一种优化的富集技术用于分离 节杆菌属 从土壤样本分离物中鉴定的噬菌体物种

摘要

我们介绍一种用于分离感染Arthrobacter属细菌的噬菌体的富集方案。该富集方法可快速、重复性地从土壤分离物中分离并扩增Arthrobacter噬菌体。

摘要

利用微生物学先驱所确立的原理，从环境样本中分离噬菌体已有数十年历史。然而，感染Arthrobacter宿主的噬菌体分离工作一直较为有限，这可能是因为此前许多分离技术的成功率较低，导致可用于研究的Arthrobacter噬菌体种类相对匮乏。本文所述的富集技术与多数传统方法不同，它采用经过滤且不含污染细菌的提取物作为指示菌——特指Arthrobactersp. KY3901——生长的基础培养基。通过首先去除土壤中的原有细菌，目标噬菌体在增殖过程中不会受到初始土样中土著细菌的竞争抑制。该富集方法已从多种不同类型的土壤中成功分离出数十种独特的噬菌体，甚至能从同一样本的富集培养物中获得不同类型的噬菌体。此方法可进一步拓展应用于大多数营养丰富的需氧培养基，以分离多种具有研究价值的宿主细菌中的噬菌体。

引言

Arthrobacter 属细菌在土壤环境中广泛存在，因此可从这类宿主细菌中分离出大量且多样化的噬菌体。Acintobacteriaceae 科的细菌成员最显著的特征是其降解难降解化合物（如阿特拉津及多种其他杀虫剂和除草剂）的分解代谢途径^1,2,3。尽管大多数研究使用的是环境来源的 Arthrobacter 菌株，但该属的临床分离株也已在血液、尿液、眼睛以及多种其他人体样本中发现，均表现出系统发育上的异质性⁴。

尽管关于Arthrobacter细菌的研究文献相当丰富，但报道能够感染这一多样性属中成员的噬菌体的研究却仅有少数。然而有趣的是，先前对Arthrobacter噬菌体的研究涉及若干关键的不同主题，例如土壤中Arthrobacter物种的分型⁵、在工业上用于减少活性污泥处理厂中有害泡沫的应用⁶，以及关于位点特异性重组和整合酶基因的研究⁷。

已采用多种富集技术方案来获得纯化的噬菌体分离株，用于Arthrobacter属物种。早期方法包括将土壤与尼古丁盐等有毒试剂混合后孵育超过一年⁸，从而获得仅能感染A. globiformis的噬菌体。后续研究表明，使用含有不稳定有机物渗透过的土壤可借助噬斑检测技术检出可观察的噬菌体，且无需漫长的孵育过程⁸。然而有趣的是，过去曾采用一种类似于直接涂布平板的技术，虽成功分离出多种噬菌体，但研究者的报告指出其成功率明显较低⁵，并引用了先前研究中成功率低的文献依据⁸。

总体而言，过去使用的分离技术在实际应用中效果甚微，尽管Arthrobacter属是自然界中最常见的需氧土壤分离菌^4,9,。Van Twest 和 Kropinski¹⁰ 提出了从水体和土壤中分离噬菌体的富集方法，这些方法改编自早期用于富集环境细菌分离物的技术，但这些富集技术在分离Arthrobacter噬菌体方面被证明效率低下。本文所述方法的目的是证明“概念可行性”，即早期的富集方法可以被改进，以稳定且有效地分离Arthrobacter噬菌体，从而克服此前从该细菌属中分离噬菌体所面临的技术难题。

方案

1. 噬菌体分离用Arthobacter菌细胞的制备

• 将接种于Luria Bertaini (LB) 琼脂平板上的 Arthrobactersp. KY3901 菌落置于30 °C培养2–3天。挑取单菌落，用无菌接种环将其接种至装有250 ml LB液体培养基的带挡板三角摇瓶中，在30 °C、225 rpm条件下于振荡培养箱中培养。
• 培养约24小时，以获得对数后期至稳定期初期的细菌细胞，用于后续噬菌体感染实验。密切监测细菌生长状态，避免细胞进入稳定期中后期。
  注意：进行下述噬菌体分离与纯化操作步骤时，菌液的光密度OD₆₀₀应维持在0.5–0.7之间。

