从大鼠尾侧静脉采血

摘要

血液样本可用于评估生理状态或疾病的生物标志物 in vivo。本文描述了从大鼠尾侧静脉采血的方法。该方法可快速获取样本，且疼痛轻微、侵入性最小。

摘要

在许多实验情境中，通常通过采集血液样本来测定感兴趣的靶标物，包括激素、免疫因子、生长因子、蛋白质和葡萄糖等。然而，血液成分受到动态调控，且容易受到干扰。其中，采样过程引发的应激反应是改变血液成分的一个因素，可能导致目标检测指标的变异性。本文介绍一种从大鼠尾侧静脉采血的操作方法。该方法相较于其他常用技术具有显著优势：可在无需麻醉或镇痛的情况下实现快速采样，且疼痛和侵入性最小；此外，该方法可采集较大体积的血液样本（某些大鼠单次采样量可超过1 ml），并可在多个实验日重复使用。通过最大限度地减少采血引起的应激反应和疼痛，所获得的检测结果能更准确地反映动物真实的基线状态，受采样操作本身的影响降至最低。

引言

从血液中获得的生物标志物在许多临床背景下提供了有用的诊断、预测和分层指标，包括心血管疾病¹、癌症科学²和精神疾病³。这些指标也可用于基础科学研究，以评估机体的“状态”，如饥饿、炎症或应激的程度。这些测量结果可能受到各种变量的影响，其中一些变量可能与研究问题相关，也可能不相关，例如采样时间以及受试者的性别。此外，采血过程本身所引起的应激也可能影响结果。应激激素水平以及对疼痛的感知会迅速改变血液的成分。

啮齿类动物是最常用的实验动物，已开发出多种采血方法。理想的采血方法应对动物的生理影响最小，无需麻醉，能够快速且重复采样，并能提供足够体积的血液用于多种下游应用。一些常用的采血技术，如颈静脉插管或尾尖截除，均无法满足这些要求。

本方案的目的是描述一种用于大鼠的采血技术，该技术应尽可能减少应激反应，无需麻醉，允许对单个动物进行多次采血，并能提供相对较大的样本量，从而可在单一样本上进行多种检测。该方法的目标是获取受急性应激反应影响最小的血液样本。

方案

所有实验均使用成年雄性Long-Evans大鼠进行。所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》，并经麻省理工学院机构动物护理和使用委员会以及美国陆军医学研究与材料司令部动物护理和使用审查办公室批准。

1. 准备

1. 将带保护套的针头插入含有肝素（1,000 USP 单位/ml）的 500 µl 离心管中，通过针头抽吸并排出肝素溶液，以对导管和注射器进行肝素化处理。
   1. 将蝶形导管连接至注射器。保持针头上的保护套处于覆盖状态，以防止针尖受损。
   2. 抽取略多于待采集血量的肝素溶液。取下注射器并吸入空气。
   3. 将注射器重新连接至导管，利用空气排出多余的肝素溶液；确保导管、针头和注射器内仅残留微量肝素。
   4. 将已连接注射器的无菌导管置于无菌表面上。
2. 用干净的布迅速固定大鼠，确保其前肢和后肢处于舒适位置，且呼吸不受限制。
   1. 使用魔术贴将包裹固定；注意不要压迫外生殖器。
   2. 由助手在稳固的工作台面上轻轻而牢固地固定大鼠（腹部和尾根部），使尾巴悬垂于台面边缘。

