沿运动终板进行肌肉内注射：一种将示踪剂直接导入运动神经元的微创方法

摘要

分子通过肌肉注射后被摄取并逆行转运至相应运动神经元的效率，取决于注射位点相对于运动终板（MEPs）的位置。本文介绍如何在骨骼肌上定位运动终板，以优化示踪剂向运动神经元的逆行转运。

摘要

影响脊髓运动神经元完整性的疾病是最具致残性的神经系统疾病之一。在过去几十年中，多种此类神经肌肉疾病的动物模型相继建立，为科学界提供了多种旨在延缓或逆转这些疾病进展的治疗方案。其中一种策略是利用神经元的逆行转运机制，通过靶向骨骼肌将治疗性基因转运至相应的脊髓运动神经元。尽管该方法曾一度具有前景，但迄今为止，其所能转导的运动神经元数量不足，限制了该基因递送策略的成功。运动终板（MEP）是骨骼肌上高度特化的区域，与脊髓α运动神经元形成直接的突触连接。值得注意的是，迄今为止，将基因逆行转移至运动神经元的研究均未考虑靶向肌肉中MEP区域的具体位置。本文介绍了一种简便的实验方案：1）揭示骨骼肌表面运动终板的确切位置；2）利用该信息指导肌内注射及后续逆行示踪剂向运动神经元的有效逆行转运。我们希望将这些示踪实验的结果应用于后续研究，探索通过靶向运动终板实现治疗性基因向脊髓运动神经元逆行转运的可行性。

引言

由于运动神经元疾病、脊髓损伤以及杜氏肌营养不良等神经系统疾病导致的自主运动控制能力丧失，是一种严重影响患者日常生活的致残性疾病，其影响深远且持久。在过去十年中，旨在阻止或至少延缓这些神经肌肉疾病有害效应的研究工作已成为全球众多临床医生和科学家的优先研究方向。在这方面，近年来建立的模拟这些神经肌肉疾病的动物模型，对于深入理解这些疾病发生与进展背后的生理机制提供了重要的基础性认识^1-13。治疗这些神经肌肉疾病需要直接进入脊髓，可通过脊髓注射实现^14,15。基因治疗领域的最新进展也曾将目标定位于上下肢的横纹肌，以将治疗性基因递送至位于脊髓前角的相应α运动神经元^1,9-13。然而，这一曾被寄予厚望的策略未能改善这些神经系统疾病的临床结局。尽管可以合理地认为，这些不佳的治疗效果至少部分归因于这些保护性基因本身的低效性，但同样不能排除基因递送方法本身效率低下的问题。

运动终板（MEPs）是骨骼肌纤维上的特化区域，由起源于α运动神经元的大型外周运动纤维的轴突末梢嵌入形成。外周神经纤维末梢与运动终板共同构成神经肌肉接头，即通过顺向释放神经递质乙酰胆碱来触发突触冲动的部位。i.e.。重要的是，外周神经纤维与运动终板之间的关系是双向的，尽管存在不同的分子马达负责将分子和细胞器向神经元胞体运输以及从胞体运出^16-18。基于这些解剖学特点，运动终板似乎是向相应运动神经元递送遗传物质并实现后续逆向运输的理想靶点。在这一背景下，运动神经元转导的成功率在很大程度上取决于病毒载体肌内注射部位与肌肉运动终板之间距离的远近，这一点并不令人意外^19-20。然而令人惊讶的是，直到最近，实验室大鼠和小鼠——这两种用于模拟神经肌肉疾病的主要模式动物——其肌纤维上运动终板区域的确切位置仍不明确。

我们已绘制出大鼠和小鼠多个前肢肌肉在运动皮层代表区（MEP区域）的详细图谱 ^21-22最近，我们揭示了小鼠后肢多块肌肉的运动诱发电位区域组织的详细情况 ²³ 我们目前正在分析大鼠后肢运动终板区（MEPs）的特征。据我们观察，针对这些肌肉中整个MEP区域进行的逆行示踪剂肌内注射，所标记的运动神经元数量多于以往报道，且其分布涉及更多的脊髓节段。本文介绍了近年来逐步建立的实验方案，用于揭示MEPs在小鼠和大鼠后肢及前肢肌肉表面以及肌纤维深度上的具体位置。

方案

本研究所述所有实验操作均符合澳大利亚新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的规定，并遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于动物实验的法规。本方案中的所有操作均应按照相关动物护理与伦理委员会的要求进行。

1. 乙酰胆碱酯酶组织化学染色

1. 准备乙酰胆碱酯酶反应混合液
   1. 将 290 mg 碘化乙酰硫代胆碱加入 200 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中。用磁力搅拌器以 900 rpm 的速度搅拌混合。
   2. 在持续搅拌下加入 600 mg 甘氨酸。
   3. 在持续搅拌下缓慢加入 420 mg 硫酸铜，直至产物完全溶解。
2. 通过在灌注后的大鼠或小鼠皮肤上做切口，从颈部区域抓住皮肤并将其拉过足部，去除动物尸体（通过组织共享获得）的皮肤。确保每块肌肉表面的筋膜已被去除或明显穿孔，以使肌纤维充分暴露于反应液中。
3. 将整个身体或感兴趣的肢体浸入反应混合液中，并在 4 °C 下孵育过夜 。
4. 用蒸馏水清洗尸体 2 分钟。注意：此时肌肉呈现蓝色，运动终板（MEPs）可见为白色小点。
5. 将尸体暴露于 10% 硫化铵溶液中 3–5 秒。
   注意：肌纤维将迅速变为棕色，运动终板则表现为黑色斑点。如果反应过快，肌纤维染色过深而难以区分运动终板与肌纤维，可尝试使用较低浓度的硫化铵溶液（例如，5%）。不同样本间获得运动终板与肌纤维最佳对比度所需的反应时间有所不同，因此很难确定确切的试剂暴露时间。应密切监测反应过程，并在对比度达到理想状态时立即终止反应。
6. 用蒸馏水振荡清洗尸体两次 ，然后 轻轻拍干尸体。
7. 拍摄肢体外侧和内侧的照片，确保记录下所有目标肌肉的运动终板。

