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方法文章

在96孔微孔板中测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氧化应激抗性

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DOI：

10.3791/52746

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2015年5月9日

 , 
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

本文内容

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摘要

C. elegans 是研究参与氧化应激抵抗的信号转导通路的一种理想模式生物。本文提供了一种在液体环境中利用96孔板和多种氧化剂测定 C. elegans 线虫氧化应激抗性的实验方案。

摘要

氧化应激是由于活性氧的产生与解毒之间失衡所致，是多种人类慢性疾病的重要诱因，包括心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、衰老和癌症。因此，不仅需要在细胞体系中，也需利用完整生物体来研究氧化应激。C. elegans 是研究氧化应激信号转导通路遗传机制的理想模式生物，这些通路在进化上高度保守。

本文提供了一种在液体环境中测定秀丽隐杆线虫（C. elegans）氧化应激抗性的实验方案。简言之，将诱导活性氧（ROS）的试剂（如百草枯（PQ）和 H2O2）溶解于 M9 缓冲液中，并将溶液分装至 96 孔微孔板的各孔中。将同步化的 L4 期/年轻成虫期 C. elegans 转移至各孔（每孔 5–8 条线虫），随后每小时记录一次存活情况，直至大多数线虫死亡。在使用低浓度应激物进行板上氧化应激抗性检测时，动物的衰老过程可能影响其对氧化应激的反应行为，从而导致数据解读出现偏差。然而，在本研究所描述的检测方法中，由于仅使用 L4 期/年轻成虫期线虫，该问题几乎不会发生。此外，该方案成本低廉，且可在一天内获得结果，因此适用于遗传筛选。总体而言，该技术将有助于阐明氧化应激信号转导通路，进而推动对与氧化应激相关的人类疾病的更深入表征。

引言

在真核生物中，发生于线粒体电子传递链中的氧化磷酸化是产生ATP形式能量的主要途径。活性氧（ROS）是该过程的天然副产物。尽管ROS作为信号分子具有重要作用，但过量的ROS可导致DNA损伤、蛋白质羰基化和脂质氧化。ROS的生成与解毒之间的失衡会引起氧化应激，进而导致能量耗竭、细胞损伤，并触发细胞死亡1,2。氧化应激参与衰老过程，并与多种危及生命的疾病的发生发展相关，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病3-9。

细胞已经进化出酶性和非酶性防御机制，以维持适当的活性氧（ROS）水平，并保护其组分免受氧化损伤1,2。超氧化物歧化酶（SOD）首先将超氧阴离子转化为H2O2，后者再由过氧化氢酶或过氧化物酶进一步转化为水。非酶性防御机制主要包括一些与活性氧反应速度比细胞大分子更快的分子，从而保护关键的细胞组分。尽管ROS解毒酶具有保护作用，但仍有一些ROS分子会逃逸抗氧化防御系统，导致氧化损伤。在氧化应激过程中，对受损细胞组分的检测、修复和降解是至关重要的防御策略1,2。

参与应激抵抗、特别是氧化应激的信号通路在进化上高度保守10,11。与只能部分模拟生物体条件的细胞培养实验不同，在模式生物中研究氧化应激具有重要意义12,13。C. elegans 是一种自由生活的线虫，可在琼脂培养基上的细菌菌苔中方便且低成本地培养。其体型微小（长约1 mm），通常以自体受精的雌雄同体形式生长，有利于遗传操作。它具有快速的生活周期和高繁殖能力，每代可产生约300个子代，使其成为进行大规模遗传筛选的有力工具14。C. elegans 基因组已完全测序，其中40%-50%的基因被预测为与人类疾病相关基因的同源基因15-18。在C. elegans中利用RNAi敲低目的基因快速且简便。通过喂食携带表达靶向目的mRNA的双链RNA质粒的E. coli细菌，即可实现基因表达下调19。因此，利用大规模RNAi筛选来确定基因功能，对理解包括癌症在内的多种人类疾病具有重大影响20,21。

对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中氧化应激抗性的研究已揭示了保守的氧化应激抗性机制13,22。所发现的一些通路是共同通路，不仅调节寿命，还调节对其他应激（如缺氧、热应激和渗透压应激）的抗性。这些通路包括胰岛素信号通路、TOR信号通路和自噬通路。其他关键通路涉及活性氧（ROS）的解毒过程，例如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，或损伤修复过程，例如热休克蛋白和分子伴侣蛋白11,13,22。

