沿运动终板进行肌肉内注射：一种将示踪剂直接导入运动神经元的微创方法

摘要

分子通过肌肉注射后被摄取并逆行转运至相应运动神经元的效率，取决于注射位点相对于运动终板（MEPs）的位置。本文介绍如何在骨骼肌上定位运动终板，以优化示踪剂向运动神经元的逆行转运。

摘要

影响脊髓运动神经元完整性的疾病是最具致残性的神经系统疾病之一。在过去几十年中，多种此类神经肌肉疾病的动物模型相继建立，为科学界提供了多种旨在延缓或逆转这些疾病进展的治疗方案。其中一种策略是利用神经元的逆行转运机制，通过靶向骨骼肌将治疗性基因转运至相应的脊髓运动神经元。尽管该方法曾一度具有前景，但迄今为止，其所能转导的运动神经元数量不足，限制了该基因递送策略的成功。运动终板（MEP）是骨骼肌上高度特化的区域，与脊髓α运动神经元形成直接的突触连接。值得注意的是，迄今为止，将基因逆行转移至运动神经元的研究均未考虑靶向肌肉中MEP区域的具体位置。本文介绍了一种简便的实验方案：1）揭示骨骼肌表面运动终板的确切位置；2）利用该信息指导肌内注射及后续逆行示踪剂向运动神经元的有效逆行转运。我们希望将这些示踪实验的结果应用于后续研究，探索通过靶向运动终板实现治疗性基因向脊髓运动神经元逆行转运的可行性。

引言

由于运动神经元疾病、脊髓损伤以及杜氏肌营养不良等神经系统疾病导致的自主运动控制能力丧失，是一种严重影响患者日常生活的致残性疾病，其影响深远且持久。在过去十年中，旨在阻止或至少延缓这些神经肌肉疾病有害效应的研究工作已成为全球众多临床医生和科学家的优先研究方向。在这方面，近年来建立的模拟这些神经肌肉疾病的动物模型，对于深入理解这些疾病发生与进展背后的生理机制提供了重要的基础性认识^1-13。治疗这些神经肌肉疾病需要直接进入脊髓，可通过脊髓注射实现^14,15。基因治疗领域的最新进展也曾将目标定位于上下肢的横纹肌，以将治疗性基因递送至位于脊髓前角的相应α运动神经元^1,9-13。然而，这一曾被寄予厚望的策略未能改善这些神经系统疾病的临床结局。尽管可以合理地认为，这些不佳的治疗效果至少部分归因于这些保护性基因本身的低效性，但同样不能排除基因递送方法本身效率低下的问题。

运动终板（MEPs）是骨骼肌纤维上的特化区域，由起源于α运动神经元的大型外周运动纤维的轴突末梢嵌入形成。外周神经纤维末梢与运动终板共同构成神经肌肉接头，即通过顺向释放神经递质乙酰胆碱来触发突触冲动的部位。i.e.。重要的是，外周神经纤维与运动终板之间的关系是双向的，尽管存在不同的分子马达负责将分子和细胞器向神经元胞体运输以及从胞体运出^16-18。基于这些解剖学特点，运动终板似乎是向相应运动神经元递送遗传物质并实现后续逆向....

方案

本研究所述所有实验操作均符合澳大利亚新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的规定，并遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物实验的法规。本方案中的所有操作均应按照相关动物护理与伦理委员会的要求进行。

1. 乙酰胆碱酯酶组织化学染色

1. 准备乙酰胆碱酯酶反应混合液
   1. 将 290 mg 碘化乙酰硫代胆碱加入 200 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中。用磁力搅拌器以 900 rpm 的速度搅拌混合。
   2. 在持续搅拌下加入 600 mg 甘氨酸。
   3. 在持续搅拌下缓慢加入 420 mg 硫酸铜，直至产物完全溶解。
2. 通过在灌注后的大鼠或小鼠皮肤上做切口，从颈部区域抓住皮肤并将其拉过足部，去除动物尸体（通过组织共享获得）的皮肤。确保每块肌肉表面的筋膜已被去除或明显穿孔，以使肌纤维充分暴露于反应液中。
3. 将整个身体或感兴趣的肢体浸入反应混合液中，并在 4 °C 下孵育过夜 。
4. 用蒸馏水清洗尸体 2 分钟。注意：此时肌肉呈现蓝色，运动终板（MEPs）可见为白色小点。
5. 将尸体暴露于 10% 硫化铵溶液中 3–5 秒。
   注意：肌纤维将迅速变为棕色，运动终板则表现为黑色斑点。如果反应过快，肌纤维染色过深而难以区分运动终板与肌纤维，可尝试使用较低浓度的硫化铵溶液（例如，....

结果

乙酰胆碱酯酶组织化学染色可显示肌肉横向上运动终板的位置。图1展示了对整只大鼠前肢进行此类染色的结果。若肌肉纤维上的非特异性背景染色过强，建议优化硫酸铵溶液的浓度（例如，使用5–7%而非10%）以及标本在溶液中的浸渍时间。图2展示了在小鼠肱三头肌运动终板区域沿其长度注射逆行神经示踪剂后，颈段脊髓中出现的一列标记的运动神经元。逆行标记的运动神经元通常形成一条纵向柱状结构，跨越脊髓的多个节段。图3展示了通过选择性地将Fluoro-Gold靶向肱三头肌运动终板区域，所获得的不同数量的脊髓运动神经元标记结果。当示踪剂注入整个运动终板区域时，标记神经元数量最多，而仅靶向运动终板区域的特定部分则摄取较少。

讨论

通过肌内注射将治疗性转基因靶向输送至相应的α运动神经元，并实现逆行转运，以此作为神经肌肉疾病实验性治疗的策略并非全新。例如，该递送方法已被用于延缓ALS（肌萎缩侧索硬化）不同进展阶段SOD1小鼠和大鼠的神经肌肉退行性变^1,9-12，以及脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠的疾病进程¹³。尽管前景可观，这些基因治疗策略的疗效仍存在局限。对此，我们提出，通过选择性靶向肌肉纤维上的运动终板（MEP），有望提高脊髓运动神经元对转基因的摄取效率。需要强调的是，在上述研究中，病毒载体的肌内注射并未参考靶向肌肉中运动终板区域的具体位置进行。

在对后肢和前肢运动终板（MEPs）分布的分析过程中，我们总结出了一些规律。首先，运动终板区域横跨整个肌肉的宽度。此外，运动终板始终与肌纤维走向呈正交排列。值得注意的是，运动终板区域并不总位于肌肉最粗的部分——即通常被称为“肌腹”的区域，而该区域往往是团注式肌内注射的目标位置。需要指出的是，目前的分析是在C57Bl6小鼠^22-23和Long Evans大鼠²¹上进行的，结果表明在这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	无	稀释至 5%
Drummond PCR 微量移液器 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	配带推杆
碘化乙酰硫代胆碱	Sigma Life Science	A5751-25G
无水硫酸铜(II)	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	25608-930
甘氨酸	Ajax Finechem	1083-500G
右旋糖酐-四甲基罗丹明-生物素	Life Technologies	D-3312	溶于蒸馏水中
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g 异氟烷吸入麻醉剂
Autoclip 9 mm 伤口夹	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia 注射液	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
甲醛溶液	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus 玻片	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
硫化铵	Sigma-Aldrich	A1952	稀释至 10%
Marcain Spinal 0.5%（盐酸布比卡因）	Astrazenca		稀释至 0.25%