本文介绍了一种在成年小鼠中制造前脑刺伤损伤的详细方案。该刺伤可诱导严重的反应性胶质增生及胶质瘢痕形成，随后可通过标准免疫组织化学方法进行检测。
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本文内容
摘要
摘要
中枢神经系统（CNS）损伤后，星形胶质细胞会发生一系列生化、形态和分子水平的改变，统称为反应性星形胶质增生。反应性星形胶质细胞具有促炎和保护双重作用，分别抑制和促进神经修复。目前对反应性星形胶质增生多种功能特性的潜在机制尚不完全清楚。深入理解这些机制对于开发治疗中枢神经系统损伤的治疗策略至关重要。本文展示了一种通过前脑刺伤法在成年小鼠前脑诱导反应性星形胶质增生的方法。该损伤模型操作简单、结果可靠，仅需使用立体定位仪和手术刀片即可造成损伤。刺伤模型作为前脑损伤的研究手段已被广泛确立，适用于研究多种神经病理学结果，如神经元变性、神经炎症以及血脑屏障（BBB）的破坏。因此，前脑刺伤损伤模型是一种强有力的工具，可用于广泛探究中枢神经系统对创伤的响应。
引言
开发治疗中枢神经系统损伤的有效疗法面临的主要挑战之一，是对创伤所引发的复杂多细胞事件理解尚不充分。反应性星形胶质细胞正日益被视为新型治疗策略中一个极具前景的靶点1。尽管历史上曾认为反应性星形胶质细胞不利于神经修复，但现在已认识到，它们是包含抑制炎症过程、限制继发性损伤和神经退行性变在内的复杂多细胞神经保护反应中的关键组成部分2-6。虽然反应性胶质增生的神经病理学特征早已被明确定义，但调控该过程的细胞与分子机制及其多样的下游效应仍知之甚少。阐明驱动反应性胶质增生的机制以及后续发生的细胞和分子事件，是制定策略以促进其神经保护作用、同时减轻其有害效应的重要一步。
本文演示了一种通过刺伤损伤在成年小鼠前脑诱导严重反应性星形胶质细胞增生的方法。与其他创伤性脑损伤（TBI）模型（如控制性皮质冲击（CCI）或液体冲击损伤（FPI））不同，后两者需要专用设备来制造损伤，而前脑刺伤仅需使用立体定位仪固定头部和11号手术刀片即可完成。因此，前脑刺伤损伤模型对缺乏制造FPI或CCI损伤所需专用设备的各类实验室而言更具可及性。本文所述方法可使研究人员可靠且可重复地触发强烈的胶质细胞增生反应，以研究后续的细胞与分子事件。动物在手术后恢复良好，接受前脑刺伤损伤的个体可在无需特殊护理的情况下长期存活，并可重新放回动物群中用于急性、中期或慢性研究。尽管与FPI或CCI等TBI模型相比，刺伤所致前脑损伤的临床可转化性较低，但它仍是一种简单而有效的实验模型，可用于研究....
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方案
本方案使用混合C57BL/6背景的成年（3-4月龄）雄性小鼠。动物维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并可自由获取食物和水。本方案中进行的所有操作均根据德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准的协议执行。
1. 手术区域准备
- 用70%乙醇对手术台进行消毒，然后用吸水垫覆盖整个手术台面，并将手术器械放置在立体定位仪旁边。
- 设置不带操作臂的立体定位设备。将加热垫置于立体定位仪上，并调节至37 °C。为避免动物过热，可在动物与加热垫之间放置一小片纸巾或手术垫。
- 使用已灭菌的剪刀，将已灭菌的明胶海绵剪成小块，放入含有 0.9%无菌生理盐水的无菌培养皿中，备用。
注意：使用已灭菌的器械和无菌手术用品，以维持无菌操作环境。在实验过程中或不同动物之间，根据需要将手术器械浸入玻璃珠灭菌器中10-15秒，进行重新灭菌。根据需要，用手揉搓70%乙醇以消毒，全程保持手套清洁。
2. 手术前小鼠的准备
- 将小鼠从饲养笼中取出并称重（g）。
- 将小鼠放入异氟烷诱导室，设置氧气流速为 2 L/min，异氟烷蒸发器浓度为 5%，以诱导进入手术麻醉状态，约需 3–5 分钟。观察呼吸减慢和身体不动，通过脚趾夹捏反射确认小鼠已完全麻醉。
- 当小鼠完全麻醉后，将其固定于立体定位仪上，将鼻部放....
