微型组织培养系统中培养小鼠心脏瓣膜

摘要

在此，我们介绍一种 离体 一种可培养小鼠心脏瓣膜的流动模型，用于研究瓣膜的生物学特性。

摘要

心脏瓣膜疾病在西方世界是一个重大负担，目前尚无有效的治疗方法。这主要是由于对维持和（或）丧失瓣膜结构的分子、细胞及机械机制缺乏了解。

用于研究瓣膜生物学的现有模型包括 体外 瓣膜内皮细胞和间质细胞的培养。尽管， 体外 培养模型提供了细胞和分子机制，但参与瓣膜三维结构形成的机制仍不明确。尽管 体内 模型已为揭示瓣膜发育的分子机制提供了见解，但对成体瓣膜生物学的理解仍然不足。

为了能够在组织、细胞和分子水平上研究瓣膜三维结构对瓣膜生物学的调控作用，我们开发了微型组织培养系统（Miniature Tissue Culture System, MTCS）。在此ex vivo灌注模型中，二尖瓣或主动脉瓣以在心脏中的自然位置进行培养。瓣膜小叶的天然构型与组分得以保持，从而使瓣膜细胞对刺激产生最接近生理状态的反应。瓣膜在培养期间保持活性，并能对环境变化作出响应。该MTCS系统有助于研究以下问题：三维结构如何影响瓣膜生物学特性、哪些因素影响瓣膜的三维结构，以及调控瓣膜三维结构的信号通路网络包括哪些。

引言

心脏瓣膜疾病是西方国家发病率和死亡率的主要原因，其患病率随年龄增长而上升，影响超过10%的75岁及以上人群¹。心脏体循环部分的瓣膜，即主动脉瓣和二尖瓣，最常受累。心脏瓣膜疾病的特征是瓣膜高度有序结构的丧失，从而导致机械性能的改变²。因此，结构完整性对瓣膜功能至关重要。

瓣膜的小叶由瓣膜间质细胞（VIC）、瓣膜内皮细胞（VEC）以及高度有序分层排列的细胞外基质组成^3,4。VIC负责细胞外基质（ECM）的合成、降解和组织构建。来源于血液、内皮细胞（ECs）或存在于细胞外基质中的因子作用于VIC，协调其功能。此外，在心动周期中，机械力作用于小叶，产生层流或振荡性剪切应力，以及压缩或拉伸应力，从而影响VIC的行为⁵。

为了理解瓣膜结构的调控机制，首先需要明确瓣膜间质细胞（VICs）如何响应心脏周期中所经历的各种刺激。体外研究已为瓣膜细胞的特性和功能提供了大量信息。然而，这些细胞在体外的反应可能并不总能准确模拟其在体内的反应⁶；例如，VIC 对刺激的反应依赖于内皮细胞（ECs）的存在以及细胞外基质（ECM）的组成⁵。此外，瓣膜细胞对刺激的反应还取决于其在瓣叶中的特定位置⁷。除了生化刺激外，瓣膜细胞的行为还受到作用于瓣膜的机械力....

方案

本方案遵循动物研究伦理委员会的莱顿大学医学中心（LUMC）指南。

1. 仪器、培养基和MTCS的准备

注意：所有准备工作均应在超净工作台内进行。MTCS灌流室、气泡捕获器及支架详见Lieber et al., 2010¹¹。

1. 用70%乙醇对镊子和微型剪刀进行消毒。准备一支装有21G针头的5 ml注射器，内含无菌Tyrode’s缓冲液（130 mM NaCl，5.4 mM KCl，6.0 mM Hepes，1.2 mM MgSO₄，1.2 mM KH₂PO₄，20 mM葡萄糖，1.5 mM CaCl₂·2H₂O，pH=7.2）。另准备一支装有21G针头的5 ml注射器，内含无菌KCl溶液（100 mM）。
2. 每颗心脏准备65 ml培养基：DMEM培养基添加10%胎牛血清、抗生素/抗真菌素（A/A；100单位青霉素，100 μg链霉素，0.25 μg两性霉素B/ml）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；10 μg/ml胰岛素，5.5 μg/ml转铁蛋白，6.7 ng/ml亚硒酸钠），并经滤膜除菌。
3. 用70%乙醇喷洒灌流室和气泡捕获装置进行消毒，并用纸巾擦干。组装MTCS（图1D），但最初....

结果

主动脉瓣（图2）或二尖瓣¹¹可培养至少3天。通过在开放位置（对主动脉瓣代表收缩期位置，对二尖瓣代表舒张期位置）进行培养，瓣膜细胞仍保持活性。通过TUNEL阳性细胞缺失（图2H,I）或裂解型caspase-3表达（未显示，参见Lieber et al., 2010¹¹）判断，未观察到细胞死亡。在含1%血清的培养条件下，胶原分布（通过Masson三色染色显示）与天然状态相似（图2D,E）。瓣膜对培养条件的变化具有响应性。将血清浓度提高至10%会导致瓣叶增厚（图2C）。此外，在瓣叶靠近与主动脉壁连接处的心室侧可观察到明显的无胶原区域（图2F中的箭头所示）。这些结果共同表明，培养的瓣膜保持了细胞活性，形态上类似于天然瓣膜，并能响应环境变化。

讨论

培养小鼠心脏瓣膜的关键步骤包括：尽可能缩短从小鼠体内取出心脏到在灌流室中进行结扎的时间，以确保组织的活性；将缝合针垂直于瓣膜进行结扎，以保证灌流方向正确。此外，在灌流室中完成结扎后、未加入培养基前检查灌流情况，可确认缝合针插入和结扎是否正确。维持无菌培养环境至关重要，同时需防止管路中产生气泡，以免气泡滞留在心脏内阻碍灌流。

灌注心脏所用培养基的总体积为 45 ml（注意：流经心脏的培养基不与灌流室中 20 ml 的培养基接触）。若需添加病毒等物质，可选用较小体积。在时间上，可将储液器（及部分管路）暂时从回路中移除，使系统内保留 5–7 ml，以利于对瓣膜进行感染。

心脏无搏动可能被视为一种局限性。然而，这种方法能够创建一种实验条件，使作用于瓣叶的所有刺激因素保持恒定，从而提供了研究单一特定改变效应的独特机会。当需要可活动的瓣膜时，可建立脉动流动。

为了研究瓣膜生物学以及分子、细胞和机械刺激对瓣膜的作用，可对培养系统进行简便的改造。通过向灌注培养基中添加生长因子、化学化合物以及介导.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基	Life Technologies	10569-010
胎牛血清	Life Technologies	26140
胰岛素-转铁蛋白-硒	Life Technologies	41400-045
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-06
丝线 7-0	Ethicon	768G
100 mm 培养皿	Greiner bio-one	664160
50 ml 离心管	Greiner bio-one	227261
5 ml 注射器	BD	309649
21 G 针头	BD	304432
肝素	LEO	012866-08
镊子	Fine Science Tools	11295-00
显微剪刀，经济型，Vannas 型	Tedpella	1346
硅胶管	赛默飞世尔科技	8060-0020	内径 × 外径 × 壁厚：1.59 × 3.18 × 0.79 mm
用于泵的硅胶管	Masterflex	96400-13	内径 × 外径 × 壁厚：0.8 × 1.59 × 0.40 mm
生物相容性胶水（Histoacryl）	B. Braun	1050071
精密汽化器	博士äger	Vapor 200
蠕动滚轮泵	Masterflex	7521-35
易装泵头	Masterflex	7518-00
流室			参见 Lieber 等 2010
气泡捕集器			参见 Lieber 等 2010