我们介绍一种用于分离感染Arthrobacter属细菌的噬菌体的富集方案。该富集方法可快速、重复性地从土壤分离物中分离并扩增Arthrobacter噬菌体。
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本文内容
摘要
摘要
利用微生物学先驱所确立的原理，从环境样本中分离噬菌体已有数十年历史。然而，感染Arthrobacter宿主的噬菌体分离工作一直较为有限，这可能是因为此前许多分离技术的成功率较低，导致可用于研究的Arthrobacter噬菌体种类相对匮乏。本文所述的富集技术与多数传统方法不同，它采用经过滤且不含污染细菌的提取物作为指示菌——特指Arthrobactersp. KY3901——生长的基础培养基。通过首先去除土壤中的原有细菌，目标噬菌体在增殖过程中不会受到初始土样中土著细菌的竞争抑制。该富集方法已从多种不同类型的土壤中成功分离出数十种独特的噬菌体，甚至能从同一样本的富集培养物中获得不同类型的噬菌体。此方法可进一步拓展应用于大多数营养丰富的需氧培养基，以分离多种具有研究价值的宿主细菌中的噬菌体。
引言
Arthrobacter 属细菌在土壤环境中广泛存在，因此可从这类宿主细菌中分离出大量且多样化的噬菌体。Acintobacteriaceae 科的细菌成员最显著的特征是其降解难降解化合物（如阿特拉津及多种其他杀虫剂和除草剂）的分解代谢途径1,2,3。尽管大多数研究使用的是环境来源的 Arthrobacter 菌株，但该属的临床分离株也已在血液、尿液、眼睛以及多种其他人体样本中发现，均表现出系统发育上的异质性4。
尽管关于Arthrobacter细菌的研究文献相当丰富，但报道能够感染这一多样性属中成员的噬菌体的研究却仅有少数。然而有趣的是，先前对Arthrobacter噬菌体的研究涉及若干关键的不同主题，例如土壤中Arthrobacter物种的分型5、在工业上用于减少活性污泥处理厂中有害泡沫的应用6，以及关于位点特异性重组和整合酶基因的研究7。
已采用多种富集技术方案来获得纯化的噬菌体分离株，用于Arthrobacter属物种。早期方法包括将土壤与尼古丁盐等有毒试剂混合后孵育超过一年8，从而获得仅能感染A. globiformis的噬菌体。后续研究表明....
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方案
1. 噬菌体分离用Arthobacter菌细胞的制备
- 将接种于Luria Bertaini (LB) 琼脂平板上的 Arthrobactersp. KY3901 菌落置于30 °C培养2–3天。挑取单菌落，用无菌接种环将其接种至装有250 ml LB液体培养基的带挡板三角摇瓶中，在30 °C、225 rpm条件下于振荡培养箱中培养。
- 培养约24小时，以获得对数后期至稳定期初期的细菌细胞，用于后续噬菌体感染实验。密切监测细菌生长状态，避免细胞进入稳定期中后期。
注意：进行下述噬菌体分离与纯化操作步骤时，菌液的光密度OD600应维持在0.5–0.7之间。
2. 从土壤样品中收集噬菌体
- 从目标地点采集 200–400 g 土壤。注意：由于节杆菌属（Arthrobacter）细菌是常见的土壤细菌，感染这些细菌的噬菌体也广泛存在于大多数类型的土壤中。
- 加入至少 400 ml 噬菌体缓冲液（PB）[68 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)]。4，加入10 mM Tris-CL（pH 7.5）至土壤中，混匀，置于足够大的烧瓶中，使上清液体积至少为200 ml，以便能够进行提取。
- 轻轻搅拌或摇晃至土壤悬浮，....
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结果
为了验证改良后的Arthrobacter噬菌体富集技术的可重复性，我们在2014年春季和夏季的不同时间和地点共采集了30份不同的土壤样品。在这30份土壤样品中，利用该富集方法从22份样品中成功分离出独特的Arthrobacter噬菌体；而采用标准富集程序仅从相同的土壤样品中的3份中获得了独特的噬菌体。富集样品中的噬菌体滴度可能非常高，需要进行初始稀释才能分离出噬菌斑；也可能滴度相对较低，需要使用更大体积的富集Arthrobacter培养物才能成功检测到噬菌斑。在完成初步富集并在LB琼脂平板上接种后，我们采用噬菌斑划线法分离纯化的噬菌体群体（图2）。此外，也可使用传统的标准噬菌斑滴度测定法来分离纯噬菌体克隆，但该方法耗时更长，且需要更多的试剂和材料。如前所述，我们确实使用噬菌斑滴度测定法来实证测定噬菌体滴度数值以及形成平板上网状结构的噬菌斑形成单位（PFU）数量。图3展示了噬菌体Banana的一系列连续稀释结果，并显示了其中一块平板上理想的网状模式。图4展示了利用该富集技术分离得到的2.......
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讨论
尽管此前已多次尝试分离能够感染Arthrobacter宿主的噬菌体，但使用标准富集方法时收效甚微。van Twest 和 Kropinski 开发并改进的用于从环境样品中富集噬菌体的通用细菌富集方法10，至今仍是大多数富集程序的基础。以往研究的证据表明，直接涂布法虽能在此类Arthrobacter菌株上产生可检测的噬菌斑，但分离成功率极低5。在直接涂布法中，噬菌体从土壤样品中用噬菌体缓冲液提取，并经过滤以去除污染性细菌。将含有噬菌体颗粒的滤过提取物加入目标细菌宿主中，使其感染宿主细胞，随后直接涂布，无需额外的细菌增殖和噬菌体扩增步骤。
我们的富集技术具有良好的稳健性，并针对从Arthrobacter sp. KY3901中相对简便地分离Arthrobacter噬菌体进行了优化。在传统的富集程序中，噬菌体与土壤样品中存在的多种细菌一同被从土壤中提取到噬菌体缓冲液中，然后加入含有目标宿主细菌的新鲜培养基中，以进行噬菌体感染。而在本富集方法中，通过0.22 µm滤膜过滤，可.......
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披露
作者声明不存在竞争性经济利益。
致谢
本实验方案的开发经费由宾夕法尼亚东南部高等教育联盟和卡布里尼学院科学系提供。额外的资金和支持来自阿卡迪亚大学和因麦库莱塔大学。我们特别感谢圣约瑟夫大学的Karen Snetselaar博士，她为我们分离的噬菌体提供了透射电子显微镜图像。 霍华德·休斯医学研究所科学教育联盟噬菌体猎手推进基因组学与进化科学项目（SEA-PHAGES）也提供了额外支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB 肉汤粉末 | Fisher | BP9722-2 | 建议批量订购。 |
| 颗粒状琼脂 | Fisher | BP1423-2 | 建议批量订购。 |
| 0.22 µm 注射器滤器 | Fisher | 09-719A | |
| 0.22 µm 布氏滤器 | Fisher | 430320 | 通过小心更换接收管，可获得超过 50 ml 的液体。 |
| Eppendorf 管 | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 ml 单独刻度移液管 | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 ml 锥形管 | Fisher | 76002844 | |
| 15 ml 锥形管 | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml 单独刻度移液管 | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 ml 单独刻度移液管 | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman 定性滤纸 | Fisher | 1001-824 |
参考文献
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C.
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