用于检测癌细胞侵袭性及潜在抗侵袭化合物活性的鸡胚心脏侵袭实验

摘要

在此，我们介绍一种在三维条件下研究肿瘤细胞侵袭活体正常组织碎片的实验方案。该器官培养技术主要用于测试潜在的抗侵袭性药物 体外.

摘要

鸡胚心脏实验的目的是提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该实验可区分侵袭性与非侵袭性细胞，并可用于研究待测化合物对肿瘤侵袭的影响。将癌细胞（以细胞团或单细胞形式）与鸡胚心脏组织碎片共培养。经过数天至数周的悬浮器官培养后，将共培养物固定并包埋于石蜡中，以进行组织学分析。通过连续切片并使用苏木精-伊红染色，或对心脏组织及相邻癌细胞中的抗原表位进行免疫组织化学染色，重建癌细胞与正常组织之间的三维相互作用。该实验与当前关于肿瘤侵袭的概念一致，即肿瘤侵袭是癌细胞与其邻近间质宿主成分（如肌成纤维细胞、内皮细胞、细胞外基质成分等）之间分子相互作用的结果。在此模型中，癌细胞所面对的正是以活体组织碎片形式提供的间质微环境。该实验的相关性具有多方面支持。实验中的侵袭过程符合肿瘤侵袭的判定标准：在时间和空间上逐步占据并取代宿主组织，以及表现出侵袭性或非侵袭性特征 体内 对 confronting 细胞的行为通常与实验结果相关。此外，细胞的侵袭模式 体内 由病理学家定义的特征在检测的组织学图像中得以体现。对多种潜在抗侵袭性有机同类化合物所得结果进行定量构效关系（QSAR）分析，可研究黄酮类化合物、查尔酮类化合物以及临床使用的已知抗转移药物的构效关系。例如， 微管抑制剂在该检测中同样抑制侵袭。然而，该检测未考虑免疫因素对癌症侵袭的影响。

引言

侵袭是恶性肿瘤的特征。这种活动不仅会导致周围组织的破坏，还与转移灶的形成有关。由于癌症患者大多死于肿瘤侵袭和转移，而目前有效的抗侵袭治疗手段仍然有限，因此已开发出多种实验室检测方法以模拟肿瘤细胞的侵袭过程。鸡胚心脏检测法旨在提供一种相关的器官培养方法，用于在三维环境中研究肿瘤侵袭。该检测能够区分侵袭性与非侵袭性细胞，并可用于研究测试化合物对肿瘤侵袭的影响。

该实验方法的理论基础在于，肿瘤本质上是生态系统，其中肿瘤细胞持续与其间质（宿主细胞和细胞外基质）相互作用，并通过这些分子相互作用精确调控侵袭过程¹。因此，在该实验中，将肿瘤细胞与活的鸡胚心脏组织碎片共同培养²，后者不仅作为肿瘤细胞侵袭的基质，同时也提供多种类型的间质细胞和基质成分。鸡心脏组织包含心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其细胞外基质由层粘连蛋白、纤连蛋白及多种类型的胶原蛋白组成。通过这种方式，三维器官培养技术涵盖了患者肿瘤侵袭过程中涉及的多种细胞与分子相互作用。

鸡胚心脏实验的主要优势在于能够体现间质效应。这一方面比其他侵袭实验更为全面。 体外 基于肿瘤细胞侵袭由基底膜组成的非活性凝胶³ 或间质基质⁴ 分子。在器官培养实验中观察到的肿瘤细胞与正常活体宿主组织之间的对抗概念，已由包括法国的 Wolff 和 Schneider 在内的多位学者提出。^5<....

方案

图1. 不同检测步骤的示意图概览。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 预培养心肌碎片（PHFs）的制备

1. 将受精的鸡卵在 37 °C 下孵育 9 天。应安排孵育时间，以便后续可在 4 天内完成 PHF 的制备（例如，在周四完成），并在规定时间与肿瘤细胞聚集体进行最终共培养（例如，在下周一进行）。
2. 用 70% (v/v) 乙醇水溶液对蛋壳进行消毒。所有后续操作均须在组织培养柜中进行，并使用无菌溶液和材料。用钝头镊子在胚胎极处打开蛋壳。
3. 用去核勺夹住颈部将胚胎取出（图 2）。将胚胎置于直径为 5 cm 的玻璃培养皿中，内含 5 m....

