甲基绿在胚胎荧光标记中的DNA特异性染色应用

摘要

介绍了一种使用特异性DNA染料甲基绿对固定生物材料进行荧光染色的方法。甲基绿以稀释的水溶液形式使用，具有很强的抗光漂白性。其远红光发射特性适用于深层样本成像，特别适合对完整胚胎进行成像。

摘要

甲基绿长期以来被用作一种对DNA具有特异性亲和力的组织学染色剂，尽管其荧光特性直到最近才被研究。本文介绍了制备甲基绿水溶液储备液的方法，该溶液经稀释后可作为固定细胞和组织中极为便捷的荧光核标记物。文中详细描述了对整只斑马鱼和鸡胚胎进行标记的简便操作步骤，并展示了获得的成像结果示例。甲基绿在633 nm的红光照射下可达到最大激发，发射光谱相对较窄，峰值位于677 nm。该染料价格低廉、无毒、在溶液中高度稳定，且与DNA结合后具有极强的抗光漂白能力。其红色发射光使得对厚样本中细胞核进行高分辨率共聚焦扫描成像时无需更改成像条件。最后，该甲基绿染色方案可与其他细胞染色方法兼容，例如抗体标记，或使用荧光素偶联鬼笔环肽对肌动蛋白纤维进行标记。

引言

DNA 荧光染色在生物研究和临床诊断中被广泛且常规地使用，可用于核和染色体结构的详细研究、组织和细胞的复染，或用于细胞周期参数的分析¹。尽管已有多种 DNA 染料可供选择，但应用最广泛的仍是那些由紫外光激发并在蓝色波段发射的染料，这类染料与绿色和橙红色发射的荧光染料（如荧光蛋白或抗体偶联的小分子）联用时，可适配大多数常规落射荧光显微镜所采用的三滤光片系统。在这些蓝色发射的 DNA 染料中，最常见的是 DAPI 和 Hoechst 小沟结合试剂^2,3。然而，随着激光扫描显微镜中多种激光发射谱线和光谱检测技术的引入，研究人员得以选用远红光发射的核染料，例如碘化丙啶（PI）或 TO-PRO-3⁴。这些染料的一个优势在于能够克服许多细胞和组织（尤其是在胚胎中）存在的自发荧光问题⁵，但其中许多染料也存在其他问题，例如发射光谱较宽或极易发生光漂白⁶。

1869年，瑞士研究人员 Friedrich Miescher 首次发现了DNA，他从脓液中的白细胞细胞核中将其提取出来，并称之为“核素”（nuclein）。几年后，他进一步证明核素可与当时较新的染料甲基绿（methyl green）形成沉淀。甲基绿由三个苯胺环构成，具有不同程度的甲基化，并带有两个正电荷，能够牢固地结合到DNA的大沟结构中^7,8。早期研究已证实甲基绿对DNA的染色具有高度特异性，这促使 Unn....

方案

1. 染料的纯化

1. 通过将0.4 g染色粉末溶解于10 ml蒸馏水中，配制4%的甲基绿水溶液。充分混匀直至完全溶解。
2. 在通风橱内，将该溶液与至少2份氯仿混合。重要的是需预先确认试管是否耐氯仿。
3. 充分混匀后，在2,000 x g条件下离心1 min ，以加速相分离。
4. 离心后，获得含有甲基绿的上层水相和含有氯仿及常见杂质结晶紫的下层有机相。
5. 收集上层相，并重复此步骤，直至下层相中完全不含有结晶紫。
6. 最后收集上层相，并用水稀释至甲基绿终浓度为2%。该储备液在实验台上可稳定保存数月，无需避光。

2. 使用甲基绿对完整斑马鱼胚胎进行荧光核染色

1. 在含4%甲醛（来自多聚甲醛）的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定胚胎过夜。
   注意：这一步骤可能需要数小时至过夜，具体时间取决于胚胎的厚度。在本示例中，我们固定了48小时的胚胎。 受精后（hpf）斑马鱼胚胎过夜培养。
2. 用 PBS-T（含 1% Triton X-100 的 PBS）清洗胚胎 3 次，每次 5 分钟。提高的去垢剂浓度可使角质层通透。
3. 用PBS-T将甲基绿（来自2%储备液）稀释成1:5,000至1:10,000的溶液。孵育过程中加入洗涤剂有助于处理斑马鱼胚胎和幼鱼等较厚的样本。
4. 将胚胎在溶液中....

结果

厚样本的细胞核染色。本文所述方案可实现对完整胚胎中深层结构的均匀染色。48小时斑马鱼胚胎中发育晶状体的细胞核被均匀标记（图1）。

甲基绿DNA染色能够区分细胞周期依赖性的形态学差异，例如识别有丝分裂相或凋亡细胞核（图2A）。在高分辨率下，亚核结构也清晰可见，如斑马鱼胚胎表皮细胞核所示（图2B）。

甲基绿在高强度长时间照射下具有抗光漂白性。当使用相同强度的633 nm激光照射时，甲基绿的细胞核染色不会发生光漂白，而另一种具有相似光谱特性的DNA特异性染料TO-PRO-3⁴则会出现漂白现象。实验选取整体封片的斑马鱼胚胎视网膜的一个共聚焦层面，使用63倍、1.4NA物镜放大以实现高强度照射。在相同条件下，TO-PRO-3染色的样品在持续照射60秒后即出现明显漂白（图3，上排图像），而甲基绿染色的样品即使在照射120秒后也未见明显光漂白现象（图3.......

讨论

近几十年来，显微技术不断发展，尤其是荧光显微技术的多种改进，使得研究完整组织样本（包括整个胚胎）的动态过程和结构成为可能^10,11。然而，一个主要的限制因素是缺乏高质量的荧光染料，可用于快速、直接地标记亚细胞结构。

最常用的荧光DNA染料（如DAPI或Hoechst）需用紫外光激发，并在可见光谱的蓝色区域发射荧光^2,3，因此不适合对完整组织中的深层结构进行成像。红光在生物样品中的穿透能力更强，使得发射红光的荧光染料更适用于此类研究¹²。自发荧光是胚胎组织中常见的问题，而使用发射红光的荧光染料也有助于克服这一问题⁵。

我们已证明，常用的组织学染色剂甲基绿在与DNA结合时是一种高效的红色荧光团，可用于显微镜、流式细胞术、荧光光度法或凝胶电泳中DNA的检测⁶。本文所述的利用甲基绿对完整胚胎进行荧光核染色的方案相对快速且简便。该技术成本低廉，且在实验室内稍加操作即可配制出适用于数百次实验的储存液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
甲基绿	Dr. G. Grübler		也测试了 Sigma-Aldrich 323829（无结晶紫）
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
激光共聚焦显微镜 Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
鬼笔环肽–四甲基罗丹明异硫氰酸酯	Sigma-Aldrich	P1951
氯仿	Sigma-Aldrich	372978
离心机 5810 R	eppendorf	5811 000.010
显微镜载玻片	Deltalab	D100004
盖玻片	Esco optics	R525025