斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

摘要

为了帮助评估斑马鱼胆管驱动的肝脏再生背后的分子机制，我们建立了一种肝损伤模型，该模型中表达硝基还原酶的肝细胞在甲硝唑处理后被遗传性消融。在本方案中，我们描述了如何熟练地操作、监测和分析肝细胞消融及胆管驱动的肝脏再生过程。

摘要

肝脏具有强大的再生能力。肝实质细胞（即肝细胞）可通过两种方式之一进行再生：肝细胞驱动型肝再生或胆管驱动型肝再生。在肝细胞驱动型肝再生中，新生肝细胞来源于已有的肝细胞；而在胆管驱动型肝再生中，新生肝细胞则来源于胆管上皮细胞（BECs）。对于肝细胞驱动型肝再生，已有多种优良的啮齿类动物模型，这些模型极大地推动了当前对肝脏再生机制的理解。然而，目前尚无适用于胆管驱动型肝再生的啮齿类动物模型。我们近期报道了一种斑马鱼肝损伤模型，在该模型中，当肝细胞严重丢失时，胆管上皮细胞可大量转化为肝细胞。在此模型中，肝细胞通过药理遗传学手段被特异性消融。本文详细介绍了消融肝细胞以及分析胆管上皮细胞驱动肝再生过程的方法。该肝细胞特异性消融模型可进一步用于揭示胆管驱动型肝再生的分子与细胞机制。此外，这些方法还可应用于化合物筛选，以鉴定能够增强或抑制肝脏再生的小分子化合物。

引言

肝脏是一种高度可再生的器官。在肝脏再生过程中，新生的肝实质细胞（即肝细胞）来源于已有的肝细胞（肝细胞驱动的肝脏再生）或胆管上皮细胞（BECs，胆管驱动的肝脏再生）^1,2。通常情况下，肝脏损伤会引发已有肝细胞的增殖；然而，当肝细胞增殖能力受损时，BECs 可以转分化为肝细胞^2-4。这两种肝脏再生模式在临床上具有重要意义。在人类部分肝脏手术切除后（例如，因肝脏肿瘤或活体肝捐献），残余肝脏中的肝细胞通过增殖以恢复失去的肝脏质量。相比之下，在患有严重肝病的患者中，肝细胞增殖能力显著受限，此时 BECs 或肝脏前体细胞（LPCs）似乎参与了新生肝细胞的生成^5,6。啮齿类动物的2/3部分肝切除模型中，肝细胞通过增殖恢复肝脏质量，该模型极大地促进了人们对肝细胞驱动型肝脏再生机制的理解^7,8。然而，目前尚无有效的啮齿类动物模型能够实现再生肝细胞主要来源于 BECs 的情况。尽管已有多种啮齿类肝脏毒素模型曾用于鉴定胆管驱动的肝脏再生过程^2-4，但近期的小鼠谱系追踪研究表明，在这些模型中 BECs 对再生肝细胞的贡献极小^9,10。部分啮齿类肝脏损伤模型，包括部分肝切除^11-13 和对乙酰氨基酚诱导的肝损伤^14,15，已被应用于斑马鱼，并由此鉴定出一些与肝脏再生相关的新基因或信号通路。然而，这些斑马鱼肝脏损伤模型中仅发生肝细胞驱动、而非 BEC 驱动的肝脏再生。因此，建立一种新型的肝脏损伤模型，使 BECs 能够广泛地转化为再生肝细胞，对于深入理解 BEC 驱动的肝脏再生机制至关重要。

本文所述肝细胞消融模型的总体目标是：（1）建立一种肝损伤模型，在该模型中胆管上皮细胞（BEC）广泛参与再生肝细胞的形成；（2）阐明BEC驱动肝脏再生的分子与细胞机制。我们假设，损伤的严重程度决定了肝脏再生的模式；因此，我们预测，严重的肝细胞损伤将启动胆管来源的肝脏再生。为验证这一假设，我们构建了一种转基因斑马鱼肝损伤模型，即Tg(fabp10a:CFP-NTR)^s931品系，该品系在肝细胞特异性启动子fabp10a的驱动下，高效表达细菌硝基还原酶（NTR）与青色荧光蛋白（CFP）的融合蛋白。由于NTR可将无毒前体药物甲硝唑（Mtz）转化为细胞毒性药物，因此仅特异性消融表达NTR的细胞^16-18，即本模型中的肝细胞。通过调控Mtz处理时间，可精确控制肝细胞消融的程度。利用该模型，我们近期报道了在严重肝细胞丢失后，BEC可广泛分化为再生肝细胞¹⁹，这一发现随后被另外两项独立研究进一步证实^20,21。因此，与前述啮齿类动物及斑马鱼肝损伤模型相比，我们的肝细胞消融模型在研究BEC驱动的肝脏再生方面具有明显优势。

