用于单个纳米颗粒三维元素分布的X射线能量色散断层扫描

摘要

本文描述了在扫描透射电子显微镜中使用能量色散X射线断层成像技术，对单个纳米颗粒内元素分布进行三维表征的方法。

摘要

扫描透射电子显微镜（STEM）中的能量色散X射线能谱技术能够实现高空间分辨率下的精确元素分析，甚至可提供原子级分辨的元素分布图。该技术利用高度聚焦的电子束照射薄样品，通过测量样品发射出的X射线能量，确定电子束路径中材料的原子种类。这种对元素敏感的能谱技术可进一步扩展至三维断层成像，即通过在垂直于电子束方向的轴线上倾斜样品，采集多个谱图像来实现。

单个纳米颗粒内部的元素分布通常对其光学、催化和磁学性质具有决定性作用。诸如X射线断层扫描和扫描电镜中的切片与逐层观测能谱成像等技术能够实现对元素敏感的三维成像，但其空间分辨率通常局限于>20 nm。原子探针断层扫描可提供接近原子级的分辨率，但纳米颗粒样品的制备往往具有挑战性。因此，在扫描透射电子显微镜中应用的元素敏感技术，特别适用于研究尺寸为10–100 nm的纳米颗粒内部的元素分布。

在此，利用扫描透射电子显微镜（STEM）中的能量色散X射线（EDX）光谱技术，研究单个AgAu纳米颗粒中元素的分布情况。已观察到在不同成分的纳米颗粒中，Ag和Au均存在表面偏析现象。

引言

该方法旨在实现对单个纳米颗粒内元素三维分布的精确测定。该测定通过结合使用能量色散X射线（EDX）光谱技术与在扫描透射电子显微镜（STEM）中进行的断层重建来完成。

能量色散X射线光谱技术长期以来被用于定量分析并空间定位透射电子显微镜样品中的元素。随着高角环形暗场（HAADF）扫描透射电子显微断层成像技术的发展，实现了对晶体材料的三维成像¹，能量色散X射线断层成像也被提出作为一种用于确定元素三维分布的方法²。然而，早期的研究受到透射电子显微镜中X射线探测器设计的限制。具体而言，这些传统的探测器设计具有相对较低的收集效率，并且在样品台遮挡导致的大范围倾转角度下无法检测到信号^2,3。近年来，在（扫描）透射电子显微镜中引入了新型几何结构的X射线探测器，使能量色散X射线断层成像成为一种可行的技术，并推动了多项近期研究的开展^4-6。

高角度环形暗场扫描透射电子显微成像（HAADF STEM）是一种广泛应用的电子断层成像模式，能够在特定情况下基于HAADF信号强度对原子序数的敏感性提供成分信息。例如，HAADF断层成像非常适合研究具有明确元素区域的纳米颗粒，如结构清晰的核-壳形貌⁷，但在元素分布更为复杂的情况下则无法使用。电子能量损失谱（EELS）为在STEM中确定三维元素分布提供了互补的方法⁸。该技术利用入射电子束的能量损失来确定样品的成分，其优势在于信噪比较高，通常优于EDX谱学方法⁹。EELS的缺点是多重散射效应对样品厚度有严格限制，在某些情况下，延迟出现的边或重叠的谱特征会使分析变得复杂。因此，EDX谱学通常更适用于研究重元素，例如常与催化或等离激元纳米颗粒系统相关的元素⁹。此外，由于EDX谱学采集的是完整的谱图图像，因此可以方便地回溯识别出意料之外的元素，而在能量过滤透射电子显微术（EFTEM）和EELS中，由于元素信息频繁出现重叠或超出数据集的谱范围，这一过程更加困难。

