原位检测石蜡包埋组织中的细菌：使用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针

摘要

本文描述了一种利用地高辛标记的靶向16S rRNA的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的方法。该方案可用于研究细菌在多种疾病（如牙周炎、癌症以及炎症性免疫疾病）中的作用。

摘要

已有多种方法报道了牙周炎患者牙龈活检组织中袋上皮及下方结缔组织内存在细菌，这些方法包括电子显微镜、使用细菌特异性抗体的免疫组织化学或免疫荧光，以及使用荧光标记寡核苷酸探针的荧光原位杂交（FISH）。然而，由于技术局限性或操作困难，这些方法尚未得到广泛应用。本文介绍了一种利用地高辛标记的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的方法。石蜡包埋组织是病理标本库中最常见的活检组织形式。该方法既可用于特异性检测特定菌种，也可用于广谱性检测多种细菌。细菌信号可表现为离散形态（球状、杆状、梭形及毛状）或弥散形态。该技术还能同时获取其他组织学信息：上皮组织、结缔组织、炎性浸润细胞及血管结构均可清晰分辨。本方法可用于研究细菌在多种疾病中的作用，例如牙周炎、癌症以及炎症性免疫疾病。

引言

细菌在多种口腔疾病（如牙周炎、牙髓炎、冠周炎、蜂窝织炎和骨髓炎）的发病机制中起着重要作用。为了理解细菌在疾病发生过程中的作用并监测治疗效果，明确细菌在组织内的定位至关重要。已有多种方法用于检测牙周炎患者牙龈组织中细菌的存在，包括电子显微镜^1,2、使用细菌特异性抗体的免疫组织化学和免疫荧光技术^3-7，以及针对16S rRNA的荧光标记寡核苷酸探针进行的荧光原位杂交（FISH）⁸。然而，由于技术限制或操作困难，这些方法尚未被广泛应用。与抗体相比，靶向16S rRNA的探针更易于制备，并可实现物种特异性检测。FISH已被证实是可视化自然环境中细菌（如菌斑生物膜）的优良工具。然而，由于各种组织成分存在自发荧光，FISH在组织样本中的应用受到限制。例如，当炎症组织伴有出血时，红细胞强烈的自发荧光常常干扰荧光技术的应用⁹。

为了在炎症的牙龈组织中定位细菌，因此，一种 原位 采用地高辛（DIG）标记的DNA探针的杂交方法已得到开发并成功应用^10,11. 本文详细介绍了利用石蜡包埋组织进行细菌定位的实验方案 P. gingivalis-特异性和通用真细菌探针的使用方法已有描述。该方法尤其注重标准化，以确保其他实验室能够获得相似的结果。本方案可在组织学背景下实现细菌的定位，且结果具有高度可重复性。所述方案可用于在多种组织中以物种特异性或通用方式定位细菌。通用探针在检测多微生物感染性疾病中的细菌，以及研究特定细菌作用尚不明确的疾病中细菌的潜在作用时尤为有用。