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结果
由于接受该手术的动物无需特殊的术后护理，因此可根据研究需要调查损伤后的急性或慢性病理变化，灵活设置短期或长期的存活时间。损伤后 2-3 天即可观察到反应性胶质增生的主要特征，例如 GFAP 的上调以及胞体肥大。反应性星形胶质细胞增殖的高峰期出现在损伤后第 3 至 5 天10。下图所示的代表性结果来自 7 天前接受过穿刺损伤的动物。
通过尼氏染色可以观察前脑刺伤后前脑的一般形态和皮层细胞结构（图2）。尽管刀片轨迹在损伤中心区域最为明显，但皮层细胞结构的破坏可揭示受损组织的头端和尾端范围。通过GFAP免疫组织化学染色可观察到反应性星形胶质细胞（图3）。需要注意的是，在无损伤情况下，许多皮层星形胶质细胞不表现出可被免疫组织化学检测到的GFAP水平。然而，损伤同侧半脑中GFAP表达显著上调，而在对侧半脑中仍保持相对较低水平（图3），提示反应性星形胶质细胞局限于损伤同侧半脑。需注意的是，尽管损伤同侧皮层组织中GFAP表达明显上调，但其他星形胶质细胞标志物（如S100β）.......
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讨论
钻孔过程中必须避免损伤颅骨或其下方的硬脑膜。钻孔时应使用轻柔的压力，以确保不穿透颅骨。此外，在抬起颅骨片时需格外小心，防止硬脑膜随骨片一同被掀起。
本文所述的前脑穿刺损伤模拟了中枢神经系统（CNS）的穿透性损伤。尽管其临床可转化性不如FPI或CCI等创伤性脑损伤（TBI）模型，前脑穿刺损伤模型仍可作为研究由明确CNS损伤所触发的多种生化、细胞或分子事件的有力工具。尽管已有研究报道大鼠在双侧穿刺损伤后3周出现认知功能缺陷11，但需注意的是，本文所描述的单侧穿刺损伤模型最适合用于研究损伤后的细胞反应。诸如反应性胶质增生和瘢痕形成等神经病理学过程的基本特征可被直接观察和研究。与引起弥散性和广泛性神经病理改变的FPI或CCI模型不同，该模型的局部胶质细胞活化和病变有利于在同一动物体内比较损伤与未损伤半脑。此外，脑膜细胞在损伤部位浸润进入中枢神经系统，为研究这些细胞与局部反应性星形胶质细胞之间的相互作用提供了机会。事实上，此类相互作用在瘢痕组织形成中至关重要，并已被证明可负向调控反应性星形胶质细胞对轴突再生的支持能力12。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢凯瑟琳·克拉克提供技术支持。A.D.R.G. 的研究部分由项目 5K01MH097957-03 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 立体定位仪 | Harvard Apparatus | 726049 | |
| 高速微型钻 | Harvard Apparatus | 724950 | |
| 不锈钢手术刀片，#11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45度角镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 明胶海绵，12 cm × 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| 兔抗 GFAP 抗体 | DAKO | Z033429-2 | 稀释比例 — 1:20,000（明场）；1:1,000（荧光） |
| 羊抗 BrdU 抗体 | Abcam | ab1893 | 稀释比例 — 1:20,000（明场）；1:500（荧光） |
| 生物素标记的山羊抗兔 IgG | Vector Laboratories | BA-1000 | 稀释比例 — 1:400（明场） |
| 生物素标记的兔抗羊 IgG | Vector Laboratories | BA-6000 | 稀释比例 — 1:400（明场） |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG | Life Technologies | A-11008 | 稀释比例 — 1:400（明场） |
| Alexa Fluor 568 标记的驴抗羊 IgG | Life Technologies | A-21099 | 稀释比例 — 1:1,000（荧光） |
| DAPI 核酸染色剂 | Life Technologies | D3571 | 稀释比例 — 1:1,000（荧光） |
| 醋酸克雷斯紫 | Sigma Aldrich | C5042-10G | 稀释比例 — 1%（明场） |
参考文献
- Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders. Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).
- Bush, T. G., et al. Leukocyte infiltration, neuronal degenerati....
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重印与许可
