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方法文章

使用离子选择性自参考微电极技术测量细胞外离子流

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DOI：

10.3791/52782

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2015年5月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

本文内容

摘要

细胞膜中的转运蛋白能够介导离子在细胞膜或细胞层之间的选择性分布，在组织生理、修复及病理过程中发挥关键作用。本文介绍了离子选择性自参照微电极技术，该技术可用于测定单个细胞和组织的特定离子流。 体内.

摘要

动物、植物及单细胞的细胞由一种称为细胞膜的屏障包裹，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。上皮等细胞层也形成屏障，将多细胞生物体的内部与外部或不同区室分隔开。这些屏障的一个关键特征是离子在细胞膜或细胞层两侧的差异性分布。这种分布依赖于两个特性：1）细胞膜和上皮对特定离子具有选择性通透性；2）离子通过泵在细胞膜和细胞层中被主动转运。这些特性在维持组织生理功能中起着至关重要的作用，并在损伤后、修复过程中或病理状态下作为信号提示发挥作用。离子选择性自参照微电极可用于测量钙、钾或钠等离子在单个细胞和组织水平上的特定通量。该微电极内含一种对特定离子具有选择性通透性的离子载体混合物。电极内部填充液含有已知浓度的目标离子。微电极的电势由外部环境中该离子的浓度决定。随着离子浓度的变化，微电极的电势随之呈离子活度对数函数关系改变。当微电极在某一离子源或汇附近来回移动时即 由于离子流动形成的浓度梯度，微电极电位会发生振幅与离子流/浓度梯度成正比的波动。放大器对微电极信号进行放大，输出信号被记录在计算机中。随后，可利用菲克扩散定律，结合电极电位波动、微电极的位移以及其他参数（如特定离子的迁移率）计算出离子流。本文详细描述了使用离子选择性自参照微电极测量细胞外离子流的方法，并展示了一些代表性结果。

引言

所有动物细胞都被一层脂质双分子层膜所包围，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。细胞通过主动运输离子来维持膜内为负的电膜电位1。膜电位是一种储存的能量形式，细胞可利用它驱动膜上的各种分子装置2。神经元及其他可兴奋细胞具有较大的膜电位。钠离子通道的快速开放会导致膜电位崩溃（去极化），从而产生动作电位，并沿神经元传导2。除了这些快速的电变化外，许多组织和器官还能产生并维持显著的长期电位。例如，皮肤和角膜上皮细胞通过定向泵送离子（主要是钠离子和氯离子）来产生并维持跨上皮电位和细胞外电流传导3。

尽管使用振动探针4-6测量内源性细胞外电流传导，以及使用微电极系统7-10测量膜电位或跨上皮电位，能够实现对细胞膜和上皮细胞层电学参数的测定，但这些方法无法指明所涉及的离子种类。

带有选择性离子载体的微电极可测量溶液中特定离子的浓度。通过在不同位置放置两个或多个电极，可以测量离子梯度或通量。然而，每个探针固有的电压漂移各不相同，可能导致测量结果不准确，甚至检测出实际不存在的梯度。采用“自参考”模式的单个电极在两个点之间以低频移动，可解决这一问题。此时，离子通量可在相对缓慢且稳定的信号漂移背景下被检测到（见图3B）。

离子敏感测量系统采用离子选择性自参考微电极，用于检测靠近组织或单个细胞的微小细胞外离子流。该系统由一个放大器组成，用于处理微电极的信号，以及一个微步进电机及其驱动装置，用于控制微电极的运动。离子选择性微电极和用于闭合电路的参比电极通过前置放大头段连接至放大器（图1A）。计算机软件设定微电极运动的参数（频率、距离），并同时记录放大器的输出信号。步进电机通过三维微位移装置控制微电极的移动。低频振动式离子选择性微电极最早于1990年开发，用于测量特定的钙离子流11。除了钙离子外，目前已有 commercially accessible 离子载体混合物，可用于制备对钠、氯、钾、氢、镁、硝酸根、铵、氟、锂或汞离子敏感的微电极。