本方案描述了如何测定对氧化应激的抗性 秀丽隐杆线虫 在液体中。我们使用了 flcn-1(ok975) 以及野生型动物，以演示本实验方案，因为我们先前已证明在缺失情况下对氧化应激的抵抗力增强 flcn-1(ok975) 在 秀丽隐杆线虫23我们还发现，这种增强的抗性依赖于AMPK和自噬，这一信号轴可改善细胞生物能量状态并促进应激抗性。 23PQ 是一种氧化应激剂，可干扰电子传递链，从而产生活性氧物种。24同样的检测方法可以进行调整，并可使用其他活性氧来源或产生活性氧的化合物，例如 H2O2 以及鱼藤酮。已有类似的检测方法在平板上开发，其中使用低浓度的百草枯（PQ）。25,26该检测方法的优点是操作非常快速，结果可在一天内获得。此外，与制备含百草枯（PQ）平板所需的液体体积相比，使用96孔板进行氧化应激抗性检测时所用液体总体积较小。因此，液体检测中使用的PQ量较少，使得该检测成本较低，并减少了有毒废物的产生。然而，与平板检测相比，该液体检测的局限性包括缺乏食物来源以及液体中氧气浓度低于空气中的氧气浓度。这些因素在某些情况下可能影响实验结果。因此，建议采用其他氧化应激抗性检测方法验证结果的可重复性，以支持本检测所得结论。

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方案

1. 试剂的准备

  1. 培养基的制备 秀丽隐杆线虫 生长（此处指野生型动物和 flcn-1(ok975) 突变动物）
    1. 配制 Modified Youngren's Only Bacto-peptone (MYOB) 干粉混合物，包含 5.5 g Tris HCl、2.4 g Tris 碱、31 g Bactopetone、20 g NaCl 和 0.08 g 胆固醇。充分振荡混匀。
      注意：此混合液足以配制 10 L 的 MYOB 培养基。
      注意：可使用正常生长培养基（NGM）平板代替MYOB平板27然而，为了在不同菌株之间以及不同独立重复实验之间进行有效比较，应使用相同类型的培养板。在本方案中，我们仅使用了MYOB培养板。
    2. 通过加入6 g MYOB干粉和17 g琼脂，加水定容至1 L，制备1 L MYOB培养基2O，并在122 °C下高压灭菌45分钟。倒平板后于室温静置干燥2天。
    3. 使用无菌技术，将100 ml的LB液体培养基接种 E. coli OP50 细菌并过夜培养 37 °C
    4. 在 MYOB 培养板中接种细胞 E. coli OP50 菌株。室温下培养 48 小时。
  2. 使用RNAi进行基因下调的准备工作
    1. 制备 MYOB RNAi 饲喂平板。按照步骤 1.1.1 和 1.1.2 进行操作。高压灭菌后，待培养基冷却至约 55 °C，加入 1 ml 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和 1 ml 100 mM 氨苄青霉素。
    2. 划线接种 E. coli HT115细菌经含有表达空载体（EV）或目标基因的质粒转化 flcn-1 在含氨苄青霉素（50 µg/ml）/四环素（15 µg/ml）的琼脂平板上进行特异性RNAi。37 °C过夜培养。
    3. 挑取菌落并接种 大肠杆菌 HT115细菌经含有表达对照EV或 flcn-1 特异性RNAi，并在LB/氨苄青霉素（50 µg/ml）培养基中于37 °C过夜培养。
    4. 种子平板 E. coli HT115 EV 菌或 HT115 flcn-1 RNAi 细菌
      注意：将培养板在室温下放置 48 小时 使用前。若通过喂食进行的RNAi敲低效果不佳，应采用其他ds-RNA递送方法。 28.
  3. 使用百草枯（PQ）诱导氧化应激
    1. 通过混合3 g KH₂PO₄制备M9缓冲液2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl 和 0.25 g MgSO₄4·7 H2O. 用蒸馏水定容至1 L。在122 °C下高压灭菌25分钟，将溶液瓶于室温保存。
    2. 在检测当天，配制含 M9/PQ 的溶液。本实验方案使用 100 mM 的 PQ（将 0.1028 g 的 PQ 溶解于 4 ml M9 缓冲液中，可为整块 96 孔板的每个孔提供 40 µl 的 M9/PQ 溶液）。
      警告：PQ 是一种危险且剧毒的化合物，应根据相关指南进行操作。
      注意：首次运行新菌株或新条件时，建议在逐渐增加的百草枯（PQ）浓度下检测生存率，以确定最佳使用浓度，使动物在7-10小时内死亡。

2. 年龄同步化L4群体的制备

  1. 将20只带有卵的成年雌雄同体线虫转移至新鲜的MYOB平板上，该平板已接种E. coli OP50细菌。根据实验所需线虫数量准备多个平板。
  2. 让其产卵6小时，然后使用铂金丝挑虫针移除母本。在显微镜下检查平板，评估所产卵的数量。
  3. 将卵在20 °C条件下孵化并培养48小时。此时，线虫处于晚期L4/年轻成虫阶段。挑选相同发育阶段的个体，转移至含有PQ溶液的孔中。
    注意：由于48小时的培养时间仅适用于与野生型线虫生长速度相似的突变体，因此重要的是监测新测试突变体的发育速率，确保其与野生型发育速率一致；否则应采用其他培养时间点。
  4. 可选地，使用同步化技术。利用次氯酸盐溶液（25 ml 水，125 ml 5.25% 次氯酸钠，50 ml 4 M NaOH；用铝箔包裹瓶体以避光）制备同步化的L1幼虫群体。然而，在本实验中不推荐使用此方法，因为强烈的漂白处理可能影响线虫在实验过程中的行为。
    注意：操作次氯酸盐溶液时应遵循相关安全指南。
    注意：当使用RNAi技术下调目标基因表达时，按照第2节所述方法对雌雄同体进行同步化处理，但需将母本转移至接种有特定RNAi细菌的RNAi平板上。若RNAi介导的基因敲低效果较弱，建议进行多代喂养处理。