2. 从土壤样品中收集噬菌体

1. 从目标地点采集 200–400 g 土壤。注意：由于节杆菌属（Arthrobacter）细菌是常见的土壤细菌，感染这些细菌的噬菌体也广泛存在于大多数类型的土壤中。
2. 加入至少 400 ml 噬菌体缓冲液（PB）[68 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)]。₄，加入10 mM Tris-CL（pH 7.5）至土壤中，混匀，置于足够大的烧瓶中，使上清液体积至少为200 ml，以便能够进行提取。
3. 轻轻搅拌或摇晃至土壤悬浮，静置使土壤沉淀，通常为30分钟。
4. 通过重力过滤将“土壤提取液”经滤纸过滤，以去除土壤沉淀物和碎屑。
5. 加入LB粉末并混匀，制成2%的溶液（在200 ml土壤提取物中加入4 g LB粉末）。
6. 通过真空过滤将溶液经0.22 µm滤膜过滤，以获得无菌滤液。若可能，应立即进行至步骤2.7。若有必要，可将过滤后的样品在4 °C下保存最多一周后再继续操作，但噬菌体颗粒的活性数量会有所下降。
7. 使用无菌技术，将过滤除菌的 LB/土壤提取物混合液分装至若干个 250 ml 无菌带挡板摇瓶中，每瓶 50 ml。加入无菌的 2.0 M CaCl₂₂ 将溶液稀释至最终所需浓度（0–50 mM），因为不同 节杆菌属 噬菌体在不同 CaCl₂ 浓度下生长达到最佳状态₂ 条件。
   注意：我们发现大部分 节杆菌属 噬菌体 我们鉴定的范围为1 mM–2.5 mM CaCl₂然而，我们分离出的几种噬菌体仅在0 mM CaCl条件下生长₂或在极高的 CaCl₂ 浓度。立即进行步骤 3.1。

3. 噬菌体分离

1. 向每个烧瓶中加入 1 至 2.5 ml 处于对数期末期/稳定期初期的细菌培养物。当 OD₆₀₀ 为 0.5–0.7 时，使用 1 ml 菌液；当 OD₆₀₀ 高于 0.7 时，使用 2.5 ml 菌液。
   注意：处于对数期生长的细胞通常比处于稳定期生长的细胞产生更多的噬菌体且滴度更高。
2. 将烧瓶置于摇床培养箱中，在 30 °C、250 rpm 条件下振荡培养约 24 小时。
3. 培养 24 小时后，从摇床培养箱中取出富集烧瓶，并用噬菌体缓冲液将富集样品稀释十倍。
4. 在培养管中加入 0.5 ml 处于对数期末期/稳定期初期的细菌培养物，并向各管中加入不同体积的富集培养物（将富集液用 PB 缓冲液稀释至 10^-1 后取 5 µl 至 500 µl）。
   注意：建议测试较宽范围的浓度，因为每个土壤样品在富集后产生的噬菌体滴度各不相同。
5. 向培养管中加入 CaCl₂，使其终浓度与原始富集烧瓶中的浓度一致。使用一系列不同浓度的 CaCl₂，以筛选出具有不同 CaCl₂ 依赖性的多种噬菌体。
   注意：大多数噬菌体在 1–2.5 mM 的 CaCl₂ 浓度范围内可被分离，但也存在在 0–50 mM CaCl₂ 范围内均可被有效分离的噬菌体。因此，为最大化获得独特的 Arthrobacter 噬菌体数量，最好检测一系列 CaCl₂ 浓度。
6. 在培养管中混入 4.5 ml LB 上层琼脂，然后将混合物倒入 LB 琼脂平板中。轻轻旋转平板使上层琼脂均匀分布，静置约 15 分钟使其凝固。
   注意：上层琼脂可批量配制（如 250 ml），多余的上层琼脂可在室温下保存，并在后续实验中重复使用，至少可稳定两周。尽管存在多种上层琼脂配方，本实验采用的是将 7 g/L 琼脂溶于 LB 培养基中的配方。实验过程中可将上层琼脂置于 60 °C 水浴中以维持液态。
7. 将平板倒置，在所需温度下（通常为 30 °C）过夜培养至 48 小时。可根据具体情况调整培养条件以优化噬菌体的生长。大多数分离到的噬菌体来自在 30 °C、含 1–2.5 mM CaCl₂ 的条件下培养 24 小时的平板。