基本原理是，自参照离子选择性微电极技术可将溶液中特定离子的活度转化为可由电压表测量的电势。离子载体混合液是一种不混溶的液体（有机、亲脂性）相，具有离子交换特性。离子载体可逆地选择性络合（结合）特定离子，并将其在微电极内部的水溶液（电解液）与微电极所浸入的外部水溶液之间进行转移（图1D）。这种离子转移导致电化学平衡，电压表测量的是微电极与参比电极之间电势的变化。根据能斯特方程，测得的电压与特定离子活度的对数成正比，从而可计算出该离子的浓度（图2A 和 B）。

目前，已有多种系统可采用类似的概念或原理来测量离子流。例如，扫描离子选择性电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）12,13，以及由Newman和Shabala开发的微电极离子流估算技术（Microelectrode Ion Flux Estimation, MIFE）14-16，均已实现商业化，并被科研界广泛用于测定多种动物、植物及单细胞模型中细胞膜和组织上的特定离子流。离子选择性微电极已被用于测量植物根部的氢离子、钾离子和钙离子流17，大鼠脑动脉18和花粉管19中的氯离子流，鳐视网膜细胞中的氢离子流20，小鼠骨骼中的钙离子流21，真菌菌丝22和大鼠角膜23中的多种离子流，以及单细胞伤口愈合过程中的钙离子流12,24。有关离子选择性自参考微电极的详细信息，请参见以下综述25。

