介绍了一种使用特异性DNA染料甲基绿对固定生物材料进行荧光染色的方法。甲基绿以稀释的水溶液形式使用，具有很强的抗光漂白性。其远红光发射特性适用于深层样本成像，特别适合对完整胚胎进行成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
甲基绿长期以来被用作一种对DNA具有特异性亲和力的组织学染色剂，尽管其荧光特性直到最近才被研究。本文介绍了制备甲基绿水溶液储备液的方法，该溶液经稀释后可作为固定细胞和组织中极为便捷的荧光核标记物。文中详细描述了对整只斑马鱼和鸡胚胎进行标记的简便操作步骤，并展示了获得的成像结果示例。甲基绿在633 nm的红光照射下可达到最大激发，发射光谱相对较窄，峰值位于677 nm。该染料价格低廉、无毒、在溶液中高度稳定，且与DNA结合后具有极强的抗光漂白能力。其红色发射光使得对厚样本中细胞核进行高分辨率共聚焦扫描成像时无需更改成像条件。最后，该甲基绿染色方案可与其他细胞染色方法兼容，例如抗体标记，或使用荧光素偶联鬼笔环肽对肌动蛋白纤维进行标记。
引言
DNA 荧光染色在生物研究和临床诊断中被广泛且常规地使用，可用于核和染色体结构的详细研究、组织和细胞的复染，或用于细胞周期参数的分析1。尽管已有多种 DNA 染料可供选择，但应用最广泛的仍是那些由紫外光激发并在蓝色波段发射的染料，这类染料与绿色和橙红色发射的荧光染料（如荧光蛋白或抗体偶联的小分子）联用时，可适配大多数常规落射荧光显微镜所采用的三滤光片系统。在这些蓝色发射的 DNA 染料中，最常见的是 DAPI 和 Hoechst 小沟结合试剂2,3。然而，随着激光扫描显微镜中多种激光发射谱线和光谱检测技术的引入，研究人员得以选用远红光发射的核染料，例如碘化丙啶（PI）或 TO-PRO-34。这些染料的一个优势在于能够克服许多细胞和组织（尤其是在胚胎中）存在的自发荧光问题5，但其中许多染料也存在其他问题，例如发射光谱较宽或极易发生光漂白6。
1869年，瑞士研究人员 Friedrich Miescher 首次发现了DNA，他从脓液中的白细胞细胞核中将其提取出来，并称之为“核素”（nuclein）。几年后，他进一步证明核素可与当时较新的染料甲基绿（methyl green）形成沉淀。甲基绿由三个苯胺环构成，具有不同程度的甲基化，并带有两个正电荷，能够牢固地结合到DNA的大沟结构中7,8。早期研究已证实甲基绿对DNA的染色具有高度特异性，这促使 Unna 和 Pappenheim 开发了一种与派洛宁（pyronin）联用的复合染色法，后者可特异性标记RNA。自那时起，甲基绿-派洛宁染色法已被广泛应用于常规组织学技术中9。
直到最近，人们对孔雀石绿的荧光特性知之甚少。然而，我们先前的研究已揭示了孔雀石绿在光谱方面的一些优势6，例如其在633 nm处的激发波长、适宜的斯托克斯位移、在电磁波谱的近红外区域发射荧光、比具有相似光谱特性的商业化DNA染料更高的光稳定性，且成本极低。正因如此，我们决定测试其作为胚胎组织及完整胚胎中高亲和力且特异性的荧光DNA标记物的应用潜力。此外，迄今为止，孔雀石绿的细胞核染色均在低pH条件下进行，这使其难以与抗体染色联合使用。本文详细介绍的方法旨在建立一种可在生理pH条件下进行的荧光细胞核DNA染色方案，从而克服上述局限性，使其成为组织切片及完整组织中免疫标记的理想复染剂。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 染料的纯化
- 通过将0.4 g染色粉末溶解于10 ml蒸馏水中，配制4%的甲基绿水溶液。充分混匀直至完全溶解。
- 在通风橱内，将该溶液与至少2份氯仿混合。重要的是需预先确认试管是否耐氯仿。
- 充分混匀后，在2,000 x g条件下离心1 min ，以加速相分离。
- 离心后，获得含有甲基绿的上层水相和含有氯仿及常见杂质结晶紫的下层有机相。
- 收集上层相，并重复此步骤，直至下层相中完全不含有结晶紫。
- 最后收集上层相，并用水稀释至甲基绿终浓度为2%。该储备液在实验台上可稳定保存数月，无需避光。
2. 使用甲基绿对完整斑马鱼胚胎进行荧光核染色
- 在含4%甲醛（来自多聚甲醛）的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定胚胎过夜。
注意：这一步骤可能需要数小时至过夜，具体时间取决于胚胎的厚度。在本示例中，我们固定了48小时的胚胎。 受精后（hpf）斑马鱼胚胎过夜培养。 - 用 PBS-T（含 1% Triton X-100 的 PBS）清洗胚胎 3 次，每次 5 分钟。提高的去垢剂浓度可使角质层通透。
- 用PBS-T将甲基绿（来自2%储备液）稀释成1:5,000至1:10,000的溶液。孵育过程中加入洗涤剂有助于处理斑马鱼胚胎和幼鱼等较厚的样本。
- 将胚胎在溶液中孵育至少6小时 在4 °C下，轻轻摇动孵育。同样，胚胎的厚度是校准孵育时间长度的参数。
- 用 PBS 清洗胚胎 3 次，每次 30 分钟，以去除多余的去垢剂。甲基绿荧光仅在与 DNA 结合时才明显，因此未结合分子的背景信号可忽略不计。
