本文展示了冷冻、包埋、冷冻切片及染色肌肉活检组织的最高效方法，以避免产生冷冻假象。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肌肉活检的组织学评估在理解神经肌肉疾病的发生和发展过程中一直是一种不可或缺的工具。然而，为了实现最佳染色效果，在切除和保存组织时必须采取适当的措施。一种组织保存方法是将组织用甲醛固定，然后用石蜡包埋。该方法能良好地保存组织形态，并可在室温下长期储存，但操作繁琐，且需要接触有毒化学物质。此外，甲醛固定会导致抗原发生交联，因此在进行有效免疫染色前必须进行抗原修复处理。相比之下，冰冻切片无需固定，因而能够保持生物抗原的天然构象。该方法还具有制片速度快的显著优势，特别适用于需要快速组织学评估的情况，例如术中手术活检。本文将介绍用于不同组织学和免疫学染色观察肌肉活检样本的最有效制备方法。
引言
肌肉组织学检查在理解不同类型神经肌肉疾病方面起着关键作用1-4。当与其他技术结合使用时，该方法可帮助研究人员更清楚地了解病理表现及其进展过程，同时也对评估治疗干预的效果至关重要5-10。然而，为了确保结果的准确性，必须以适当的方式保存组织，以维持其在切除前的生理状态。这要求在组织取材、保存、切片和染色过程中均需格外谨慎。
组织可用于光学显微镜研究的制备方法有两种。第一种方法是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，该方法要求组织先在10%中性缓冲甲醛溶液中固定，然后用石蜡包埋11,12。固定步骤有助于更好地保存组织形态，但也会导致内源性蛋白质发生交联，因此在进行免疫染色时必须进行复杂的抗原修复程序，并且排除了在此类切片上进行酶组织化学染色的可能性12。而冷冻切片则无需预先固定或复杂处理，因此蛋白质能够保持其天然的生物学构象13,14。此外，冷冻切片还具有较快的制备周期，在某些情况下尤为必要，例如在肉瘤及其他外科活检术中进行术中诊断时15。然而，若操作不当，该方法容易造成冰冻损伤，从而改变肌肉组织结构，使切片不适合组织学检查。本文将详细介绍制备肌肉活检组织切片的最有效方法，以实现最佳染色效果，确保准确的形态学评估。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 组织采集与肌肉组织的冷冻
- 使用过量异氟烷（2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷）处死小鼠。此步骤应在通风橱中进行，并使用二次密闭装置，例如含有浸有异氟烷棉签的干燥器或钟罩。
- 通过用力挤压足垫确认动物死亡。采用二次安乐死方法，如颈椎脱位。
- 用70%酒精润湿毛发，以减少松散毛发附着在肌肉上。使用精细镊子（如#5镊子）剥离肢体上的皮肤。
- 从肌腱开始，小心地将目标肌肉（本例中为胫前肌（TA））与下方骨骼分离并去除。
- 切除肌肉，用OCT包埋剂（Optimum Cutting Temperature compound）覆盖，并将其平整地放置在已标记的一次性冷冻模具上。确保肌肉处于其正常的生理方向（头至尾），且未被拉伸。或者，可将肌肉置于小块聚苯乙烯泡沫上，并用昆虫针固定，以确保肌肉长度正确。
- 在钢杯中使用液氮冷却2-甲基丁烷（异戊烷）。该过程平均需要3–5分钟。间歇性搅拌，直至杯底和杯壁开始出现白色沉淀物。
注意：当出现白色沉淀时，表明异戊烷已达到最佳冷冻温度（-150 °C） - 将含有肌肉的模具浸入冷却的2-甲基丁烷中。小肌肉（如膈肌和趾长伸肌（EDL））冷冻6–12秒，较大肌肉（如腓肠肌比目鱼肌（GS）和三头肌）冷冻15–20秒。避免冷冻时间过长，以免导致组织开裂。
- 将冷冻后的组织转移至干冰上，使异戊烷完全挥发（此过程平均约需15–20分钟）。用铝箔包裹组织，并储存在超低温环境（-70 °C至-80 °C）中，直至切片。
2. 使用 OCT 包埋组织以制备组织块
- 将组织置于干冰上运输至冷冻切片机，以防止组织解冻。将组织转移至冷冻切片机舱内（温度设定为 -20 至 -24 °C，以避免组织完全解冻），静置 30 分钟使其温度平衡。
- 开启帕尔贴冷却装置。若冷冻切片机无此冷却功能，可使用喷雾式冷却剂快速冷冻 OCT 包埋剂。在整个包埋过程中，切勿使肌肉组织发生任何程度的解冻，以免造成冰冻损伤。
- 在样本托盘上均匀涂布一层薄 OCT 包埋剂并使其冷却。当底部 OCT 大部分已冻结而表面仍呈液态时，将组织以正确方向插入（横切面应垂直于 OCT，纵切面应平行于 OCT）。使用喷雾式冷却剂快速冷冻 OCT，再用热导引棒接触未包埋的组织部分，静置 45 秒。
- 在肌肉周围再添加一层薄 OCT 包埋剂，喷上喷雾式冷却剂，并按前一步骤进行热导引。
- 以少量多次的方式持续添加 OCT 包埋剂，并结合喷雾式冷却剂与热导引棒快速冷冻，直至完全覆盖整个肌肉组织。
- 将热导引棒置于组织块顶部，静置 5 分钟。
3. 准备肌肉中段区域的切片并进行识别
- 将样本安装到样本头上。拧紧旋钮以固定样本片，并确保样本片与样本头接触良好。
- 调节腔室温度至 -21 至 -24 °C 之间，并等待达到设定温度。
- 调整切片厚度设置（7 µm）；通过粗调和微调推进或回撤样本块以修整表面。
- 将切片收集到预热的带正电荷的显微镜载玻片上，通过将载玻片顶部轻压至切片上，利用正负电荷间的吸引力促进切片牢固附着于载玻片。
- 通过测量切片的横截面积（CSA）来确定肌腹中部切片。使用连接显微镜的计算机上的成像软件完成该操作。
注：采集相差图像，并利用软件程序中的描记功能测量整个肌肉的周长。由此可获得横截面积（CSA）以及最小费雷特直径（即粒子对侧两条平行切线之间的最短距离，用于衡量肌纤维横截尺寸）的测量值。注意：当 CSA 和最小费雷特直径的测量值开始趋于平稳时，表明已到达肌腹中部。 - 将载玻片清点后存档于 -80 °C，以备后续染色使用。
注：染色前无需去除OCT包埋剂。载玻片加盖盖玻片后即可立即进行染色。
4. 染色
注意：虽然产品数据表中提供了详细的分步操作流程，且染色操作应遵循该流程进行，但可能需要根据个人实验条件进行优化，以获得最佳染色效果。
