微型组织培养系统中培养小鼠心脏瓣膜

摘要

在此，我们介绍一种 离体 一种可培养小鼠心脏瓣膜的流动模型，用于研究瓣膜的生物学特性。

摘要

心脏瓣膜疾病在西方世界是一个重大负担，目前尚无有效的治疗方法。这主要是由于对维持和（或）丧失瓣膜结构的分子、细胞及机械机制缺乏了解。

用于研究瓣膜生物学的现有模型包括 体外 瓣膜内皮细胞和间质细胞的培养。尽管， 体外 培养模型提供了细胞和分子机制，但参与瓣膜三维结构形成的机制仍不明确。尽管 体内 模型已为揭示瓣膜发育的分子机制提供了见解，但对成体瓣膜生物学的理解仍然不足。

为了能够在组织、细胞和分子水平上研究瓣膜三维结构对瓣膜生物学的调控作用，我们开发了微型组织培养系统（Miniature Tissue Culture System, MTCS）。在此ex vivo灌注模型中，二尖瓣或主动脉瓣以在心脏中的自然位置进行培养。瓣膜小叶的天然构型与组分得以保持，从而使瓣膜细胞对刺激产生最接近生理状态的反应。瓣膜在培养期间保持活性，并能对环境变化作出响应。该MTCS系统有助于研究以下问题：三维结构如何影响瓣膜生物学特性、哪些因素影响瓣膜的三维结构，以及调控瓣膜三维结构的信号通路网络包括哪些。

引言

心脏瓣膜疾病是西方国家发病率和死亡率的主要原因，其患病率随年龄增长而上升，影响超过10%的75岁及以上人群¹。心脏体循环部分的瓣膜，即主动脉瓣和二尖瓣，最常受累。心脏瓣膜疾病的特征是瓣膜高度有序结构的丧失，从而导致机械性能的改变²。因此，结构完整性对瓣膜功能至关重要。

瓣膜的小叶由瓣膜间质细胞（VIC）、瓣膜内皮细胞（VEC）以及高度有序分层排列的细胞外基质组成^3,4。VIC负责细胞外基质（ECM）的合成、降解和组织构建。来源于血液、内皮细胞（ECs）或存在于细胞外基质中的因子作用于VIC，协调其功能。此外，在心动周期中，机械力作用于小叶，产生层流或振荡性剪切应力，以及压缩或拉伸应力，从而影响VIC的行为⁵。

为了理解瓣膜结构的调控机制，首先需要明确瓣膜间质细胞（VICs）如何响应心脏周期中所经历的各种刺激。体外研究已为瓣膜细胞的特性和功能提供了大量信息。然而，这些细胞在体外的反应可能并不总能准确模拟其在体内的反应⁶；例如，VIC 对刺激的反应依赖于内皮细胞（ECs）的存在以及细胞外基质（ECM）的组成⁵。此外，瓣膜细胞对刺激的反应还取决于其在瓣叶中的特定位置⁷。除了生化刺激外，瓣膜细胞的行为还受到作用于瓣膜的机械力的调控⁸。瓣膜的每个区域都承受着各自特有的血流动力学应力。尽管现有的离体模型已表明机械力是决定瓣膜结构的重要因素⁵，但其相关机制仍不明确。虽然体内模型已揭示了瓣膜发育背后的分子机制^9,10，但对成体瓣膜生物学的理解仍然有限。

因此，一个 离体 建立了一种流动模型，可在较长时间内将心脏瓣膜置于心脏的自然位置进行培养¹¹。这一方法的优势在于瓣膜能够保持其天然构型，且瓣膜间质细胞所处的环境与其自然状态相同 体内，使VICs对刺激的反应尽可能接近自然状态。此外，将瓣膜在其心脏内的自然位置进行培养，有助于使每个瓣膜区域承受相应的血流动力学应力。在此 离体 模型， 即， 微型组织培养系统（MTCS）中，瓣膜可接受不同的生化和血流动力学刺激，从而可研究其在心脏瓣膜重塑中的作用。