- 将样本置于挖孔载玻片或自制培养皿中，用封片液（75%甘油，0.1 M Tris·HCl pH 8）封片。
注意：如果核染色在免疫标记之后进行，可将甲基绿以工作浓度加入封片液中，无需后续洗涤步骤。 - 冷藏保存或立即开始成像。使用激光扫描共聚焦（或其他荧光）显微镜进行成像，激发波长为633 nm，发射滤光片设置为检测650–750 nm范围内的信号，并注意甲基绿的发射峰位于677 nm。
注意：我们将甲基绿发射光谱的实测数据作为补充材料提供，以便载入采集软件中。
3. 使用甲基绿对完整鸡胚进行荧光核染色
- 将受精的鸡卵孵化至所需发育阶段。在4 °C条件下，用4%多聚甲醛（溶于PBS）固定胚胎过夜。用PBS-T溶液清洗胚胎3次，每次2小时。
- 用PBS-T将2%甲基绿储备液稀释成1:5,000至1:10,000的工作液。在4 °C条件下，将胚胎置于染色液中孵育过夜。用PBS清洗胚胎3次，每次1小时 。将胚胎置于含75%甘油、0.1 M Tris（pH 8）的载片腔室中封片。
4. 全胚胎标本中荧光标记细胞核的成像
- 通过在显微镜载玻片上粘贴多层电工胶带，并用手术刀小心地在胶带上切割出一个孔，以放置胚胎，从而制备成像室。这可以防止成像过程中胚胎被压碎。
- 小心将胚胎转移至成像室中，并用75%甘油、0.1 M Tris-HCl（pH=8）充满 chamber 至顶部，以避免气泡形成。
- 用 #0 盖玻片覆盖，避免或清除介质溢出，并用指甲油密封。
- 在配备633激发滤光片或激光线的荧光显微镜下采集样品图像。
注意：发射滤光片应覆盖甲基绿677的发射峰。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
厚样本的细胞核染色。本文所述方案可实现对完整胚胎中深层结构的均匀染色。48小时斑马鱼胚胎发育中的晶状体细胞核被均匀标记（图1）。
甲基绿DNA染色可区分细胞周期依赖性的形态学差异，例如识别有丝分裂相或凋亡细胞核（图2A）。在高分辨率下，亚核结构也清晰可见，如斑马鱼胚胎表皮细胞核所示（图2B）。
甲基绿在高强度长时间照射下具有抗光漂白性。当使用相同强度的633 nm激光照射时，甲基绿的细胞核染色不会发生漂白，而另一种具有相似光谱特性的DNA特异性染料TO-PRO-34则会出现漂白现象。实验选取了整体封片的斑马鱼胚胎视网膜的一个共聚焦层面，并使用63倍、1.4数值孔径的物镜放大以实现高强度照射。在缩小视野后，TO-PRO-3染色的样品在持续照射60秒内即出现明显漂白（图3，上排图），而在相同条件下，甲基绿染色的样品即使照射达120秒也未见明显光漂白现象（图3<...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
近几十年来，显微技术不断发展，尤其是荧光显微技术的多种改进，使得研究完整组织样本（包括整个胚胎）的动态过程和结构成为可能10,11。然而，一个主要的限制因素是缺乏高质量的荧光染料，可用于快速、直接地标记亚细胞结构。
最常用的荧光DNA染料（如DAPI或Hoechst）需用紫外光激发，并在可见光谱的蓝色区域发射荧光2,3，因此不适合对完整组织中的深层结构进行成像。红光在生物样品中的穿透能力更强，使得发射红光的荧光染料更适用于此类研究12。自发荧光是胚胎组织中常见的问题，而使用发射红光的荧光染料也有助于克服这一问题5。
我们已证明，常用的组织学染色剂甲基绿在与DNA结合时是一种高效的红色荧光团，可用于显微镜、流式细胞术、荧光光度法或凝胶电泳中DNA的检测6。本文所述的利用甲基绿对完整胚胎进行荧光核染色的方案相对快速且简便。该技术成本低廉，且在实验室内稍加操作即可配制出适用于数百次实验的储存液。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
作者感谢 Patxi Jaso 对视频制作的贡献，以及 PEDECIBA 和国家研究与创新局（ANII）提供的部分资金支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 甲基绿 | Dr. G. Grübler | 也测试了 Sigma-Aldrich 323829（无结晶紫） | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 激光共聚焦显微镜 Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| 鬼笔环肽–四甲基罗丹明异硫氰酸酯 | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| 离心机 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| 显微镜载玻片 | Deltalab | D100004 | |
| 盖玻片 | Esco optics | R525025 |
参考文献
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