以下文章详细描述了如何在单细胞水平上利用离子选择性自参照微电极技术，制备并测量内源性细胞外离子流。

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方案

1. 离子选择性自参考微电极的制备

  1. 离子选择性微电极的制备
    1. 使用微电极拉制仪加热拉制无细丝的薄壁硼硅酸盐毛细管（外径 1.5 mm，内径 1.12 mm）。
      注意：这将得到直径为3-4 µm的尖端。较细的尖端具有更高的电阻，会使微电极更容易受到电子噪声干扰，且对离子浓度变化的响应更慢。相关信息可参见Smith发表的论文 等.26.
    2. 硅烷化电极以使内表面具有疏水性，有助于保留亲脂性离子载体混合物。将微电极置于金属架中，并在烘箱中加热过夜 >100 °C 烘干。支架为一块金属板，上面钻有直径 2 mm、未贯穿的孔。将电极尖端朝上插入孔中，并用一个 250 ml 玻璃烧杯罩住电极。
    3. 早晨，关闭烤箱电源，戴上隔热手套，小心取出带有电极和烧杯的金属架。关闭烤箱门以保留热量。
    4. 佩戴乳胶或丁腈手套、实验服并佩戴护目镜。使用塑料巴斯德移液管，将一滴硅烷化溶液 I 加至每个电极的底部（保持烧杯原位；通过倾倒口插入移液管）。硅烷化溶液在加热板上挥发，使电极内部发生硅烷化。此步骤需在化学通风橱中进行。将支架/烧杯/电极放回热烘箱中数小时，以使残留的硅烷化溶液完全蒸发。
      注意：出于安全考虑，切勿重新开启烤箱。在烤箱上贴上标签，注明不得接通电源，因其可能含有有害且易燃的蒸气。
    5. 冷却后，将微电极存放在装有400 g干燥剂的玻璃干燥器内的微电极储存罐中。微电极可在此条件下保存数周。
      注：Smith 中描述了一种替代的硅烷化方法 等26
    6. 用含有待测离子浓度为 100 mM 的溶液反向填充微电极，体积为 50 至 100 µl（长度约 1 cm）（参见 表1 和 图1B）。使用一次性塑料巴斯德吸管，在本生灯上加热拉制成细丝状。用去离子水冲洗吸管2O 随后以防止堵塞。
      注意：或者，可调节灌注液的离子浓度，使其与外部溶液中的离子浓度相匹配27.
    7. 在解剖显微镜下观察微电极，确保无气泡存在。
      1. 若有气泡存在，可将微电极垂直持握（尖端朝下），用指甲轻敲电极，和/或使用装有硅胶管替代针头的注射器施加反向压力，将气泡从尖端推出。
    8. 用微电极填充仪将15至20 nl（长度为30–50 µm）的离子选择性离子载体混合液填充至微电极中（参见 表1将一小滴离子载体混合液置于载玻片的短边上。在解剖显微镜下观察微电极尖端，移动微电极使其尖端接触离子载体混合液约半秒钟。通过毛细作用力将离子载体混合液吸入微电极内。
      注意：避免形成过长的离子载体混合液液柱，因为这会增加探针的电阻，可能导致电子干扰（噪声），并减缓响应速度。
    9. 将微电极安装在带有1 mm金色公头连接器和AgCl(Ag)的直式微电极夹持器中+）导线（图1B).
    10. 将微电极夹持器连接到安装在三维计算机控制电子显微操作器上的头架上（图1A).
    11. 将微电极尖端置于适合待测样品的测量溶液中（如生理盐水、培养基， 等等。以使微电极稳定1至2小时，甚至过夜。
  2. 参比电极的制备
    1. 参比电极（图1C）与上述毛细管相同。使用金刚石笔将毛细管切割为5 cm长的片段，并在每端用火焰抛光1–2秒。 在本生灯火焰中。
    2. 用约 200 µl 的 3 M NaCl 溶液填充这些电极，CH3CO2K（乙酸钾）或 KCl 加 2% 琼脂糖。根据待测离子选择溶液（参比电极中不应含有待测离子；见 表1）。将琼脂糖与溶液混合，放入微波炉加热至接近沸腾。搅拌以溶解琼脂糖（溶液变为澄清）。
    3. 将参比电极固定在塑料巴斯德移液管上，并将热溶液吸入毛细管中。
    4. 将电极浸入冰冷的 3 M NaCl 溶液中，CH3CO2K 或 KCl 溶液，并在使用前将其储存在密封管中的 3 M 溶液中。若参比电极中存在气泡，则应弃用。
    5. 将参考电极安装在直型微电极夹持器中（预先填充3 M溶液），并使用AgCl(Ag)+)沉淀物内部和一个2 mm金色公头连接器（图1C并将电极及其固定器安装到磁性支架上固定的机械微调装置上。

2. 离子选择性自参照微电极校准

  1. 配制含有目标离子的校准溶液，其离子成分与参考溶液相同；参见表1。待测样品所处溶液中的离子浓度应位于校准溶液浓度范围之内（例如培养基、生理盐水）。即其中一种校准溶液的离子浓度应低于待测溶液，另一种则应高于待测溶液。
    1. 例如，使用含有1 mM K+的生理盐水。为涵盖该浓度范围，将KCl粉末溶于去离子水中，通过连续稀释配制成10、1和0.1 mM的溶液。使用这些溶液作为校准液。或者，至少使用其中两种浓度的溶液。
  2. 将离子选择性微电极和参比电极浸入每种校准溶液中，待电压值稳定1至3分钟 后，使用专用软件记录相应的电压值（参见表1）。
  3. 由于软件将数据（放大器输出）保存为txt文件，需将数据复制到电子表格中。绘制微电极输出（mV）相对于摩尔离子浓度对数值的关系图（图2A）。
  4. 进行线性回归分析，计算能斯特斜率、截距和R2值。对于单价离子，若能斯特斜率为58 ± 11 mV/十倍浓度；对于二价离子，若为29 ± 11 mV/十倍浓度，则可接受该微电极（阳离子的能斯特斜率为正值，阴离子为负值）。此外，性能良好的微电极应具有较强的线性相关性（R2 >0.9；图2B）。
    注意：此处使用的放大器输出的mV值具有10倍增益，因此读数需除以10进行校正。
  5. 利用线性回归公式将微电极的原始mV输出转换为实际的离子浓度（图2B）。