方案

1. 探针制备

1. 探针的PCR扩增
   1. 对于 P. gingivalis–特异性探针，扩增一段343 bp的DNA片段 P. gingivalis 使用基因组DNA通过PCR扩增16S rRNA P. gingivalis 以及以下引物：5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' 和 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'¹⁰. 按以下循环条件进行扩增：95 °C 30秒，60 °C 30秒，72 °C 1分20秒，共35个循环，随后进行5 72 °C 下的最短延伸时间^10,11.
   2. 使用70 bp的DNA片段（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG）扩增真细菌探针
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3'）合成为寡核苷酸，并使用以下引物：5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' 和 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'¹¹采用以下循环条件进行扩增：94 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分 20 秒，共 40 个循环；最后在 72 °C 延伸 5 分钟。^11,12.
   3. 通过加入3 M醋酸钠（pH 5.2）和100%乙醇（体积比为10:1:2），在-20 °C孵育2小时，沉淀PCR产物（≥500 µl）。
   4. 在14,000 × g离心15分钟，将沉淀重悬于100 µl TE缓冲液中，并在260 nm处通过光密度测定DNA浓度。
2. 使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒进行 DIG 标记
   1. 将3 µg探针与水混合，定容至终体积15 µl。
   2. 在95 °C下变性DNA 10分钟，然后迅速置于冰上冷却。
   3. 向15 µl变性的DNA中加入2 µl 10x六核苷酸混合物、2 µl dNTP标记混合物和1 µl Klenow酶。
   4. 混合后于37 °C孵育24至48小时，然后在65 °C加热以终止反应。
3. 使用 DIG DNA 标记与检测试剂盒检测 DIG 标记探针的灵敏度
   1. 手动将试剂盒中提供的阳性对照探针的系列稀释液各1 µl及1 ng DIG标记的探针加样至尼龙膜上，室温下干燥5分钟。
   2. 将膜短暂浸泡于2x SSC缓冲液（0.3 M NaCl，30 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）中，随后于80 °C孵育1小时，以固定DNA。
   3. 将膜用马来酸缓冲液（MAB，0.1 M 马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5）短暂浸泡，随后在室温下用封闭液（试剂盒提供）按1:5,000比例稀释的抗DIG碱性磷酸酶（AP）偶联抗体溶液6 ml孵育30分钟。
   4. 用 MABT（含 1% Tween 20 的 MAB）洗涤膜，然后加入 40 µl NBT/BCIP 溶液与 2 ml 检测缓冲液（0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.05 M MgCl₂）的混合液₂，pH 9.5）孵育膜1分钟。如果标记探针的灵敏度不理想，重复步骤1.1.3至1.3.4。
   5. 测定标记探针的DNA浓度（OD260），并将浓度调整至100 ng/µl^-1.
4. 检测DIG标记探针的特异性
   1. 变性基因组DNA样本（25 ng，3 µl）^-1 每份样品）在95 °C下处理10分钟，然后迅速置于冰上冷却，所用细菌包括该特异性探针靶向的菌种及其他不同菌种。
   2. 将变性的DNA手动加样至尼龙膜上，在室温下干燥20分钟。
   3. 将膜短暂浸泡于2x SSC缓冲液中，随后在80 °C下孵育2小时，以固定DNA。
   4. 室温下用封闭液封闭膜 1 小时。
   5. 将探针稀释至 1 ng/µl^-1 在杂交缓冲液中变性稀释后的探针，并将其加入膜上。
   6. 在45 °C下孵育膜1小时。
   7. 用2x SSC缓冲液将膜清洗三次。
   8. 将膜短暂浸泡在 MAB 中。
   9. 在6 ml封闭液中，将抗DIG碱性磷酸酶偶联抗体按1:2,000稀释，室温孵育1小时。
   10. 用 MABT 洗涤膜，然后加入 40 µl NBT/BCIP 溶液与 2 ml 检测缓冲液的混合液。
   11. 当探针未能达到预期特异性时，应逐步提高杂交温度，直至观察到特异性信号。

2. In Situ 杂交

注意：为避免样本和试剂干燥，所有孵育步骤均需在加湿密闭容器中进行，容器内衬浸湿的纸巾。

1. 组织切片的脱蜡与复水
   1. 从石蜡包埋的组织块制备 4 µm 厚的组织切片。本方案适用于经甲醛、多聚甲醛或锌基固定液固定的组织。
   2. 使用经 DEPC 处理的水配制所有试剂。
   3. 将载玻片置于 60 °C 干燥烘箱中加热 30 分钟，随后在室温下孵育 30 分钟。
   4. 将载玻片浸入 100% 二甲苯中 5 分钟，重复三次，每次使用新鲜二甲苯。
      注意：该脱蜡步骤应在化学通风橱中进行。
   5. 将载玻片先后浸入 100% 乙醇中两次，每次 5 分钟，每次使用新鲜乙醇；随后依次在 90%、80% 和 70% 乙醇溶液中梯度复水，每步 5 分钟。
   6. 将载玻片浸入 DEPC 处理的水中 1 分钟，再用 DEPC 处理的 PBS（pH 7.4）洗涤 6 分钟。
2. 组织切片的预处理
   1. 将载玻片浸入 0.1 N 盐酸中 20 分钟，随后用 DEPC 处理的水洗涤 30 秒。
   2. 使用蜡笔在组织周围绘制疏水性屏障。
      注意：疏水性屏障的大小取决于组织样本的大小。因此，后续步骤中试剂的用量将根据样本大小而变化，但必须填满疏水性屏障（小样本使用 50 µl，大样本使用 400 µl）。
   3. 在干燥烘箱中，用 50 至 400 µl 蛋白酶 K（1 至 10 µg ml^-1，溶于 DEPC 处理的 PBS 中）于 37 °C 处理 30 分钟，随后用 DEPC 处理的 1x PBS 洗涤 1 分钟。
   4. 将载玻片浸入含 4% 多聚甲醛的 DEPC 处理 PBS 中 10 分钟，然后用 DEPC 处理的 PBS 洗涤 1 分钟。
   5. 将载玻片浸入含 0.5% 乙酸酐的 0.1 M 三乙醇胺-HCl（pH 8.0）溶液中 20 分钟，随后用 DEPC 处理的水洗涤 30 秒。
3. 探针杂交与洗涤
   1. 将载玻片浸入 2x SSC 缓冲液中 20 分钟。
   2. 将探针用杂交缓冲液（4x SSC、50% [vol/vol] 甲酰胺、1x Denhardt 溶液、10% [wt/vol] 硫酸葡聚糖、0.1% [wt/vol] 十二烷基硫酸钠、0.4 mg ml^-1 鲑精 DNA）稀释至 1 ng µl^-1。对于阴性对照，将标记探针与 10 倍过量的未标记探针混合。
   3. 将稀释后的探针变性，并将 50 至 400 µl 加至组织切片上。盖上盖玻片，并用指甲油密封。
   4. 将载玻片在 PCR 仪中 90 °C 加热 10 分钟，随后在加湿孵育盒中于 45 °C 或步骤 1.4.11 确定的最佳温度下过夜 孵育。
   5. 在 4 °C 冷却 30 分钟，移除盖玻片，并将载玻片依次浸入下列 SSC 缓冲液中：4x SSC 10 分钟，预热（45 °C）的 2x SSC 20 分钟，2x SSC 10 分钟，0.2x SSC 10 分钟。
4. 使用抗 DIG-AP 偶联抗体进行检测
   1. 用 MABT 洗涤载玻片 5 分钟。
   2. 用含 1% Tween 20 的封闭液（50 至 400 µl）封闭 20 分钟。
   3. 加入用封闭液稀释的抗 DIG-AP 抗体（1:1,000 稀释度）50 至 400 µl，于 37 °C 孵育 90 分钟。
   4. 用 MABT 洗涤载玻片 10 分钟。
   5. 将载玻片浸入含 1% Tween 20 的检测缓冲液中 5 分钟。
   6. 用含 1% Tween 20 的检测缓冲液配制的 1 mM 左旋咪唑溶液（50 至 400 µl）处理 5 分钟，以灭活内源性碱性磷酸酶。
   7. 向每个样本加入 50 至 400 µl 预混的 NBT/BCIP 溶液（用检测缓冲液 1:100 稀释），在加湿孵育盒中室温孵育 2 至 3 小时，直至显色信号达到满意程度。
   8. 用去离子水冲洗载玻片以终止显色反应，并在 37 °C 下加入 50 至 400 µl 0.05% [wt/vol] 甲基绿作为复染剂，染色 10 分钟。
   9. 用去离子水冲洗载玻片，用 100% 乙醇脱水，再浸入二甲苯中。
   10. 向每张载玻片滴加 80 µl 封片液，盖上盖玻片。