- 由于封片剂（见表格）不与水混溶，需将切片经递增浓度的酒精脱水（70%、95% 和 100% 乙醇中各 2 分钟），并用二甲苯（100%，5 分钟）透明 ，以确保切片不会随时间推移而变得不透明。
- 盖上盖玻片并使其干燥。使用配备成像软件的显微镜进行成像。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
采集和冷冻组织的装置设置如图1所示。切除的组织应置于浸有PBS的纱布上，以防止干燥（图1A）。若组织需用于组织学分析，应将其浸入OCT包埋剂中，并按正确的方向放置于冷冻模具中，尽可能保持接近生理长度，以确保形态准确（图1B）。用于组织冷冻的异戊烷悬液可通过将异戊烷置于液氮中冷却并持续搅拌，直至底部出现微小白色沉淀物来制备。此时，介质即适合用于冷冻（图1C）。组织应在预冷的异戊烷中冷冻6–15秒，具体时间取决于组织的大小和厚度（图1D）。冷冻完成后，肌肉组织将呈现 chalky white（灰白色），此时应将其置于干冰上保存，随后转移至-80 °C冰箱中。
逐步将组织包埋在OCT中制备肌肉组织块所需的冰冻切片机设置和试剂如图2所示。冰冻切片机的温度应设置在-20至-24 °C之间（图2A）。应备有OCT包埋剂和Fre...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
组织学和免疫组织化学一直是研究多种神经肌肉疾病病理表现和进展的关键工具。传统上，肌肉活检样本首先用甲醛固定，然后用石蜡包埋。虽然甲醛固定能够保存组织结构，并允许组织在室温下储存和运输，但它会失活酶类并导致蛋白质交联，因而需要额外步骤才能实现准确的免疫染色。使用冰冻切片可避免这一问题，但该方法在获得最佳染色结果和准确解读方面存在独特的技术挑战14,15。
首先，组织在手术切除后必须立即冷冻，因为自溶和分解过程在离体后很快就会开始。组织还必须迅速且彻底地冷冻足够的时间，冷冻时间的长短取决于组织的大小或厚度。如果操作不当，会发生冷冻损伤，导致组织无法用于组织学评估。冷冻后，组织必须立即保存在干冰上，然后转移至超低温（-80 °C）冰箱中，直至切片。需要注意的是，组织在未置于干冰上的情况下不得从冰箱中取出，因为冻融循环也会破坏组织结构。
进行组织学分析时，另一个需要注意的重要事项是务必始终分析目标组织的相同部位，以确保分析结果的一致性。对于肌肉切片，可通过分析肌腹中部来实现这一点。肌腹中部是肌肉最厚的部分，因此具...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Alex Miller 对手稿的修改。本工作得到了来自 Cure CMD、肌肉营养不良症抗争组织（SAM）和肌肉营养不良协会（218938）授予 M.G. 的研究资助支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 冷冻切片机 | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | 美国伊利诺伊州巴达哥维60089，沃特路1号，电话 1-800-248-0123 替代产品：Richard Allen Scientific |
| 显微镜 | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 美国纽约州梅尔维尔1300华特惠特曼路，邮编11747-3064，电话：1-631-547-8500 替代产品：Olympus |
| 图像分析软件 | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 美国纽约州梅尔维尔1300华特惠特曼路，邮编11747-3064，电话：1-631-547-8500 替代产品：Image J, Metamorph |
| 异氟烷 | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 美国亚利桑那州菲尼克斯市西佩奥里亚大道1923号，邮编85029 |
| OCT包埋剂 | 4583 | Sakura Inc. | 美国加利福尼亚州托伦斯90501 替代来源：Leica Microsystem |
| 冷冻剂（Freeze It） | 23-022524 | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 一次性组织模具 | 22-363-554 | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 彩色防脱载玻片（Colorfrost plus slides） | 9991001 | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 丙酮 | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 美国密苏里州圣路易斯市云杉街3050号，邮编63103 替代来源：VWR Scientific |
| 乙醇 | HC-1300-1GL | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 2-甲基丁烷 | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 美国密苏里州圣路易斯市云杉街3050号，邮编63103 替代来源：VWR Scientific |
| 二甲苯 | HC-7001GA | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 封片剂 Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 吉氏苏木精染液 #3 | CS402-1D | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
| 伊红 | 6766007 | Thermofisher | 美国马萨诸塞州剑桥市纪念大道790号，邮编02139 替代来源：VWR Scientific |
参考文献
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
