建立肿瘤并随后递送治疗剂的方法；后者以我们使用的方法为例说明 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）。首先通过尿道插管对黏膜造成初步化学灼伤，随后经同一途径注入小鼠膀胱移行细胞癌MB49细胞系，使细胞附着于膀胱黏膜。在给予一定时间以允许细胞初始增殖后，通过插管再次给予HP-NAP治疗。通过比较对照组与HP-NAP处理组动物的肿瘤体积、坏死范围及血管化程度，评估HP-NAP的抗肿瘤活性。
引言
膀胱癌是泌尿生殖道最常见的癌症之一，美国每年新增病例近7.5万例1。由于复发率高，患者需要终身随访，这使得膀胱癌成为治疗成本最高的癌症之一。对于高级别非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），目前的金标准治疗方案是经尿道膀胱肿瘤切除术，随后进行卡介苗（BCG）膀胱内免疫治疗。尽管BCG抗肿瘤作用的确切机制尚未完全阐明，但普遍认为，激活以辅助性T细胞（Th）1和细胞毒性T细胞（Tc）1为主的细胞介导免疫反应，对治疗成功至关重要2。
尽管卡介苗（BCG）仍是治疗非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的首选疗法，但仍有相当高比例的患者对该治疗无反应；此外，该疗法可能引发多种副作用：约70%的治疗后肿瘤在一段时间后复发，约15%进展为肌层浸润性膀胱癌。与BCG治疗相关的其他副作用包括排尿困难、膀胱炎和肾感染3-6。
新型治疗策略的开发在初始阶段之后，必须考虑采用临床前模型 体外 评估；这一点在肿瘤中尤为相关，因为其微环境可显著影响肿瘤的发展及对治疗的反应性。
在过去十年中，我们研究了幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）产生的一种蛋白质HP-NAP的多种免疫调节活性。该蛋白质最初被发现能够促进多形核细胞（PMNs）与血管内皮的黏附7。从结构上看，HP-....
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方案
所有动物操作程序均已获得意大利卫生部批准（D.M. 204/2011-B）。
1. 动物
- 培养 将C57BL/6J雌性小鼠在带微隔离过滤器的独立通气笼具中饲养至8周龄。
注意：优先选择雌性，因为其外泌尿生殖器官的解剖结构使得导管插入比雄性更容易。
2. 细胞培养
- 在添加了10%热灭活胎牛血清和50 µg/ml庆大霉素的RPMI 1,640培养基中，于37 °C、湿润的5% CO2条件下培养小鼠膀胱移行细胞癌MB49细胞系。
- 将MB49细胞在T-75培养瓶中培养至80%汇合度。消化后重悬于150 μl PBS中，调整细胞密度为0.5 × 105 - 0.5 × 106 个细胞，用于小鼠体内接种。
3. 膀胱内肿瘤植入
- 通过腹腔注射 zoletil（33 mg/kg）和 xylor（20 mg/kg）的混合麻醉剂对小鼠进行麻醉。
- 将动物置于仰卧位，并用透明胶带将其后肢固定在垫子上。足部需充分分开，以便尿道外口清晰可见且易于插入导管。
- 注意：对于8至10周龄的小鼠，导管插入可选用24 G儿科静脉导管。导管的选择至关重要，以....
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结果
图1展示了导管插入技术；小鼠通过导管接种0.5 × 106个MB49细胞。在肿瘤细胞注射后3天开始HP-NAP治疗，以允许肿瘤细胞附着于膀胱壁并增殖。对照组中的所有动物均会形成肿瘤；部分小鼠可能因尿道阻塞而在13天实验周期结束前死亡。
首次注射HP-NAP后，动物每三天接受一次处理，共注射四次。实验第十三天结束时，处死动物并收集膀胱组织用于组织学和免疫组织化学分析。如图2A所示，经HP-NAP处理的小鼠膀胱内肿瘤体积显著小于对照溶剂处理小鼠（220 ± 62 mm3 vs 830 ± 180 mm3）。
有趣的是，在溶剂处理的动物中，肿瘤会侵入下方的脂肪组织，而在8只经HP-NAP处理的动物中的7只，肿瘤被限制在膀胱壁内（图2B）。最后，与对照组动物相比，经HP-NAP处理的小鼠肿瘤血管生成减少，坏死范围增大（图2B
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讨论
癌症治疗领域的大多数进展在启动临床试验前都需要经过动物模型的测试。研究肿瘤生物学的可能性 体内利用动物模型，为研究癌症发病机制的研究人员提供了一种关键工具，能够评估不同的治疗策略。原位模型仍是金标准14-15，这不仅因为有大量可用的细胞系可用于建立肿瘤模型，还因为其能够模拟天然肿瘤的微环境16.
此外，如本文所述，在同源小鼠中建立癌的原位模型，对于旨在研究基于免疫疗法的新治疗策略的研究尤其重要，因为此类研究无法在接受异种移植的免疫缺陷小鼠中进行。
本方案中描述的方法涉及对雌性小鼠尿道进行插管，从而允许将肿瘤细胞接种以及将治疗剂注入膀胱腔内。
通过酸性灼伤（如上所述，而非其他方法，如使用胰蛋白酶或聚赖氨酸）对膀胱壁进行预处理的优势在于，能够促进形成体积大且高度侵袭性的肿瘤。相反，使用胰蛋白酶和聚赖氨酸进行预处理则会产生较小且侵袭性较低的肿瘤，这可能是由于这些物质的残留物对肿瘤细胞活力具有不利影响17
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由意大利癌症研究协会、意大利大学与研究部、Prin项目和大学研究项目（资助编号：N）提供支持° CPDA137871，Fondazione Cariplo，资助编号 N° 2011-0485号资助予MdB，以及帕多瓦大学青年学者资助予Gaia Codolo。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| C57BL/6J 雌性小鼠 | Harlan Italy (意大利乌迪内) | ||
| MB49 细胞 | 由美国爱荷华大学卡弗医学院 O'Donnel 教授提供，美国爱荷华州 | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X，需用无热原水稀释 |
| 培养瓶 | Becton Dickinson (美国新泽西州富兰克林湖) | 353135 | |
| 1 ml 注射器 | Becton Dickinson | 301358 | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆) | ||
| 庆大霉素 | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (意大利米兰) | 2% 赛拉嗪 | |
| Zoletil | Virbac (法国卡罗斯) | 359713301992 | 5% 唑拉西泮 + 5% 替来他明 |
| 24G 导管 | Terumo (意大利罗马) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (意大利米兰) | 403871 | 液体 |
| NaOH | JT Baker (美国宾夕法尼亚州森特瓦利) | 10095011 | 粉末 |
| 设备 | |||
| 手术刀 | Albion Surgical Limited (英国谢菲尔德) | ||
| 切片机 | Leica Microsystem (德国韦茨拉尔) | RM2235 | |
| 显微镜载玻片 | VWR International (美国宾夕法尼亚州拉德诺) | 631-0108 | |
| 图像分析仪 | Zeiss (德国耶拿) | Cyres System |
参考文献
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. ....
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重印与许可