2. 血液采样

1. 将尾巴浸入42 °C的水中40-50秒以扩张血管，然后用纸巾擦干尾巴。确定采血的尾静脉位置（通过旋转整个身体来调整尾巴位置，避免扭转尾巴）。
   注意：充分加热尾巴对于快速采集血样至关重要。如果血管收缩，则导管放置困难，且血流会显著减少。可使用加热垫代替水浴作为替代方法。
2. 确定采样点。
   ​注意：动脉位于尾巴的背中线位置；请勿在此处采样。
   1. 选择位于动脉外侧的左侧或右侧尾静脉作为目标。尾巴的色素沉着因品系而异，并随年龄增长而加深，可能遮蔽部分血管结构。应选择尾巴下部的一段静脉作为穿刺部位。
   2. 用2%氯己定消毒液擦拭目标区域。
3. 通过将注射器活塞从零位回抽至约50 µl处，在注射器和导管内建立负压。
4. 在靠近尾尖处轻轻而牢固地握住尾巴，确保在整个采样过程中保持尾巴伸直。注意握力不可过紧，以免阻断血流。
5. 将导管以较浅的角度缓慢插入距尾尖约5 cm处的静脉。当刺入静脉时，血液将流入导管。缓慢回抽注射器活塞，以稳定的速度收集所需体积的血液（约每秒20 µl）。
   1. 有关可采集的最大血量信息，请咨询兽医人员。最大采血量取决于大鼠的体重和健康状况。在14天内采集的血液总量不应超过总血容量的15%。
      注意：若动物在采样前数分钟内经历了急性应激，则采血将变得困难得多，因为应激激素会引起血管收缩。例如，将大鼠的饲养笼转移至新环境、花费数分钟包裹动物，或反复将导管插入静脉等操作均可能引发急性应激反应。
   2. 通过“挤奶”方式促进血液流动。用手指沿静脉从近端向尾尖方向轻轻挤压，但手指应距离针尖或导管插入点超过2 cm，以防导管从静脉中脱出。
   3. 若在初次穿刺位置无法成功采血，可将针头沿静脉向上重新插入。若已在初次位置采集到血液，在再次插入静脉前，应通过断开并重新连接导管与注射器的方式使针头重新加压。通常应尽量避免多次穿刺。
   4. 由于多次穿刺可能导致尾静脉塌陷，进而中断尾部血液供应并引起软组织坏死，一旦发生尾静脉塌陷，应实施安乐死。
6. 当采集到足够的血样后，通过断开并重新连接导管的方式释放注射器内的压力。使用注射器活塞轻微抽吸（约50 µl），然后将针头从静脉中撤出。
   注意：若在未先释放注射器内压力的情况下拔出针头，血液会从针头滴出。
7. 短暂按压穿刺部位以止血，并用消毒液擦拭该区域。将大鼠放回其饲养笼中。

3. 血液样本的处理

1. 吸取空气以确保导管针内无残留血液，然后用剪刀在针头上方剪断导管管路。将血液排入无菌的1.5 ml微量离心管中。
   注意：若血液经针头推出，剪切力可能导致红细胞破裂，从而干扰多种下游检测。为避免溶血，请移除针头。
   1. 采集血浆时，使用含有EDTA作为抗凝剂的试管（此处，每200–400 µl血液使用10 µl的0.1 M EDTA；确保所用EDTA浓度不会干扰下游检测），并置于冰上。
      1. 在采血后10分钟内，将全血样本于4 °C预冷的离心机中以2,100 × g离心10分钟。小心收集上清血浆，避免扰动红细胞和白细胞层。
   2. 采集血清时，将样本（不含抗凝剂）于室温放置最多30分钟，以促进凝血。随后将采集管于4 °C预冷的离心机中以2,000 × g离心，之后可收集血清。
2. 样本应立即使用，或于-80 °C保存不超过一年。

结果

按照本方案所述，从侧尾静脉采集的血液血浆呈半透明淡黄色。如图1所示，样本发生溶血会使血浆呈现红色色调。急性应激反应可迅速改变血液成分。例如，循环中皮质酮浓度在应激暴露后10分钟内即可显著升高，如图2所示。在应激暴露前，采用本方法获得的皮质酮基础水平较低，表明采样过程本身并不会引起明显的应激反应。

图 1: 样本外观。 (A) 显示溶血样本。离心后，血浆或血清层（黑色箭头所示表面）呈现粉红色或红色调。颜色越深，表明溶血程度越高。(B) 离心后，正确采集的样本上层（黑色箭头所示表面）应呈清澈淡黄色，对应于未溶血的血浆或血清。在移取该层时，应注意不要扰动下层的全血，避免将移液器吸头插入全血层或将全血吸入吸头中。任何被全血污染的血浆或血清均应弃用。

