使用离子选择性自参考微电极技术测量细胞外离子流

摘要

细胞膜中的转运蛋白能够介导离子在细胞膜或细胞层之间的选择性分布，在组织生理、修复及病理过程中发挥关键作用。本文介绍了离子选择性自参照微电极技术，该技术可用于测定单个细胞和组织的特定离子流。 体内.

摘要

动物、植物及单细胞的细胞由一种称为细胞膜的屏障包裹，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。上皮等细胞层也形成屏障，将多细胞生物体的内部与外部或不同区室分隔开。这些屏障的一个关键特征是离子在细胞膜或细胞层两侧的差异性分布。这种分布依赖于两个特性：1）细胞膜和上皮对特定离子具有选择性通透性；2）离子通过泵在细胞膜和细胞层中被主动转运。这些特性在维持组织生理功能中起着至关重要的作用，并在损伤后、修复过程中或病理状态下作为信号提示发挥作用。离子选择性自参照微电极可用于测量钙、钾或钠等离子在单个细胞和组织水平上的特定通量。该微电极内含一种对特定离子具有选择性通透性的离子载体混合物。电极内部填充液含有已知浓度的目标离子。微电极的电势由外部环境中该离子的浓度决定。随着离子浓度的变化，微电极的电势随之呈离子活度对数函数关系改变。当微电极在某一离子源或汇附近来回移动时即 由于离子流动形成的浓度梯度，微电极电位会发生振幅与离子流/浓度梯度成正比的波动。放大器对微电极信号进行放大，输出信号被记录在计算机中。随后，可利用菲克扩散定律，结合电极电位波动、微电极的位移以及其他参数（如特定离子的迁移率）计算出离子流。本文详细描述了使用离子选择性自参照微电极测量细胞外离子流的方法，并展示了一些代表性结果。

引言

所有动物细胞都被一层脂质双分子层膜所包围，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。细胞通过主动运输离子来维持膜内为负的电膜电位¹。膜电位是一种储存的能量形式，细胞可利用它驱动膜上的各种分子装置²。神经元及其他可兴奋细胞具有较大的膜电位。钠离子通道的快速开放会导致膜电位崩溃（去极化），从而产生动作电位，并沿神经元传导²。除了这些快速的电变化外，许多组织和器官还能产生并维持显著的长期电位。例如，皮肤和角膜上皮细胞通过定向泵送离子（主要是钠离子和氯离子）来产生并维持跨上皮电位和细胞外电流传导³。

尽管使用振动探针^4-6测量内源性细胞外电流传导，以及使用微电极系统^7-10测量膜电位或跨上皮电位，能够实现对细胞膜和上皮细胞层电学参数的测定，但这些方法无法指明所涉及的离子种类。

带有选择性离子载体的微电极可测量溶液中特定离子的浓度。通过在不同位置放置两个或多个电极，可以测量离子梯度或通量。然而，每个探针固有的电压漂移各不相同，可能导致测量结果不准确，甚至检测出实际不存在的梯度。采用“自参考”模式的单个电极在两个点之间以低频移动，可解决这一问题。此时，离子通量可在相对缓慢且稳定的信号漂移背景下被检测到（见图3B）。

离子敏感....

方案

1. 离子选择性自参考微电极的制备

1. 离子选择性微电极的制备
   1. 使用微电极拉制仪加热拉制无细丝的薄壁硼硅酸盐毛细管（外径 1.5 mm，内径 1.12 mm）。
      注意：这将得到直径为3-4 µm的尖端。较细的尖端具有更高的电阻，会使微电极更容易受到电子噪声干扰，且对离子浓度变化的响应更慢。相关信息可参见Smith发表的论文 等.²⁶.
   2. 硅烷化电极以使内表面具有疏水性，有助于保留亲脂性离子载体混合物。将微电极置于金属架中，并在烘箱中加热过夜 >100 °C 烘干。支架为一块金属板，上面钻有直径 2 mm、未贯穿的孔。将电极尖端朝上插入孔中，并用一个 250 ml 玻璃烧杯罩住电极。
   3. 早晨，关闭烤箱电源，戴上隔热手套，小心取出带有电极和烧杯的金属架。关闭烤箱门以保留热量。
   4. 佩戴乳胶或丁腈手套、实验服并佩戴护目镜。使用塑料巴斯德移液管，将一滴硅烷化溶液 I 加至每个电极的底部（保持烧杯原位；通过倾倒口插入移液管）。硅烷化溶液在加热板上挥发，使电极内部发生硅烷化。此步骤需在化学通风橱中进行。将支架/烧杯/电极放回热烘箱中数小时，以使残留的硅烷化溶液完全蒸发。
      注意：出于安全考虑，切勿重新开启烤箱。在烤箱上贴上标签，注明不得接通电源，因其可能含有有害且易燃的蒸气。
   5. 冷却后，将微电极存放在装有400 g干燥剂的玻璃干燥器内的微电极储存....