用于EDX断层扫描的理想样品几何形状是由针状样品悬置于真空中，并沿断层扫描倾斜轴方向排列⁴。这种情况可确保在任何倾斜角度下，样品或样品 holder 均不会遮挡EDX探测器。然而，制备纳米颗粒体系所需的针状样品具有挑战性¹⁰，通常的样品制备方法仅是将纳米颗粒转移至薄碳膜透射电镜支撑网上。这些网格需配合专门设计的断层扫描样品 holder 使用，该 holder 可倾斜至较大角度（≈±75°），但在该倾斜角度范围内，EDX探测器不可避免地会受到遮挡，可能降低最终断层重建结果的质量。这种遮挡特性取决于特定的显微镜-探测器-holder 配置，因此可在数据采集前通过测量适当的校准样品来确定¹¹。单个球形纳米颗粒是理想的校准样品，因为来自这些样品的X射线计数强度在所有倾斜角度下应保持恒定。随后可通过在每个角度调整采集时间，或在数据采集后乘以校正因子来补偿探测器遮挡效应。本文采用前一种方法，因其可在最大化信噪比的同时最小化电子剂量。

方案

1. 纳米颗粒合成

1. 在室温下，将10 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（分子量 = 10,000 g/mol）溶于75 ml乙二醇中。加入400 mg AgNO₃₃ 加入该溶液。
2. 搅拌溶液直至 AgNO₃ 完全溶解后，以1 °C/min的恒定速率在加热板上加热至100 °C^-1在100 °C下反应1.5小时。
3. 加入175 ml蒸馏水，冷却至室温。在8,000 × g离心，弃上清液，将纳米颗粒重悬于50 ml蒸馏水中。重复此步骤三次。
4. 在室温下将500 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP，55,000 g/mol）溶解于500 ml乙二醇中。将该溶液与前一步骤制备的27.8 ml银纳米粒子悬浮液加入至1,000 ml圆底烧瓶中。在100 °C下加热烧瓶10分钟。
5. 将三水合四氯金酸加入1,000 ml水中，配制成0.2 mM的AuCl溶液₄^-_(aq). 加入100、200、300或400 ml的0.2 mM AuCl等分试样₄^-_{（水溶液）} 逐滴加入上一步所得溶液中，分别得到平均组成为 Ag93Au7（Ag 93 at% Au 7 at%）、Ag82Au18（Ag 82 at% Au 18 at%）、Ag78Au22（Ag 78 at% Au 22 at%）和 Ag66Au34（Ag 66 at% Au 34 at%）的 AgAu 纳米颗粒。
6. 冷却至室温，然后通过连续三轮离心（8,000 × g）、弃去上清液并用50 ml蒸馏水重新分散，洗涤三次。将0.05 ml纳米颗粒溶液加入10 ml去离子水中。

2. 透射电镜样品制备

1. 用移液器吸取约 0.05 ml 纳米颗粒溶液，滴加到带有孔状/连续碳膜的透射电镜（TEM）载网上。建议使用铍制 TEM 载网支架以减少杂散 X 射线，但如果样品的 EDX 谱图中不存在与铜或金重叠的特征峰，则使用铜网或金网亦可。采用较大孔径的网格（例如，200 目），以最大限度降低载网本身造成阴影效应的可能性。
2. 待纳米颗粒溶液干燥后，用纯甲醇或乙醇清洗 TEM 载网。使用防毛细作用交叉镊子夹持载网，滴加 10–20 滴清洗液。每滴液体加入后，用滤纸轻轻接触载网边缘，吸除多余液体。
3. 将载网在约 80 °C 下退火（最好在真空环境中进行），以去除或固定残留污染物，从而减少电子束照射下的污染。