本方案描述了利用斑马鱼肝细胞消融模型进行肝脏再生实验的步骤。该模型适用于研究胆管驱动的肝脏再生机制，以及开展化学筛选以鉴定能够抑制或增强肝脏再生的小分子化合物。

方案

斑马鱼的饲养和繁殖按照标准程序进行；实验已获得匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 胚胎/幼虫的制备

1. 为进行定时交配，将成年雄性和雌性半合子或纯合子 Tg(fabp10a:CFP-NTR)^s931 斑马鱼过夜共养，并在它们之间放置隔离板。次日早晨需要交配时，移除隔离板。使用细塑料网筛过滤水体以收集胚胎。
2. 将网筛倒置，用挤压瓶挤出的细流蛋水冲洗网面。将100个胚胎转移至含有25 ml蛋水的100 mm培养皿中。每培养皿中培养的胚胎数不超过100个，并在28 °C条件下培养。
3. 为抑制色素形成，在受精后10小时（hpf）之前向培养皿中加入苯硫脲（PTU），并将胚胎/幼鱼培养至80 hpf。PTU的终浓度为0.2 mM。注意：PTU具有毒性，应按照适当的处理规范使用。
4. 通过向培养皿中加入终浓度为0.016%的3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）对幼鱼进行麻醉。然后使用落射荧光显微镜筛选CFP阳性幼鱼。选择肝脏大小相近的幼鱼，剔除肝脏过小或过大的个体。
   注意：任何CFP阳性的幼鱼均可使用，无论其荧光强度如何，因为半合子与纯合子幼鱼在肝细胞消融程度上无差异。注意：Tricaine具有毒性，应按照适当的处理规范使用。
5. 移除含有Tricaine的蛋水，更换为添加了0.2 mM PTU的蛋水。将胚胎/幼鱼继续在28 °C条件下培养。

2. Mtz 处理

1. 通过将 0.171 g 甲硝唑（Mtz）粉末溶解于 100 ml 含 0.2% DMSO 和 0.2 mM PTU 的卵水中，配制新鲜的 10 mM Mtz 溶液。为完全溶解 Mtz，需在室温下 快速搅拌 20–30 分钟。为促进 Mtz 溶解并增强其向幼鱼体内的渗透，在配制 Mtz 溶液时加入 DMSO。注意：长时间暴露或高浓度 Mtz 具有毒性，应按照适当的处理规范使用。
2. 将幼鱼转移至两个不同的 100 mm 培养皿或多孔板中，分为对照组和实验组。实验组幼鱼置于 10 mM Mtz 溶液中；对照组则置于含 0.2% DMSO 的卵水中。
3. 用铝箔覆盖含 Mtz 溶液的培养皿或培养板，防止 Mtz 光照失活，并在 28 °C 下孵育。Mtz 处理的持续时间取决于幼鱼发育阶段和转基因品系。
4. 为在 Tg(fabp10a:CFP-NTR) 品系中观察到类似的严重肝细胞消融效果，可从受精后 3.5 天（dpf）开始处理（持续 36 小时），或从 5 dpf 开始处理（持续 24 小时）。

3. 胆汁驱动的肝脏再生分析

1. 消融期结束后，从培养板中移除 Mtz 溶液。加入 25 ml 卵水清洗经 Mtz 处理的幼鱼。轻轻晃动培养板 2–3 次以清洗幼鱼，然后弃去卵水。重复此步骤三次，最后再将幼鱼浸入一次卵水中。为避免 Mtz 处理幼鱼出现心脏水肿和死亡，使用较低浓度的 Tricaine 进行麻醉，终浓度为 0.008%，以固定幼鱼。
2. 进行肝脏分析时，在落射荧光显微镜下使用 CFP 滤光片观察 Mtz 处理幼鱼的肝脏大小。根据相对肝脏大小评估肝细胞消融程度：大（未消融；0–10% 幼鱼）、中等（部分消融；10–20%）、极小（完全消融；80–90%）。
3. 剔除肝脏未消融或部分消融的幼鱼，仅保留肝脏极小的个体，这表明肝细胞严重消融。若需在肝脏再生 0 小时时间点（R0h）进行分析，则在 Mtz 洗脱并完成 CFP 分选后立即收集幼鱼；否则，将分选后的幼鱼保留在补充有 0.2 mM PTU 的卵水中，直至准备收集。
4. 将收集的幼鱼转移至 1.5 ml 微离心管中，弃去卵水，加入含 3% 甲醛的 PEM 缓冲液固定液。将离心管置于 4 °C 条件下，在摇床上避光固定过夜（O/N）。
5. 弃去固定液，加入 1 ml PBSDT 溶液，将离心管置于摇床上旋转清洗 5 分钟。
6. 将固定后的幼鱼转移至含有 PBSDT 的 100 mm 培养皿中，在体视显微镜下用镊子手动去除卵黄和胸鳍。将最多 20 条解剖完成的幼鱼转移至 1.5 ml 离心管中。
7. 弃去 PBSDT 溶液，加入 1 ml 封闭液，在室温（RT）下于摇床上轻摇封闭 2 小时。
8. 弃去封闭液，加入含一抗的封闭液共 100 µl。在 4°C 条件下于摇床上缓慢摇动过夜（O/N ）。
9. 移除一抗溶液，用 PBSDT 溶液清洗 5 次，每次 10 分钟。随后加入含二抗的封闭液 100 µl，在室温下于摇床上轻摇 2 小时。
10. 在室温下，于摇床上用 PBSDT 溶液清洗 5 次，每次 10 分钟。
11. 将幼鱼侧向置于载玻片上，滴加一滴封片剂，小心盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。样本现已准备就绪，可用于共聚焦显微镜观察。