3. 离子选择性微电极技术的验证

  1. 制备人工来源
    1. 人工制备的毛细管与上述毛细管相同。使用微电极拉制仪按照步骤1.1.1进行加热拉制。
    2. 用 200 µl 的 1 M NaCl、KCl、CaCl 溶液回填这些毛细管22 H2O 或 pH 4 缓冲液。根据待测离子选择相应的人工源溶液（参见 表1).
      注意：也可使用尖端直径较大（约 20 µm）的电极，并用含有 0.5–1% 琼脂糖的相同溶液填充尖端（琼脂糖可防止溶液产生整体流动）。
    3. 将人工源毛细管安装在显微操作器上，并浸入用于测量样品中离子流速的溶液中。将人工源在溶液中静置30分钟。 1小时内使梯度稳定。
  2. 离子选择性微电极的验证
    1. 将离子选择性微电极浸入用于测量样品离子流的溶液中，位置位于人工源毛细管约一厘米处，并如前所述用参比电极闭合电路。让电压值稳定1至3分钟。 使用专用软件记录1至2分钟的相应电压值。该值对应于缓冲液值（在文献中也称为参考值、背景值或空白值）。
    2. 将离子选择性微电极移至距人工源约5 µm处，使电压值稳定1至3分钟 使用软件记录相应电压1至2分钟。
    3. 将离子选择性微电极分别置于距离人工源毛细管 10、20、40、80、160、320、640 和 1280 µm 的位置，重复上述操作步骤。
    4. 将数据导出为 txt 文件，并将数值复制到电子表格文件中。
  3. 根据校准值的相同方法，计算与毫伏（mV）值对应的离子浓度。绘制该数值。
    注意：如果存在离子流，微电极会检测到两个位置之间的离子浓度差异 （图3B））。如果人工源中所测离子的浓度高于溶液中的浓度，则靠近源的位置离子浓度应高于远离源的位置，从而验证离子选择性微电极能够正确检测离子流的方向（本例中为外流；对于人工汇，即特定离子浓度低于测量介质的情况，则应为内流）。
    1. 使用菲克扩散定律计算离子流： J = c µ (dc/dx) 其中 c 溶液中的离子浓度（mol/cm³）-3), µ 是离子迁移率（mol cm N-1 秒-1），以及 直流 是单位距离上的浓度差 dx （厘米）（图2C）。离子流数据通常以 pmol cm-2 s-1或 nmol cm-2 秒-1.
      注意：Smith 描述了一种离子流计算的替代方法 等26. 可使用该方法。主要区别包括采用扩散系数替代离子迁移率，以及减去背景离子流（也称电压漂移或校正因子），后者通过测量不含样品的盐溶液中的离子流获得。
    2. 将每一步离子流的平均值对距离源的距离作图（图 2D). 远离信号源时，可观察到通量值呈指数下降，验证了离子选择性微电极感知不同强度离子通量的能力。
    3. 对每种拟记录的特定离子，均需进行一次人工源验证，以确认其方向和幅度测量的准确性，并确保具有较高的信噪比。
      注意：在无样品的情况下对缓冲液进行离子流测定，可得到背景水平或噪声值。通常情况下，缓冲液的测定结果显示离子浓度无明显波动，因而离子流极小，且方向多变。