3. 探测器遮挡效应的表征

1. 将纳米颗粒加载到透射电镜支持栅网上，随后将栅网装入断层扫描样品 holder，并将 holder 插入透射电镜中。
2. 等待显微镜真空度达到合适的稳定值（低于约 1.8 x 10^-7 Torr）。打开柱阀，并确保能在显微镜的荧光屏上观察到电子束。
3. 对齐STEM。
   注：此处描述的是在200 kV下运行的Titan G2探头侧像差校正STEM仪器与2020断层扫描 holder 配合使用时的校准方法。其他显微镜的最佳校准步骤可能与此略有不同。
   1. 在STEM衍射模式下，使用离焦阴影像将样品移至正焦中心高度。操作方法为：在Search选项卡中按下Alpha Wobbler按钮，使样品台在±15°范围内倾斜，通过调节z轴高度，使样品中特征结构的移动最小化。
   2. 移动样品，使电子束位于样品的孔洞上方，并通过在探针的欠焦图像中将光阑阴影居中，确保合适的聚光镜光阑已正确对准。轻微调节光束强度，检查聚焦后的探针是否发生移动，以确认是否存在电子束倾斜失准。
   3. 移动样品，使非晶碳区域进入视野，并在衍射模式下聚焦电子束以获得Ronchigram。通过摆动焦距观察Ronchigram中的像差，并对这些像差进行校正（例如， 必要时校正散光和轴向彗差。
4. 在“搜索”选项卡中选择“显示轨迹”，在成像的同时沿网格方格（靠近网格中心的一个方格）的轮廓进行追踪。这有助于确保后续测量所针对的是位于网格方格中央的纳米颗粒，从而降低来自支撑网格的遮挡效应。若采集过程在靠近网格条的颗粒上进行，则在更大范围的样品倾斜角度下，其中一对探测器将被显著遮挡。
5. 在网格方格的中部区域找到一个具有代表性的颗粒。在成像过程中将样品台倾斜至其最大倾转角度（通常为±70°），以确保在大角度倾转时纳米颗粒不会被网格条遮挡。
6. 使用恒定的采集时间获取HAADF和EDX谱图像例如，5 分钟）完成全倾角范围（通常为 ±70°）的数据采集，倾角增量为 5–10°。首先，在成像面板中点击“Acquire”以获取明场扫描透射电子显微图像（HAADF）。通过在该图像上拖动方框选择包含纳米颗粒的映射区域，然后按“Acquire”开始采集。
7. 通过在图像处理软件中打开光谱数据立方体（RAW 文件），从 EDX 谱图图像中提取特征 X 射线计数，以确定数据采集的时间间隔。然后，使用随附的补充代码 1–3 中包含的 slice2D 和 sum 函数，对数据立方体中对应于目标峰能量通道的切片进行强度求和。

4. EDX 断层扫描采集

1. 对感兴趣的纳米颗粒样品重复步骤 3.1–3.5。
2. 按照前一节中探测器阴影表征所确定的时间间隔，以相同于步骤 3.6 的方式，对一系列样品倾斜角度（通常为 ±70°）采集 HAADF 和 EDX 谱图图像。

5. 重建与可视化

1. 将HAADF图像的倾转系列通过以下任一方法编译成mrc文件格式：
   1. 在图像可视化软件中使用 MRC 写入器¹² （文件 > 另存为 > 在将HAADF tif文件作为“图像序列”导入后（MRC编写者）。
   2. 或者，使用断层扫描软件包中的 tif_to_mrc 函数¹³.
2. 在选定的软件中对 HAADF 图像进行互相关配准，以实现倾斜系列图像的粗略对齐。将配准数据保存为 .sft 文件或 xcorr.txt 文件。在断层扫描软件中，于“设置滤波器”窗口中设置一个滤波器，使“互相关”面板中的峰值最为锐利。
   1. 随后，在“计算对齐偏移”窗口中点击“继续”以对整个倾转系列执行互相关对齐。重复对齐过程，直至局部偏移小于1像素，并确保在每一步将所有偏移文件以文本格式保存。
      注意：进行互相关运算时，有时需要仔细设置所用滤波器，以确保倾转系列数据的良好对齐。
3. 在图像处理软件中，加载获取的光谱数据立方体，并使用随附的补充代码4中的 slice3d 和 sum 脚本函数，提取对应于目标元素的能量通道的累加切片图。 & 5.
4. 将从 HAADF 图像中确定的配准应用于提取的 EDX 元素分布图。在断层重建软件的“应用配准”选项卡中执行此操作，通过选择 "利用比对数据视图中的位移".
5. 如有必要，在断层扫描重建软件中对 HAADF 图像序列进行倾转轴校正，并通过勾选相应选项将其应用于 HAADF 图像和 EDX 谱图 "使用倾斜轴调整任务中的校正数据" 在“应用比对”选项卡中。
6. 使用断层成像软件包中实现的同步迭代重建技术（SIRT）算法，对每种提取的EDX元素信号重建断层数据集，确保所有元素的重建尺寸一致。在断层重建软件中，于“重建体积”窗口设置参数（体积大小、20次迭代） 等等。）并点击继续。确保每个元素的重建参数相同。
7. 通过选择图像提取各元素重建结果的正交切片 > 堆叠 > 图像可视化软件中的正交视图¹².
8. 使用可视化软件从重建结果中构建并可视化更多的正交切片、体视图和表面渲染图像。加载所有元素的重建文件，并确保正确设置比例尺，因为比例尺通常不会从 .rec 文件中自动导入。
   1. 在对象池中选择重建对象，右键单击并选择正交切片模块以提取正交切片。右键单击重建对象并选择体绘制以提取体绘制图像。通过右键单击重建对象并选择等值面来提取等值面。
      注意：通过阈值进行自动分割是一种更稳健的方法，但在信噪比较差的情况下，可能需要手动分割，以在等值面可视化时去除纳米颗粒体积外的噪声体素。