结果

从3.5至5天后（dpf）开始，使用Mtz处理36小时（A36h，A代表消融）显著减小了肝脏体积（图1B）。在洗脱Mtz后，视为肝脏再生（R）的起始时间，肝内fabp10a:CFP-NTR和fabp10a:dsRed的表达在30小时内强烈重现（图1B）。肝内胆管网络通过BEC膜上表达的Alcam进行评估²²，该网络最初发生塌陷，但在洗脱后54小时（R54h）重新建立（图1C）。这些数据表明，在我们的肝脏损伤模型中，肝脏再生与功能恢复迅速发生。

图2显示再生的肝细胞来源于胆管上皮细胞（BEC）。Tg(Tp1:H2B-mCherry)^s939 转基因品系在含有12个RBP-Jĸ结合位点的元件调控下表达核定位的红色荧光蛋白²³。该Notch响应元件似乎仅在肝脏的BEC中驱动基因表达²⁴；然而，它也...

讨论

严重的肝细胞消融（而非轻度消融）会引发胆管驱动的肝脏再生。因此，在甲硝唑（Mtz）处理并洗脱后，有必要观察经Mtz处理的幼鱼的肝脏大小，可通过fabp10a:CFP-NTR转基因的内源性CFP荧光进行评估。由于少数经Mtz处理的幼鱼会出现未消融（0–5%）或部分消融（10–20%）的肝脏，因此必须筛选并仅分析肝脏明显缩小的幼鱼，这表明发生了严重的肝细胞消融。

尽管在本实验方案中，我们使用甲硝唑（Mtz）处理斑马鱼幼鱼的时间为3.5至5天（共36小时），但也可采用其他发育阶段和不同处理时长。例如，在5至6天期间（共24小时）进行甲硝唑处理的幼鱼同样表现出严重的肝细胞消融，与前述36 小时处理组效果相似。另外两个研究团队独立构建了类似的fabp10a:NTR转基因品系，并分别报道了在肝细胞特异性消融后由胆管驱动的肝脏再生过程。其中一个团队在6至7天期间对幼鱼进行甲硝唑处理²¹，另一团队则在3.5至4.5天期间进行处理，均得出了相似的结论²⁰。由于不同的fabp10a:NTR转基因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）粉末	Sigma-Aldrich	A5040	配制0.4%（15 mM）Tricaine储备液：将0.4 g Tricaine溶于100 mL卵水中。调节pH至7。
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
甲硝唑	Sigma-Aldrich	M1547
吐温X-100	Sigma-Aldrich	T8532
甲醛	Sigma-Aldrich	252549
二水合硫酸钙	Sigma-Aldrich	C3771
N-苯基硫脲（PTU）	Sigma-Aldrich	P7629
封片剂（Vectashield）	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm 培养皿	Denville Scientific Inc.	M5300
透明指甲油	Fisher Scientific	50949071
精细镊子	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
载玻片	Fisher Scientific	12-544-1
盖玻片	Fisher Scientific	12-540-A 和 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5（小鼠抗Alcam）	ZIRC	zn-5	1:10 稀释
山羊抗Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 稀释
大鼠抗RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 稀释
AlexaFluor 647 AffiniPure 驴抗山羊IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 稀释
AlexaFluor 647 AffiniPure 山羊抗小鼠IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 稀释
Cy3 驴抗大鼠IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 稀释
解剖显微镜	Leica Microsystems	S6F
落射荧光显微镜	Leica Microsystems	M205FA
共聚焦显微镜	Carl Zeiss	LSM700
卵水			在蒸馏水中加入0.3 g/L 海盐 ‘Instant Ocean’ 和 0.5 mM CaSO4 。
[header]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4。  加蒸馏水至1 L。  调节pH至7。  在121°C下高压灭菌20分钟。
1X PBSDT			在1X PBS中加入0.2% Triton X-100和0.2% DMSO。
PEM缓冲液			30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4。  加蒸馏水至1 L。  调节pH至7。
封闭液			将1 mL热灭活马血清与9 mL 1X PBSDT混合。