4. 测量室的准备

注意：在实验前，需考虑待测样品及其在微电极测量中如何安装和固定。

  1. 进行Xenopus laevis卵母细胞测量时，剪取一块1 cm见方的800 µm尼龙网（nitex网），并将其粘接到塑料培养皿中（图1E）。

5. 离子流测定

  1. 以与校准溶液相同的方法，测定用于样品测量的缓冲液中的离子浓度。X. laevis 卵母细胞需使用Mark’s改良林格液（MMR）。将NaCl、KCl、CaCl、MgCl和HEPES溶解于去离子水中，使其终浓度为（mM）：100 NaCl、2 KCl、2 CaCl、1 MgCl和5 HEPES。用NaOH将缓冲液的pH值调节至7.5。
  2. 将样品放入测量室中，使用显微操作器将离子选择性微电极移至靠近样品的位置（距离约10 µm），以确定微电极的“近位”位置（图3A）。
  3. 使用专用软件启动微电极在“近位”与远离样品的“远位”之间的低频（0.3 Hz）往复运动（行程100 µm）。确保微电极的运动方向垂直于样品表面。
    注意：微电极的往复行程可在软件中设定。较大的行程可增强梯度读数，有助于在测量过程中更易检测到微小的离子流，但会延长采样间隔，降低时间分辨率。示例见图3A。
  4. 使用软件开始记录。微电极在每个位置短暂停留，计算机记录以mV为单位的电势值。至少记录2分钟，以确保信号稳定。对于短时间序列实验，需在整个实验过程中持续记录感兴趣位置的电势变化。
  5. 将数据导出为txt文件，并将数值复制到电子表格文件中。
  6. 按照与校准值相同的方法，计算对应mV值的离子浓度，并绘制数值曲线。
    注意：若存在离子流，微电极将在两个位置之间检测到离子浓度的差异（图3B）。
  7. 如前所述（步骤3.3.1），利用菲克扩散定律计算离子流。
  8. 在测量新样品前需重新测定缓冲液，并对每个新样品重复离子流的测量与计算过程。

6. 统计分析与数据展示

  1. 使用具有混合效应的协方差分析（ANCOVA）模型28，检验在对照条件下位置和/或时间对离子流的独立影响。
    注意：协方差分析（ANCOVA）是一种广义线性模型，通过结合常规方差分析（ANOVA）与回归分析，允许将分类变量和连续变量同时作为自变量使用。此外，当因个体重复测量或潜在的嵌套效应导致误差相关时，采用混合效应模型可准确估计固定效应与随机效应。
  2. 采用 Student t 检验进行组间水平的两两比较，并对多重检验进行 Bonferroni 校正28。
  3. 绘制箱形图，按位置和时间汇总离子流测量结果。图中应包含上述两两比较 Student t 检验所得的 p 值（图 3D），并按以下方式标示 p 值的显著性水平：*：p <0.05；**：p <0.01；***：p <0.00129

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结果

我们先前已证明，单细胞损伤后会出现钙离子内流24。因此，我们提出疑问：单细胞损伤是否还会引发其他离子流变。我们采用了X. laevis卵母细胞，这是一种广泛用于单细胞伤口修复30-34和电生理记录研究的成熟模型24,35-39。有趣的是，X. laevis卵母细胞内部的钾离子浓度（约110 mM）40高于所用的细胞外溶液（在MMR 1x中：1 mM），这提示损伤后可能发生钾离子外流。为验证这一假设，我们利用离子选择性自参照微电极，检测了X. laevis卵母细胞细胞膜修复过程中钾离子的流动情况。

为损伤卵母细胞，首先拉制一个尖端较大（约 50 µm）的毛细管电极。将电极固定在直型电极夹持器上，并安装至手动微操纵器。通过电极尖端接触细胞膜来造成损伤24。损伤后不久，我们检测到大量钾离子外流（最高达 250 nmol cm-2 sec-1；图 3B...