结果

我们先前已证明，单细胞损伤后会出现钙离子内流²⁴。因此，我们提出疑问：单细胞损伤是否还会引发其他离子流变。我们采用了X. laevis卵母细胞，这是一种广泛用于单细胞伤口修复^30-34和电生理记录研究的成熟模型^24,35-39。有趣的是，X. laevis卵母细胞内部的钾离子浓度（约110 mM）⁴⁰高于所用的细胞外溶液（在MMR 1x中：1 mM），这提示损伤后可能发生钾离子外流。为验证这一假设，我们利用离子选择性自参照微电极，检测了X. laevis卵母细胞细胞膜修复过程中钾离子的流动情况。

为损伤卵母细胞，首先拉制一个尖端较大（约 50 µm）的毛细管电极。将电极固定在直型电极夹持器上，并安装至手动微操纵器。通过电极尖端接触细胞膜来造成损伤²⁴。损伤后不久，我们检测到大量钾离子外流（最高达 250 nmol cm^-2 sec^-1；图 3B.......

讨论

成功测量细胞外离子流的最关键步骤 体内 包括：降低噪声、正确制备离子选择性微电极和参比电极，以及样品和两支电极的准确定位。

为尽量减少噪声，记录系统应置于接地的法拉第屏蔽笼内，最好使用带有金属顶板的隔振台，且该隔振台也应接地。此外，显微镜的机架也应接地。电噪声的来源包括光源。采用光纤“无风扇”光源可产生最小的电噪声。最后，保持微电极夹持器中的银丝和银粒处于氯化状态也有助于最小化噪声（浸入次氯酸钠漂白液中氯化，随后用去离子水冲洗）。₂O) 离子选择性微电极或参比电极中若存在气泡，将导致测量失败，因为微电极的导电性会因此丧失或受损。因此，在将电极安装至电极夹持器前，必须在显微镜下检查电极。有关去除气泡的详细步骤，请参见实验方案。为确保结果可靠且可重复，必须准确定位样品和微电极。离子流的测量依赖于微电极的位移及其相对于样品的位置。必须精确定位样品上待测的目标区域，并调整微电极使其相对于样品表面做垂直移动。若微电极的移动方向不垂直于样品表面，将导致离子流测量值发生偏差，并增加样品间的变异程度。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IonAmp	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	无	由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制的放大器；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
IonAmp32	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	无	由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心开发的软件；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
前置放大器探头	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	INA116	由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心设计的BSR电压跟随器INA116；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
MicroStep驱动器	BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA	无	需要三个MicroStep驱动器用于X、Y和Z方向的定位；由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制；类似系统可从“XBL function matters”（http://www.xuyue.org/）或“YoungerUSA”（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
手动微调定位器	World Precision Instruments	型号 KITE-R	类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
磁性支架	World Precision Instruments	型号 M10	类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
防震台	Newport Inc.	型号 VW-3036-OPT-023040	类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买
三维微调定位器组件：带槽面90°角支架	Newport Inc.	型号 360-90	组装三维微调定位器还需配备三个用于X、Y、Z控制的电动旋转电机，MPH-1安装臂配MCA-2可调角度立柱，以及多种Newport连接件和螺钉，用于固定在防震台上
三维微调定位器组件：0.5英寸X向行程燕尾槽滑台	Newport Inc.	460PD-X	无
三维微调定位器组件：快速安装线性滑台，0.5英寸XY行程	Newport Inc.	460A-XY	无
无内丝薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管，Kwik-Fil型	World Precision Instruments	TW150-4	无
电极拉制仪	Narishige	PC-10	无
金属支架	自制	无	自制金属电极架，使用钢制10 cm × 15 cm矩形底板，钻出直径2 mm、间隔0.5 cm的孔
烘箱	QL	型号 10 实验室烘箱	无
硅烷化溶液I	Sigma-Aldrich	85126	具有危险性，请按供应商建议操作
玻璃培养皿；派热克斯（Pyrex）	Fisher Scientific	316060	无
电极/微量移液管储存罐	World Precision Instruments	E215	无
玻璃干燥器	Fisher Scientific	08-595E	内含Drierite干燥剂（W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA）。在密封圈上涂抹凡士林以确保气密性。
塑料巴斯德移液管	Fisher Scientific	11597722	无
本生灯	Fisher Scientific	S97329	无
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich	S8902	无
直型微电极架	Warner Instruments	QSW-A15P	配有1 mm金质公接头和Ag/AgCl导线
直型微电极架	World Precision Instruments	MEH3S	内部含AgCl（Ag+）压片，配有2 mm金质公接头
6 cm 培养皿	VWR	60872-306	无
Nitex筛网	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX750	无
胶水；Loctite环氧树脂	VWR	500043-451	在塑料称量皿中按等比例混合胶水与固化剂，并充分搅拌。固化迅速，但建议在室温下放置24小时以确保完全固化
去离子水	Sigma-Aldrich	99053	无
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	无
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333	无
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016	无
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266	无
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	无
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045	无
乙酸钾	Sigma-Aldrich	P1190	无
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539	无