4. 噬菌体纯化

1. 24小时孵育后检查平板上是否形成噬斑。若未见明显噬斑，或需观察是否有更多噬斑出现，可继续孵育至72小时。如有需要，可将疑似出现噬斑的平板在4 °C保存最多一周，再继续后续操作。
   ​注意：在同一块平板上发现多种不同形态的噬菌斑并不罕见。孵育3天后发现噬菌斑是可能的，但较为罕见。
2. 使用划线噬菌斑法从清晰分离的噬菌斑中纯化目标噬菌体。用无菌木棒接触噬菌斑，将木棒通过火焰灭菌，待其短暂冷却后，以如图所示的轻柔动作在琼脂平板上划线涂抹该噬菌斑。 图1每次操作均需使用新的棉签。
3. 或者，可采用传统的噬菌斑滴定法来分离单个噬菌斑。噬菌斑滴定法需要使用较多试剂，如LB琼脂和LB上层琼脂，以及培养皿等材料用于噬菌斑的分离。我们使用划线噬菌斑法已取得很高成功率，但从技术上讲，使用噬菌斑滴定法更易于分离单个噬菌斑。
4. 在LB琼脂平板上至少划线三次后，标记出疑似噬菌体颗粒浓度最低的区域，并轻轻加入0.5 ml的 节杆菌属 以及4.5 ml熔化的LB上层琼脂（含有与母板相同浓度的氯化钙），并使其均匀铺展于平板表面。
5. 倒置平板，过夜培养。至少重复三次划线纯化操作，以确保分离得到纯的噬菌体种。若需在划线间隔期间保存，可将平板置于4 °C保存一周，噬菌体活性不会显著降低。
6. 当在最终划线平板上培养并分离出目标噬斑后，用微量移液器枪头接触一个分离良好的噬斑，将其重悬于 100 µl PB 中。对此样品进行连续梯度稀释 10⁰ 溶液稀释至10^-8 通过将20 µl样品加入180 µl新鲜PB中进行稀释。
7. 将每种稀释液各取 10 µl 加入 0.5 ml 培养物中 Arthrobacter 在室温下于培养管中孵育5至10分钟，然后将感染的细菌与4.5 ml含相同浓度CaCl₂的熔融LB上层琼脂混合，涂布平板₂ 用于从原始土壤样品中分离噬菌体。将所有稀释液于4 °C保存至次日。
8. 确定使用传统噬菌斑滴定法所需噬菌体的系列稀释度，以获得网状图案。噬菌斑滴定法的目的是确定获得网状图案平板所需的噬菌体滴度。网状图案平板的特征是几乎无细菌生长，但含有尚未被噬菌体裂解的细菌残留物。加入5 ml处于对数晚期/稳定期早期的细菌培养物 节杆菌属 将培养物转移至无菌的50 ml培养瓶中。
   1. 加入100 µl该稀释液（即产生网状图案的稀释度）至 节杆菌属 在培养瓶中的培养物）中加入噬菌体，室温下孵育5至10分钟，使其感染细菌细胞。随后与含有相同浓度CaCl₂的熔融LB上层琼脂混合。₂ 用于初步鉴定噬菌体，并将5 ml该混合物涂布于10块新鲜的LB平板上。待其凝固后，将平板倒置，于30 °C培养。
9. 第二天，用 5 ml PB 液完全浸没网状板，4℃ 过夜孵育 4 °C 下孵育 4 小时或室温下孵育 4 小时
10. 将噬菌体裂解液通过0.22 µm针头滤器过滤，于4 °C保存。将此最终噬菌体储备液用于后续实验，如噬菌体颗粒的透射电镜观察、噬菌体基因组DNA的提取以进行限制性内切酶分析，以及采用标准方法进行基因组测序。如需长期保存噬菌体储备液，可将等体积的噬菌体裂解液与无菌甘油混合，分装至小管中，于-80 °C存储备用。
    注意：对于不熟悉这些噬菌体技术的人员， 一个重要的资源是可在线访问的网站 www.phagesdb.org。