3. 进行氧化应激抗性实验

  1. 将40 µl新配制的100 mM PQ溶液加入96孔板的每个孔中。每种条件（处理、突变体）至少使用12个孔作为重复。 等等。使用铂金丝线虫挑针，将5-8条L4期幼虫转移至每个孔中，并记录开始时间和结束时间。
  2. 开始另一组实验条件时，记录起始时间和结束时间。在转移线虫与一小时后开始计数死亡个体之间的孵育时段内，将培养板置于 20 °C 环境中。
  3. 使用解剖显微镜，每小时记录一次存活情况。开始计数前，轻轻摇动培养板。若线虫在强光照射下仍不移动，则记为死亡个体。同时记录存活个体的数量。
    注意：在高倍镜下观察线虫的形态、尾部及头部运动，有助于区分死线虫与活线虫。
  4. 每小时重复此步骤，直至大多数蠕虫死亡。

4. 每个时间点存活率的测定

  1. 通过将转移至每个孔中的动物总数相加，计算每种条件下动物的总数。忽略在转移过程中受损或死亡的动物。
  2. 对于每个时间点，计算每种条件下死亡动物的总数（12个孔中死亡动物数的总和）。对于每个时间点，计算死亡率（死亡动物数除以动物总数乘以100）和存活率（100减去死亡率百分比）。
  3. 该实验至少独立重复3次。

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结果

比较野生型 C. elegans 与 flcn-1(ok975) 突变体动物

本实验采用 100 mM 的 PQ 处理，以比较野生型 C. elegans 与已知对氧化应激、高温和缺氧具有抵抗能力的 flcn-1(ok975) 突变体的耐受性23。经 4 小时处理后，野生型线虫的存活率为 48.3%，而 flcn-1(ok975) 突变体的存活率为 77.8%。与预期一致，flcn-1(ok975) 突变体对 100 mM PQ 的耐受性显著高于野生型（图 2 和 表 1）。

比较喂食对照EV或flcn-1 RNAi细菌的野生型动物

与前一节展示的结果类似，利用RNAi下调flcn-1的表达可增强对100 mM PQ的抗性。该结果表明，通过R...

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讨论

秀丽隐杆线虫 是研究氧化应激抗性遗传机制的理想模式生物 体内 由于其易于培养，且能快速产生大量遗传上一致的后代。已有多种测量氧化应激抗性的方法被报道，这些方法主要基于在培养平板中添加不同的活性氧（ROS）来源，如PQ、鱼藤酮、H2O2，以及胡桃醌25,26,29-32. 本文描述了一种在96孔板中以100 mM PQ在液体条件下测定氧化应激抗性的实验方案。Greer等人曾进行过类似的测定。 等33该检测方法还可进一步改进，用于研究液体中其他活性氧来源引起的氧化应激。例如，我们已证明，当使用其他活性氧源时，氧化应激水平的下降与 flcn-1 增加对多种H的抗性2O2 浓度也一样23.

对于表现出运动缺陷或游泳诱导性麻痹表型的某些品系（例如携带多巴胺转运蛋白dat-1突变的品系34），本实验在技术上可能具有挑战性。在这种情况...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Caenorhabditis 遗传学中心提供 C. elegans 菌株。本研究由特里·福克斯研究所提供资金支持。我们还感谢麦克吉尔综合癌症研究培训项目中给予 E.P. 的支持，包括罗兰和马塞尔·戈塞林研究生奖学金，以及加拿大卫生研究院/魁北克卫生研究基金会癌症研究培训资助项目（资助号 FRN53888）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌学级琼脂Multicell800-010-LG
细菌蛋白胨OxoidLP0037
生物技术级氯化钠Bioshop7647-14-5
胆固醇SigmaC8503-25G
UltraPure 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Invitrogen15506-017
三羟甲基氨基甲烷Bio Basic Canada Inc77-86-1
IPTGSanta Cruz Biotechnologysc-202185A
氨苄青霉素Bioshop69-52-3
酵母提取物Bio Basic Inc.8013-01-2
甲基紫精二氯化物水合物Aldrich chemistry856177-1G
培养皿 60 × 15 mmFisherFB0875713A
移液管 10 mlFisher1367520
磷酸二氢钾G-BiosciencesRC-084
七水合硫酸镁SigmaM-5921
磷酸氢二钠Bioshop7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss 显微镜
96 孔透明微孔板
flcn-1 RNAi 来源Ahringer Library

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:

Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).

to:

Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

标签

96孔微孔板百草枯处理生存率检测同步化L4期年轻成虫解剖显微镜M9缓冲液RNA干扰遗传筛选
在96孔微孔板中测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的氧化应激抗性
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