结果

在 Titan G2 ChemiSTEM 中，2020 断层扫描 holder 的探测器遮挡效应表征如图 1A所示。此处使用的探测器为 Super-X 探测器，其包含四个探测器，沿光轴以相等的方位角（90°）分布，从而实现大于 0.6 sR¹⁴ 的探测器立体角。通过对探测器进行表征，可确定补偿后的断层扫描采集时间，如图 1B所示。应用这些采集时间后，单个纳米颗粒在各个倾斜角度下的计数应大致保持恒定，如图 1C所示。

通过置换反应合成的双金属 AgAu 纳米颗粒，利用 STEM 中的 EDX 断层扫描技术进行了研究。在该反应中，将 AuCl₄^- 溶液加入 Ag 纳米颗粒种子中。Au 在纳米颗粒表面被还原，同时 Ag 被氧化，从而形成双金属结构并导致初始种子内部中空化。此前人们认为，在整个过程中 Ag 与 Au 会形成均匀的合金，催化和光学性质的变化仅归因于中空结构及整体成分的差异。然而，利用 EDX 断层扫描技术进行的三维元素分布成像揭示了通过置换反应合成的 AgAu 纳米颗粒内部存在表面偏析现象（图 2）。在 Au 含量较低时，纳米颗粒表现出明显的 Au 表面偏析；但随着 Au 含量增加，这种表面偏析发生反转，在 Au 含量最高时出现明显的 Ag 表面偏析（图 3）。这种表面偏析的转变与不同成分 AgAu 纳米颗粒催化三组分偶联反应生成丙炔胺的产率变化密切相关。

垂直于电子束方向的重构切片可与标准的二维元素分布图进行比较。初始分布图包含沿电子束方向累加的成分信息，由于不同成分区域的重叠，或如本研究中的AgAu纳米颗粒，其投影包含了颗粒的顶部和底部表面，因此通常难以解释（图3A-C）。通过对重构结果进行切片，可以去除与颗粒顶部和底部表面相关的信号强度，从而在此情况下更清晰地展示表面偏析现象（图3D-F）。

图1. 利用单个AgAu纳米颗粒表征探测器遮挡效应。（A）在固定采集时间（5分钟）下，单个AgAu纳米颗粒的Ag和Au X射线峰计数随倾斜角度的变化情况。（B）根据（A）确定并用于后续采集倾转系列图像的采集时间。（C）采用（B）中所得采集时间时，单个AgAu纳米颗粒的Ag和Au X射线峰计数随倾斜角度的变化情况。计数在所有倾斜角度下基本保持恒定。引自Slater et al.¹⁵。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 低金含量银金纳米颗粒的重构。（A）金重构的正交切片。（B）银重构的正交切片。（C）穿过正交切片（A）和（B）的线轮廓，显示该纳米颗粒中明显的金表面偏析。（D）银和金重构的表面可视化图像。引自 Slater et al.¹⁵。请点击此处查看此图的放大版本。

图 3. 高 Au 含量 AgAu 纳米颗粒的重构。（A）Au 的二维 EDX 图谱；（B）Ag 的二维 EDX 图谱。（C）穿过二维 EDX 图谱（A）和（B）的线轮廓，显示仅从二维图谱难以确定该纳米颗粒的表面偏析情况。（D）Au 重构的正交切片；（E）Ag 重构的正交切片。（F）穿过正交切片（D）和（E）的线轮廓，清晰显示该纳米颗粒中 Ag 的表面偏析现象。（G）Ag 与 Au 重构结果的表面可视化图。引自 Slater et al.¹⁵。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文提供的方案介绍了一种用于确定任意多元素纳米颗粒三维元素分布的方法。以本文所述的银金（AgAu）纳米颗粒为例，可清晰识别出两种元素在表面的偏析现象，并且该现象被证明与三组分偶联反应的催化产率相关。这充分展示了该技术在揭示纳米颗粒体系物理和化学性质方面的实用价值。

