C. elegans 是研究参与氧化应激抵抗的信号转导通路的一种理想模式生物。本文提供了一种在液体环境中利用96孔板和多种氧化剂测定 C. elegans 线虫氧化应激抗性的实验方案。
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摘要
摘要
氧化应激是由于活性氧的产生与解毒之间失衡所致，是多种人类慢性疾病的重要诱因，包括心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、衰老和癌症。因此，不仅需要在细胞体系中，也需利用完整生物体来研究氧化应激。C. elegans 是研究氧化应激信号转导通路遗传机制的理想模式生物，这些通路在进化上高度保守。
本文提供了一种在液体环境中测定秀丽隐杆线虫（C. elegans）氧化应激抗性的实验方案。简言之，将诱导活性氧（ROS）的试剂（如百草枯（PQ）和 H2O2）溶解于 M9 缓冲液中，并将溶液分装至 96 孔微孔板的各孔中。将同步化的 L4 期/年轻成虫期 C. elegans 转移至各孔（每孔 5–8 条线虫），随后每小时记录一次存活情况，直至大多数线虫死亡。在使用低浓度应激物进行板上氧化应激抗性检测时，动物的衰老过程可能影响其对氧化应激的反应行为，从而导致数据解读出现偏差。然而，在本研究所描述的检测方法中，由于仅使用 L4 期/年轻成虫期线虫，该问题几乎不会发生。此外，该方案成本低廉，且可在一天内获得结果，因此适用于遗传筛选。总体而言，该技术将有助于阐明氧化应激信号转导通路，进而推动对与氧化应激相关的人类疾病的更深入表征。
引言
在真核生物中，发生于线粒体电子传递链中的氧化磷酸化是产生ATP形式能量的主要途径。活性氧（ROS）是该过程的天然副产物。尽管ROS作为信号分子具有重要作用，但过量的ROS可导致DNA损伤、蛋白质羰基化和脂质氧化。ROS的生成与解毒之间的失衡会引起氧化应激，进而导致能量耗竭、细胞损伤，并触发细胞死亡1,2。氧化应激参与衰老过程，并与多种危及生命的疾病的发生发展相关，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病3-9。
细胞已经进化出酶性和非酶性防御机制，以维持适当的活性氧（ROS）水平，并保护其组分免受氧化损伤1,2。超氧化物歧化酶（SOD）首先将超氧阴离子转化为H2O2，后者再由过氧化氢酶或过氧化物酶进一步转化为水。非酶性防御机制主要包括一些与活性氧反应速度比细胞大分子更快的分子，从而保护关键的细胞组分。尽管ROS解毒酶具有保护作用，但仍有一些ROS分子会逃逸抗氧化防御系统，导致氧化损伤。在氧化应激过程中，对受损细胞组分的检测、修复和降解是至关重要的防御策略1,2。
参与应激抵抗、特别是氧化应激的信号通路在进化上高度保守10,11。与只能部分模拟生物体条件的细胞培养实验不同，在模式生物中研究氧化应激具有重要意义12,13。C. elegan....
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方案
1. 试剂的准备
- 培养基的制备 秀丽隐杆线虫 生长（此处指野生型动物和 flcn-1(ok975) 突变动物）
- 配制 Modified Youngren's Only Bacto-peptone (MYOB) 干粉混合物，包含 5.5 g Tris HCl、2.4 g Tris 碱、31 g Bactopetone、20 g NaCl 和 0.08 g 胆固醇。充分振荡混匀。
注意：此混合液足以配制 10 L 的 MYOB 培养基。
注意：可使用正常生长培养基（NGM）平板代替MYOB平板27然而，为了在不同菌株之间以及不同独立重复实验之间进行有效比较，应使用相同类型的培养板。在本方案中，我们仅使用了MYOB培养板。 - 通过加入6 g MYOB干粉和17 g琼脂，加水定容至1 L，制备1 L MYOB培养基2O，并在122 °C下高压灭菌45分钟。倒平板后于室温静置干燥2天。
- 使用无菌技术，将100 ml的LB液体培养基接种 E. coli OP50 细菌并过夜培养 37 °C
- 在 MYOB 培养板中接种细胞 E. coli OP50 菌株。室温下培养 48 小时。
- 配制 Modified Youngren's Only Bacto-peptone (MYOB) 干粉混合物，包含 5.5 g Tris HCl、2.4 g Tris 碱、31 g Bactopetone、20 g NaCl 和 0.08 g 胆固醇。充分振荡混匀。
- 使用RNAi进行基因下调的准备工作
-
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结果
比较野生型 C. elegans 与 flcn-1(ok975) 突变体动物
本实验采用 100 mM 的 PQ 处理，以比较野生型 C. elegans 与已知对氧化应激、高温和缺氧具有抵抗能力的 flcn-1(ok975) 突变体的耐受性23。经 4 小时处理后，野生型线虫的存活率为 48.3%，而 flcn-1(ok975) 突变体的存活率为 77.8%。与预期一致，flcn-1(ok975) 突变体对 100 mM PQ 的耐受性显著高于野生型（图 2 和 表 1）。
比较喂食对照EV或flcn-1 RNAi细菌的野生型动物
与前一节展示的结果类似，利用RNAi下调flcn-1的表达可增强对100 mM PQ的抗性。该结果表明，通过R.......
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讨论
秀丽隐杆线虫 是研究氧化应激抗性遗传机制的理想模式生物 体内 由于其易于培养，且能快速产生大量遗传上一致的后代。已有多种测量氧化应激抗性的方法被报道，这些方法主要基于在培养平板中添加不同的活性氧（ROS）来源，如PQ、鱼藤酮、H2O2，以及胡桃醌25,26,29-32. 本文描述了一种在96孔板中以100 mM PQ在液体条件下测定氧化应激抗性的实验方案。Greer等人曾进行过类似的测定。 等33该检测方法还可进一步改进，用于研究液体中其他活性氧来源引起的氧化应激。例如，我们已证明，当使用其他活性氧源时，氧化应激水平的下降与 flcn-1 增加对多种H的抗性2O2 浓度也一样23.
对于表现出运动缺陷或游泳诱导性麻痹表型的某些品系（例如携带多巴胺转运蛋白dat-1突变的品系34），本实验在技术上可能具有挑战性。在这种情况.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Caenorhabditis 遗传学中心提供 C. elegans 菌株。本研究由特里·福克斯研究所提供资金支持。我们还感谢麦克吉尔综合癌症研究培训项目中给予 E.P. 的支持，包括罗兰和马塞尔·戈塞林研究生奖学金，以及加拿大卫生研究院/魁北克卫生研究基金会癌症研究培训资助项目（资助号 FRN53888）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌学级琼脂 | Multicell | 800-010-LG | |
| 细菌蛋白胨 | Oxoid | LP0037 | |
| 生物技术级氯化钠 | Bioshop | 7647-14-5 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 | Invitrogen | 15506-017 | |
| 三羟甲基氨基甲烷 | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| 氨苄青霉素 | Bioshop | 69-52-3 | |
| 酵母提取物 | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| 甲基紫精二氯化物水合物 | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| 培养皿 60 × 15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| 移液管 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| 磷酸二氢钾 | G-Biosciences | RC-084 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma | M-5921 | |
| 磷酸氢二钠 | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss 显微镜 | |||
| 96 孔透明微孔板 | |||
| flcn-1 RNAi 来源 | Ahringer Library |
参考文献
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486(2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A reference was corrected in the publication of Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., & Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).