结果

  图5所示的组织学切片呈现了多次成功实验的最终结果。培养物良好的组织学形态表明细胞具有活性，可用于解读肿瘤细胞与正常组织之间的相互作用。此外，未观察到正常组织产生免疫反应，这证实所使用的鸡胚日龄正确。 例如， 在免疫排斥系统发育完成之前。培养期间未见细菌，表明无（明显）污染。最后，组织块边缘呈圆形，证实其为悬浮培养，且无（暂时性）黏附于锥形瓶壁的迹象。

已在该检测中测试了多种化合物。通常在将成对的PHF/肿瘤聚集体转移到小型锥形瓶时（步骤2.7），将药物加入培养基中。部分化合物作为工具药使用（已知的抑制剂和激活剂），用于揭示参与肿瘤侵袭过程的信号通路和效应分子。对于其他结构相关的化合物，则根据鸡胚心脏侵袭实验的结果建立了定量构效关系（QSAR）。因此，针对一系列相关的多酚类化合物，采用了多个计算描述符，以预测其在该实验中的抗侵袭活性。在长达15年的时间里，共测试了139种不同的类似物在该实验中可能具有的抗侵袭作用，并将其活性分为4类。从中随机选取93种和46种多酚类化合物分别作为训练集和验证集。通过QSAR人工神经网络分析，验证集的结果显示预测的抗侵袭活性与实验.......

讨论

在制备成纤维细胞凝块（PHFs）过程中，组织碎片可能无法保持悬浮状态，而是粘附于容器壁上；可通过增加培养基体积来克服这一问题。如果PHFs数量过少且体积过大，则应减少培养基体积。试验细胞未能发生聚集可能源于温度波动或微生物污染。此外，细胞本身可能具有无法聚集的内在特性。在细胞聚集体与PHFs贴附过程中，若出现贴附不良，可通过延长在半固体琼脂培养基上的孵育时间，或用吸水滤纸吸除培养物周围多余的液体培养基来改善。此时也应检查是否存在微生物污染。切片过程中遇到困难可能是由于石蜡块发生解体所致：这种情况通常因石蜡块储存时间过长引起（可重新熔化石蜡）。当出现切片伪影时，应检查切片刀的完整性，并确认固定后的培养物中不存在异物（corpora aliena）。培养物中出现坏死区域是培养条件不佳的表现。若坏死区域仅局限于培养物的中心部位，则应怀疑共培养体系的体积过大。因此，PHF与细胞聚集体体积的恰当选择确实是一个关键因素。然而，若出现广泛性坏死，则提示可能存在pH调控不当、微生物污染或固定过程中的伪影。最后，若切片颜色过深，可能是苏木精浸染时间过长，或切片过厚（>8 µm）所致。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
林格氏盐溶液	Braun	CEO123
细菌培养用琼脂	Becton Dickinson	214010
三羟甲基氨基甲烷（Tris）分析纯	VWR	103157P
牛血清白蛋白（BSA），Cohn V 组分	Sigma	A4503-500G
MEM-Rega 3 培养基	Life Technologies	19993013
旋转摇床	New Brunswick Scientific	G10 和 G33
50 ml 锥形瓶	Novolab	92717
玻璃培养皿	Novolab	68516
虹膜剪	Rumex	11-0625
带校准目镜网格的体视显微镜	Wild	157702
石蜡	International Medical Products	8599956
伊红 Y	Sigma	230251-25g
哈里斯苏木精	Sigma	HHS32-1L
封片树脂（Tissue-Tek）	Sakura	4494
石蜡熔化装置	GFL	1052
石蜡切片用切片机	Reichert
带气体进出接口的锥形瓶塞子	Novolab	2602421 和 260243
二氨基联苯胺	Sigma	D8001
REAX 摇床	Heidolph	54131
24 孔细胞培养板	VWR	NUNC142475
眼科去眼球匙	Rumex	16-060
尖头镊子	Rumex	4-111T
钝头镊子	Nickel-Electro LTD	7112
5 ml 锥形瓶	Novolab	211901
清洗并脱脂的显微镜载玻片	International Medical Products	8613908