方案

本方案遵循动物研究伦理委员会的莱顿大学医学中心（LUMC）指南。

1. 仪器、培养基和MTCS的准备

注意：所有准备工作均应在超净工作台内进行。MTCS灌流室、气泡捕获器及支架详见Lieber et al., 2010¹¹。

1. 用70%乙醇对镊子和微型剪刀进行消毒。准备一支装有21G针头的5 ml注射器，内含无菌Tyrode’s缓冲液（130 mM NaCl，5.4 mM KCl，6.0 mM Hepes，1.2 mM MgSO₄，1.2 mM KH₂PO₄，20 mM葡萄糖，1.5 mM CaCl₂·2H₂O，pH=7.2）。另准备一支装有21G针头的5 ml注射器，内含无菌KCl溶液（100 mM）。
2. 每颗心脏准备65 ml培养基：DMEM培养基添加10%胎牛血清、抗生素/抗真菌素（A/A；100单位青霉素，100 μg链霉素，0.25 μg两性霉素B/ml）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；10 μg/ml胰岛素，5.5 μg/ml转铁蛋白，6.7 ng/ml亚硒酸钠），并经滤膜除菌。
3. 用70%乙醇喷洒灌流室和气泡捕获装置进行消毒，并用纸巾擦干。组装MTCS（图1D），但最初暂不安装灌流室。将气泡捕获装置固定在支架上。使用带有易装泵头的蠕动滚轴泵。
   1. 使用硅胶管连接储液瓶（50 ml离心管）与泵、泵与气泡捕获装置、气泡捕获装置与储液瓶（见图1D）。确保位于培养箱内的管路足够长，以便培养基通过透气性硅胶管（1 m）与培养箱内气体达到平衡，而培养箱外的管路则尽可能短。
4. 在50 ml离心管中加入70%乙醇，开启泵（流速约1 ml/min，以保证充分循环），使乙醇循环30分钟 以灭菌所有管路。通过排空储液瓶并用泵将系统中的乙醇排出，去除乙醇。
5. 在50 ml离心管中加入无菌蒸馏水，开启泵并使水循环30分钟 以清除残留的乙醇。通过排空储液瓶并用泵将系统中的水排出，去除水分。
6. 在50 ml离心管中加入45 ml培养基，将支架放入培养箱中。开启泵（流速约1 ml/min），循环培养基以充满所有管路，排除所有气泡，并使培养基至少在培养箱中适应气体环境1小时。维持培养箱在标准组织培养条件下（5% CO₂，37 °C）。确保管路中无任何气泡存在。

2. 小鼠心脏的分离

1. 向小鼠注射 500 单位肝素。这可以防止血液凝固，便于从心脏中抽取血液。10 分钟后，使用精密挥发器将小鼠置于含 4% 异氟烷的诱导室中进行麻醉。当小鼠对脚趾夹捏无反应时，表明麻醉已充分。
2. 将小鼠转移至解剖板上，并通过连接同轴回路的面罩维持麻醉。消毒 小鼠的毛发 70% 酒精 用剪刀剪开腹腔以暴露下腔静脉和膈肌。
3. 暴露心脏，从最后一根肋骨开始向前至第一根肋骨做侧向切口，将胸廓翻折至小鼠头部上方。当小鼠停止呼吸时，终止麻醉。观察心脏跳动。
4. 将连接有5 ml注射器（内含无菌Tyrode’s缓冲液）的21G针头从腹部插入下腔静脉，并经膈肌进入胸腔。确保血液能从针头插入部位远端的下腔静脉流出。以轻柔且恒定的压力向下腔静脉灌注Tyrode’s缓冲液，直至心脏部分失去红色。注意：心脏仍保持跳动，有助于将血液从心脏中清除。
5. 更换为连接含有无菌 KCl 溶液的 5 ml 注射器的 21G 针头。将 KCl 溶液缓慢灌注至下腔静脉，直至心脏停止跳动，随后拔出针头。注意：KCl 该溶液可使心脏保持在舒张期的松弛状态，便于插入灌注针并灌注冠状系统。
6. 用弯头镊子轻轻提起心脏，用剪刀将心脏从周围组织中游离出来，但保留靠近心脏的动脉和静脉完整并连接在心脏上。将心脏转移至含有冰浴 PBS（添加抗生素/抗真菌剂，A/A）的 15 ml 离心管中。在冰浴 PBS 中保存心脏，最长不超过 3 小时。

3. 灌流室中鼠心脏的插管

1. 所有操作均在层流罩内进行。将分离的心脏从15 ml离心管转移至10 cm培养皿中，并加入补充了A/A的PBS。
2. 在解剖显微镜下，使用显微剪刀和镊子去除所有非心脏组织，但需保留升主动脉至头臂动脉分叉处，以及距离心脏近端约2 mm处的肺静脉。剪除心尖顶端，以暴露左心室腔（通常约为2 mm）。将灌注腔室置于解剖显微镜下的层流罩内。
3. 使用硅胶管将装有培养基的5 ml注射器连接至插入针头。向灌注腔室中加入20 ml培养基，并将心脏放置于灌注腔室内的旋转台上，位于两根钝化针头之间（图1）。调节旋转台高度，使心脏位于针头前方位置。

4. 二尖瓣培养的连接（见图1）

1. 用缝线（7.0 丝线）结扎主动脉。用缝线结扎左心耳。将针头（图 1 中编号 1）经肺静脉插入左心房，并在针头进入左心房处近端用缝线结扎。注意针头不可插入左心房过深，以免损伤二尖瓣。
2. 将针头（图 1 中编号 2）以直线运动方式插入左心室。将灌注腔中的培养基转移至 50 ml 离心管中。用生物相容性胶水将针头与心肌密封固定。
3. 待胶水干燥后，连接装有培养基的注射器至 1 号针头，小心向心脏内注射培养基，检查是否存在泄漏。确保培养基从 2 号针头流出，并将心脏中最后残留的血液完全灌注排出。