图2：经历应激事件后，血浆皮质酮迅速升高。在成年雌性Long-Evans大鼠暴露于4次声音刺激（10秒，2 kHz，85 dB）并伴随足底电击（1秒，350 µA）之前及之后10分钟，从其尾侧静脉采集血液。基线时的血浆皮质酮水平（290.4 ± 138.8 pg / ml）显著低于电击应激后10分钟的水平（2204.8 ± 454.5 pg / ml，p = 0.02，n = 4），经配对t检验确定。*，p <0.05

讨论

本文介绍一种快速且简便的大鼠采血方法，相较于其他常用技术具有显著优势。首先，该方法无需麻醉，而颈静脉或眶后窦采血则通常需要麻醉。当在行为学实验前后采集血样时，使用麻醉剂是不理想的，因为它可能干扰学习和记忆过程^4,5。其次，与其他静脉穿刺技术（如隐静脉或背足静脉采血）相比，该方法可采集更多的血液量。采用本方法，单次可从大鼠采集多达1.5 ml的血液，足以支持多项检测同时进行。最后，与断尾采血或眶后出血法相比，该方法显著降低了组织损伤的风险。使用本方法有助于符合《动物福利法》和《实验动物护理与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）的要求，这些法规强调应尽量减少实验动物在操作过程中所经历的疼痛与痛苦。

建议初次使用该方法的研究人员练习固定和尾部采血技术，以尽量缩短实验动物的束缚时间。从开始束缚起3分钟内采集的血液可获得最佳结果。

此处所述的采样方案每周可进行1至4次，但每天不得超过两次。虽然可以进行多次采血，但应从尾部基端开始逐步向上选择不同的采样位点，并交替使用左尾静脉和右尾静脉作为采样部位。啮齿类动物的总血容量为其体重的6-7%，在两周内采集的血量不应超过总血容量的15%。血清或血浆约占采集样本体积的40-60%。

也可通过小鼠的侧尾静脉进行采血，具体方法如上所述，仅需少量修改。首先，只能使用小规格（27 G）导管。其次，建议使用管状固定器而非包裹方式来固定小鼠。通过下颌下血管束穿刺获取的血量（200–500 µl）大于从尾静脉安全采集的血量（最多200 µl）。由于从下颌下血管束采血所需固定程度较小且可获得更多的血液，因此这是小鼠采血的首选途径。

该操作可快速完成，且具有微创性，因此也能最大程度地减少急性应激反应对血液检测指标的潜在干扰⁶。急性应激反应可改变多种分子的循环水平，包括白细胞介素及其他免疫活性因子⁷、下丘脑-垂体-肾上腺轴激素⁸、交感神经系统中的激素⁹、胃饥饿素（ghrelin）¹⁰、内源性阿片类物质¹¹、多巴胺和5-羟色胺¹²。如果需要获取这些分子或受其调控的其他分子在静息状态下的循环水平，则必须尽可能减少应激反应，因为应激反应在接触应激源后短短一分钟内即可被激活。

应激反应不仅会改变血液成分，还会因交感神经系统活动增强导致血管收缩，从而给采血带来技术上的困难。当大鼠出现急性应激反应时，获取稳定的血流变得越来越困难。因此，必须尽量减少动物的痛苦，以快速获得能够反映目标生理状态的血样。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝素钠（1,000 USP 单位/毫升）	Patternson Veterinary Supply	25021040010
乙二胺四乙酸（EDTA）	JT Taylor	JT2020-01
Dermachlor 洗剂-氯己定	Butler Schein	6356	外用抗菌溶液，2% 葡萄糖酸氯己定
SURFLO 翼状输液套件，Terumo，蝶形导管	VWR Scientific	TESV25BLK
BD 结核菌素 1 毫升注射器	VWR Scientific	BD309659
1.5 毫升微量离心管	VWR Scientific	89202-682
500 μl 微量离心管	VWR Scientific	21150-330
剪刀，不锈钢，5"	VWR Scientific	82027-586
500 毫升塑料烧杯	VWR Scientific	414004-149
洁净布包裹材料	Butler Schein	2993
魔术贴带，0.75 英寸宽	Monoprice	B004AF9II6	钩环带
计时器	VWR Scientific	62344-641