结果

图1 显示与试剂盒中提供的阳性对照探针相比的DIG标记探针的点 blot 结果，以确定其灵敏度。该片段为343 bp P. gingivalis-特异性探针的灵敏度是70 bp真细菌探针的25倍。 图2 显示 原位 慢性牙周炎患者牙龈组织的杂交以检测 P. gingivalis 和真细菌。细菌信号（以紫色显示）在上皮层、固有层以及位于组织外的生物膜中被检测到。然而，其分布情况 P. gingivalis 牙龈组织内真细菌的分布存在差异。在高倍放大（1,000X）下，使用真细菌探针可观察到多种形态的细菌（球形、杆形、梭形和毛发状），而仅能通过 P. gingivalis-特异性探针。还观察到细菌信号的弥散形式。

Hajishengallis 等 研究表明，共生细菌在小鼠P. gingivalis诱导的实验性牙周炎发展过程中起着关键作用¹⁴。将破坏紧密连接（tight ju...

讨论

本文描述了一种利用地高辛标记的DNA探针在石蜡包埋组织中定位细菌的实验方案。该探针靶向细菌16S rRNA基因的DNA或RNA分子，且可根据需要将16S rRNA靶向探针设计为种特异性或通用型。先前研究已证实，P. gingivalis特异性探针仅与P. gingivalis特异性杂交，而不与其他口腔细菌发生交叉反应¹⁰。相比之下，真细菌（eubacterial）探针可与所测试的所有细菌基因组DNA（共17种不同物种）杂交，但杂交效率存在差异¹²。探针中T核苷酸的数量决定了地高辛标记的效率，因此制备高灵敏度的地高辛标记探针是本方案成功实施最关键的步骤。使用盐酸处理样本可通过去除蛋白质及部分水解靶序列来提高信噪比。增加蛋白酶K的浓度可提高探针对靶标的可及性，但会降低组织结构的完整性，因此建议根据组织类型优化蛋白酶K的多个浓度进行测试。乙酰化步骤通过乙酰化组织中带正电荷的氨基基团，减少带负电荷探针与组织蛋白之间的非特异性背景结合。经过上述一系列预处理步骤后，组织切片容易破损，因此操作时需格外小心。与荧光原位杂交（FISH）相比，本方法背景信号极低；然而，对于骨组...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸酐	Sigma	6404
50% 硫酸葡聚糖溶液	Millipore	S4030
50X Denhardt’s 溶液	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA 标记与检测试剂盒	Roche	11 093 657 910
甲酰胺	Sigma	F9037
ImmEdge™ 笔	Dako	H-400
左旋咪唑	Vector	SP-5000
氯化镁	Sigma	246964
马来酸	Sigma	M0375
甲基绿	Sigma	M6776
多聚甲醛	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
鲑鱼精 DNA 溶液	Invitrogen	#15632-011
氯化钠	Sigma	S9625
柠檬酸钠	Duksan	D1420
十二烷基硫酸钠	Amresco	227
三乙醇胺-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T