5. 主动脉瓣培养的连接（见图1）

1. 将针头（图1中的编号1）插入主动脉，并用缝线结扎。注意针头插入主动脉的深度不宜过深，以免损伤主动脉瓣。将另一根针头（图1中的编号2）以直线运动方式插入左心室。将灌注室中的培养基转移至50 ml离心管中。用生物相容性胶水将针头与心肌组织密封固定。
2. 待胶水完全干燥后，将装有培养基的注射器连接至编号2的针头，小心向心脏内注射培养基，检查是否存在渗漏。确保培养基从编号1的针头流出，并将心脏中残留的血液完全灌注排出。

6. 将灌流室放置在支架上

1. 将已转移的20 ml培养基注入灌注室中。放置垫圈和盖子，并用垫片和螺钉拧紧。
2. 从培养箱中取出组装好的MTCS。将灌注室固定在支架上，连接管路（见图1D）。将支架放回培养箱（5% CO₂，37 °C）。将管路连接至泵，启动泵，流速调至约600 μl/min。
3. 确保储液器和/或气泡捕集器中的培养基液面高度能够通过观察流入的培养基液滴下落来直观判断流动状态。培养结束后，将心脏从系统中取出，固定并进行组织学检查处理。

结果

主动脉瓣（图2）或二尖瓣¹¹可培养至少3天。通过在开放位置（对主动脉瓣代表收缩期位置，对二尖瓣代表舒张期位置）进行培养，瓣膜细胞仍保持活性。通过TUNEL阳性细胞缺失（图2H,I）或裂解型caspase-3表达（未显示，参见Lieber et al., 2010¹¹）判断，未观察到细胞死亡。在含1%血清的培养条件下，胶原分布（通过Masson三色染色显示）与天然状态相似（图2D,E）。瓣膜对培养条件的变化具有响应性。将血清浓度提高至10%会导致瓣叶增厚（图2C）。此外，在瓣叶靠近与主动脉壁连接处的心室侧可观察到明显的无胶原区域（图2F中的箭头所示）。这些结果共同表明，培养的瓣膜保持了细胞活性，形态上类似于天然瓣膜，并能响应环境变化。

讨论

培养小鼠心脏瓣膜的关键步骤包括：尽可能缩短从小鼠体内取出心脏到在灌流室中进行结扎的时间，以确保组织的活性；将缝合针垂直于瓣膜进行结扎，以保证灌流方向正确。此外，在灌流室中完成结扎后、未加入培养基前检查灌流情况，可确认缝合针插入和结扎是否正确。维持无菌培养环境至关重要，同时需防止管路中产生气泡，以免气泡滞留在心脏内阻碍灌流。

灌注心脏所用培养基的总体积为 45 ml（注意：流经心脏的培养基不与灌流室中 20 ml 的培养基接触）。若需添加病毒等物质，可选用较小体积。在时间上，可将储液器（及部分管路）暂时从回路中移除，使系统内保留 5–7 ml，以利于对瓣膜进行感染。

心脏无搏动可能被视为一种局限性。然而，这种方法能够创建一种实验条件，使作用于瓣叶的所有刺激因素保持恒定，从而提供了研究单一特定改变效应的独特机会。当需要可活动的瓣膜时，可建立脉动流动。

为了研究瓣膜生物学以及分子、细胞和机械刺激对瓣膜的作用，可对培养系统进行简便的改造。通过向灌注培养基中添加生长因子、化学化合物以及介导...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	Life Technologies	10569-010
胎牛血清	Life Technologies	26140
胰岛素-转铁蛋白-硒	Life Technologies	41400-045
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-06
丝线 7-0	Ethicon	768G
100 mm 培养皿	Greiner bio-one	664160
50 ml 离心管	Greiner bio-one	227261
5 ml 注射器	BD	309649
21 G 针头	BD	304432
肝素	LEO	012866-08
镊子	Fine Science Tools	11295-00
显微剪刀，经济型，Vannas 型	Tedpella	1346
硅胶管	赛默飞世尔科技	8060-0020	内径 × 外径 × 壁厚：1.59 × 3.18 × 0.79 mm
用于泵的硅胶管	Masterflex	96400-13	内径 × 外径 × 壁厚：0.8 × 1.59 × 0.40 mm
生物相容性胶水（Histoacryl）	B. Braun	1050071
精密汽化器	博士äger	Vapor 200
蠕动滚轮泵	Masterflex	7521-35
易装泵头	Masterflex	7518-00
流室			参见 Lieber 等 2010
气泡捕集器			参见 Lieber 等 2010