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讨论

成功测量细胞外离子流的最关键步骤 体内 包括：降低噪声、正确制备离子选择性微电极和参比电极，以及样品和两支电极的准确定位。

为尽量减少噪声，记录系统应置于接地的法拉第屏蔽笼内，最好使用带有金属顶板的隔振台，且该隔振台也应接地。此外，显微镜的机架也应接地。电噪声的来源包括光源。采用光纤“无风扇”光源可产生最小的电噪声。最后，保持微电极夹持器中的银丝和银粒处于氯化状态也有助于最小化噪声（浸入次氯酸钠漂白液中氯化，随后用去离子水冲洗）。2O) 离子选择性微电极或参比电极中若存在气泡，将导致测量失败，因为微电极的导电性会因此丧失或受损。因此，在将电极安装至电极夹持器前，必须在显微镜下检查电极。有关去除气泡的详细步骤，请参见实验方案。为确保结果可靠且可重复，必须准确定位样品和微电极。离子流的测量依赖于微电极的位移及其相对于样品的位置。必须精确定位样品上待测的目标区域，并调整微电极使其相对于样品表面做垂直移动。若微电极的移动方向不垂直于样品表面，将导致离子流测量值发生偏差，并增加样品间的变异程度。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会（MCB-0951199）、美国国立卫生研究院（NIH）EY01910 项目、加州再生医学研究所（CIRM）RB1-01417 项目以及葡萄牙科学技术基金会（FCT）SFRH/BD/87256/2012 项目的部分资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IonAmp  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA无由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制的放大器；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
IonAmp32  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA无由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心开发的软件；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
前置放大器探头 BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心设计的BSR电压跟随器INA116；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
MicroStep驱动器 BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA无需要三个MicroStep驱动器用于X、Y和Z方向的定位；由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
手动微调定位器  World Precision Instruments 型号 KITE-R类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
磁性支架   World Precision Instruments型号 M10类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
防震台  Newport Inc.     型号 VW-3036-OPT-023040类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
三维微调定位器组件：带槽面90°角支架Newport Inc.     型号 360-90组装三维微调定位器还需配备三个用于X、Y、Z控制的电动旋转电机，MPH-1安装臂配MCA-2可调角度立柱，以及多种Newport连接件和螺钉，用于固定在防震台上
三维微调定位器组件：0.5英寸X向行程燕尾槽滑台Newport Inc.     460PD-X无
三维微调定位器组件：快速安装线性滑台，0.5英寸XY行程Newport Inc.460A-XY无
无内丝薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管，Kwik-Fil型 World Precision Instruments TW150-4无
电极拉制仪 Narishige PC-10无
金属支架自制无自制金属电极架，使用钢制10 cm × 15 cm矩形底板，钻出直径2 mm、间隔0.5 cm的孔
烘箱QL型号 10 实验室烘箱无
硅烷化溶液I Sigma-Aldrich85126具有危险性，请按供应商建议操作 
玻璃培养皿；派热克斯（Pyrex）Fisher Scientific316060无
电极/微量移液管储存罐World Precision Instruments E215无
玻璃干燥器Fisher Scientific08-595E内含Drierite干燥剂（W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA）。在密封圈上涂抹凡士林以确保气密性。
塑料巴斯德移液管 Fisher Scientific11597722无
本生灯Fisher ScientificS97329无
显微镜载玻片Sigma-AldrichS8902无
直型微电极架Warner InstrumentsQSW-A15P配有1 mm金质公接头和Ag/AgCl导线
直型微电极架 World Precision InstrumentsMEH3S内部含AgCl（Ag+）压片，配有2 mm金质公接头 
6 cm 培养皿VWR60872-306无
Nitex筛网Dynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750无
胶水；Loctite环氧树脂VWR500043-451在塑料称量皿中按等比例混合胶水与固化剂，并充分搅拌。固化迅速，但建议在室温下放置24小时以确保完全固化
去离子水 Sigma-Aldrich99053无
氯化钠Sigma-AldrichS7653无
氯化钾Sigma-AldrichP9333无
氯化钙Sigma-AldrichC1016无
氯化镁Sigma-AldrichM8266无
HEPESSigma-AldrichH3375无
氢氧化钠Sigma-AldrichS8045无
乙酸钾Sigma-AldrichP1190无
琼脂糖Sigma-AldrichA9539无

参考文献

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