结果

为了验证改良后的Arthrobacter噬菌体富集技术的可重复性，我们在2014年春季和夏季的不同时间与地点共使用了30份不同的土壤样品。在这30份土壤样品中，利用该富集方法从22份样品中成功分离出独特的Arthrobacter噬菌体；而采用标准富集程序仅从相同的土壤样品中的3份中获得独特噬菌体。富集样品的噬菌体滴度可能非常高，需要进行初始稀释以分离噬菌斑；也可能滴度相对较低，需使用更大体积的富集Arthrobacter培养物才能成功检测到噬菌斑。在初步富集并接种于LB琼脂培养基后，我们采用噬菌斑划线法分离纯的噬菌体群体（图2）。 alternatively，也可使用传统的标准噬菌斑滴度测定法来获得纯的噬菌体克隆，但该方法耗时更长，且需要更多的试剂和材料。如前所述，我们确实使用噬菌斑滴度测定法来经验性地确定噬菌体滴度数值以及形成平板上网状结构所需的噬菌斑形成单位（PFU）数量。图3展示了噬菌体Banana的一系列连续稀释结果，并显示了其中一个平板上理想的网状模式形态。图4展示了利用该...

讨论

尽管此前已多次尝试分离能够感染Arthrobacter宿主的噬菌体，但使用标准富集方法时收效甚微。van Twest 和 Kropinski 开发并改进的用于从环境样品中富集噬菌体的通用细菌富集方法¹⁰，至今仍是大多数富集程序的基础。以往研究的证据表明，直接涂布法虽能在此类Arthrobacter菌株上产生可检测的噬菌斑，但分离成功率极低⁵。在直接涂布法中，噬菌体从土壤样品中用噬菌体缓冲液提取，并经过滤以去除污染性细菌。将含有噬菌体颗粒的滤过提取物加入目标细菌宿主中，使其感染宿主细胞，随后直接涂布，无需额外的细菌增殖和噬菌体扩增步骤。

我们的富集技术具有良好的稳健性，并针对从Arthrobacter sp. KY3901中相对简便地分离Arthrobacter噬菌体进行了优化。在传统的富集程序中，噬菌体与土壤样品中存在的多种细菌一同被从土壤中提取到噬菌体缓冲液中，然后加入含有目标宿主细菌的新鲜培养基中，以进行噬菌体感染。而在本富集方法中，通过0.22 µm滤膜过滤，可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤粉末	Fisher	BP9722-2	建议批量订购。
颗粒状琼脂	Fisher	BP1423-2	建议批量订购。
0.22 µm 注射器滤器	Fisher	09-719A
0.22 µm 布氏滤器	Fisher	430320	通过小心更换接收管，可获得超过 50 ml 的液体。
Eppendorf 管	Fisher	05-408-129
5 ml 单独刻度移液管	Fisher	13-678-11D
50 ml 锥形管	Fisher	76002844
15 ml 锥形管	Fisher	76002845
10 ml 单独刻度移液管	Fisher	13-676-10J
25 ml 单独刻度移液管	Fisher	13-676-10K
Whatman 定性滤纸	Fisher	1001-824