与透射电子显微镜（TEM）中的常规操作一样，样品制备过程中应格外注意，以确保获得最佳结果。在滴加纳米颗粒溶液后，对载网进行充分洗涤和退火尤为关键，以避免在EDX断层扫描所需的高电子剂量下产生碳污染。所使用的高剂量还可能导致多孔碳膜严重损伤，特别是在孔间常见的薄区部分；而氮化硅支撑膜则可能促进纳米颗粒的氧化¹⁶。

校正探测器阴影效应对于获得准确的重构结果至关重要，特别是如果该技术未来将用于元素分布的定量映射。可通过精确表征探测器阴影效应，并随后调整照射到纳米颗粒上的电子剂量来实现校正。或者，也可在采集后将谱图像乘以校正因子来补偿阴影效应。然而，由于电子束会对纳米颗粒造成损伤，限制了每幅谱图像中可获得的X射线计数，目前尚无法将该技术应用于三维定量分析。

为了补偿特定显微镜-探测器-样品台组合下，EDX探测器随样品倾转角度变化而产生的遮挡效应，必须进行校准。首先应使用一种在不同样品倾转角度下不会引起X射线计数变化的样品来确定遮挡效应，单个球形纳米颗粒在电子束照射下成分稳定、且在整个倾转系列数据采集期间保持不变时，预期可满足此条件。此外，对于晶体纳米颗粒，应排除电子束沿纳米颗粒主要晶带轴方向的倾转角度，并确保纳米颗粒足够小，以避免显著的X射线吸收。因此，当以恒定采集时间在整个可能的样品倾转角度范围内采集单个纳米颗粒的EDX谱图像时，所测得的特征X射线强度的任何变化均仅归因于探测器遮挡效应。随后通过调整采集时间（即电子剂量），对遮挡效应进行补偿，从而使倾转系列中所有谱图像的总信号计数大致保持恒定。

与HAADF或EELS成像模式相比，EDX断层扫描数据采集仍处于非常初级的阶段。尽管已引入具有更大立体角的X射线探测器，但EDX断层扫描的主要局限性——与二维EDX成像常见情况类似——仍然是信号较低。尽管如此，对于某些纳米颗粒体系，EDX谱学相较于EELS的一个潜在优势在于能够检测较大纳米颗粒中少量的重元素。较大的多组分纳米颗粒（>100 nm）通常非常适合进行EDX研究，因为它们能提供更多的计数，且谱峰重叠的解卷积问题较少；但应谨慎选择吸收效应较小的高能X射线峰。

总体而言，EDX断层扫描是一种确定纳米颗粒内元素三维分布的优良方法，尽管该方法仅限于能够承受相对高电子剂量而不发生显著损伤的纳米颗粒。STEM中X射线探测器立体角的进一步增大以及断层扫描样品台的进一步优化，将使该技术得到更深入的发展，并成为单个纳米颗粒表征中的重要方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Titan G2 80-200 STEM	FEI		配备 Super-X 检测器
2020 断层扫描样品杆	Fischione
200 目铜网碳支持膜	Agar Scientific	AGS160
EDX 采集软件	Bruker		Esprit
断层图像对齐与重建软件	FEI		Inspect3D，可使用其他替代软件
断层图像对齐与重建软件包	科罗拉多大学		IMOD，可使用其他替代软件
可视化软件	FEI		Avizo，可使用其他替代软件
图像处理软件	Gatan		Digital Micrograph，可使用其他替代软件
图像可视化软件	开源		Fiji，可使用其他替代软件
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma-Aldrich	856568
乙二醇	Sigma-Aldrich	V900208
硝酸银	Sigma-Aldrich	209139
台式离心机	Thermo Scientific	75007200
圆底烧瓶	Sigma-Aldrich	Z41,452-2	1,000 ml
三水合四氯金酸	Sigma-Aldrich	520918