2. 在运动终板处进行肌内注射

1. 使用拉针仪制备玻璃微电极（建议使用带推杆的梯度微电极）。在解剖显微镜下，用镊子轻轻折断微电极尖端，使微电极管腔的内径约为 0.5 mm。
2. 确保所有使用的手术器械均为新近高压灭菌，且手术区域保持无菌。
3. 用 Fluoro-Gold（5% 溶于蒸馏水）填充微电极。
4. 将动物置于异氟烷诱导室中进行麻醉（4% 异氟烷溶于 O₂）。检查翻正反射，确认其消失后再将动物移出诱导室。将鼻罩固定于大鼠口鼻部，持续输送异氟烷（2% 溶于 O₂）以维持麻醉状态。轻捏动物脚趾并轻轻触碰其眼睛，确认足底回缩反射和角膜反射均消失。注意：也可使用氯胺酮与赛拉嗪的混合物（分别为 80 和 10 mg/kg，腹腔注射）。氯胺酮属于第八类管制药物（“受控”药物），必须严格遵守其采购、使用、储存和处置的相关规程。
5. 涂抹眼用润滑剂，防止手术过程中眼睛干燥。
6. 剃除目标肢体的毛发，并用纱布交替擦拭剃毛区域三次，依次使用氯己定和 70% 酒精。将动物转移至手术区域。
7. 将动物置于洁净的垫布上，并调整体位，以便充分暴露目标肌肉。
8. 使用带齿镊提起目标肌肉上方的皮肤，使其与深层肌肉组织分离，再用手术剪在皮肤上做切口。确保切口足够大，以完全暴露目标肌肉。注意尽量减少对筋膜的损伤。
9. 参考 MEP 照片，在脑海中将 MEP 区域的位置和形状对应到实际肌肉上。
   注意：可使用细头记号笔将照片中的 MEP 区域精确标记到目标肌肉表面。
10. 沿 MEP 区域全长进行多点注射（对于 Fluoro-Gold，每点注射 1–2 µl，共 3 至 4 次即可）。轻轻擦拭肌肉表面，清除任何渗出液。
11. 用钝头镊将皮肤切口两侧对合并拉近，使用手术夹闭合伤口。沿伤口全长浸润注射 0.1 ml 布比卡因（0.5% 水溶液）或其他局部麻醉药。
12. 关闭麻醉机，并持续监测动物，直至其完全从麻醉中恢复。
13. 肌肉注射后需等待 14 天，再进行动物灌流。

3. 灌注

1. 通过腹腔注射给予动物致死剂量的戊巴比妥钠溶液（例如 Lethabarb；150 mg/kg）。
   1. 密切观察动物，直至其达到深度麻醉状态，以足底回缩反射和角膜反射消失为确认依据。
2. 将动物仰卧位固定在置于灌注槽上方的解剖板上。
3. 使用带齿镊子提起覆盖胸骨基部的皮肤。用一把坚固的手术剪在胸骨正下方做一个小的皮肤切口，然后用镊子夹住胸骨的剑突软骨。在夹住剑突软骨的同时，沿胸腔两侧从胸骨向腋窝方向扩大切口。
4. 剪开膈肌以暴露心脏。
   1. 将0.ml肝素直接注射入心脏心尖部，以防止血液凝固。
   2. 剪开心尖以便将灌流套管插入左心室，然后借助止血钳迅速将套管固定到位。
   3. 用精细剪刀在右心房做一切口，立即启动蠕动泵。先用0.1 M PB灌流，直至从心房流出的液体几乎无血且肝脏颜色变为浅棕色；随后用4%多聚甲醛（溶于0.1 M PB）溶液灌流，直至动物全身变得僵硬。

4. 颈髓解剖及组织学制备

1. 将动物尸体俯卧位放置。
2. 使用解剖刀沿身体正中线切开皮肤，并从枕骨基部向髂骨水平剥离皮肤。
3. 切开并剥离椎旁肌，暴露脊柱的背侧面。
4. 辨认寰椎（Atlas）的骨性棘突及第二颈椎节段（i.e.，C2），使用外科咬骨钳或镊子将其去除，以定位相应的下方背根。
   1. 用永久性记号笔标记右侧C2背根以作识别。
   2. 依次移除后续椎骨，并用交替颜色标记右侧背根（i.e.，C2、C4、C6和C8可用绿色标记，C3、C5、C7、T1可用蓝色标记）。
5. 使用细小的外科针头（e.g.，30 G针头）轻轻刺穿覆盖脊髓末端的硬脊膜。针尖斜面朝上，将硬脊膜从脊髓上轻轻挑起，同时向头侧移动针头，形成一个纵向切口。
   1. 剥离硬脊膜。
6. 使用新的解剖刀刀片将脊髓横向切成单节或双节的组织块。
   1. 保持脊髓节段原位，对每个组织块，在相邻两个神经根之间的中点处，用刀片在左侧做一小记号作为定位标记。确保该标记足够深，以便从组织块的腹侧面也能观察到。标记时角度约为45°，相对于动物解剖方向指向前方或后方，以利于后续解剖后组织段的方位识别。
7. 将各个组织块分别收集至贴有清晰标签的小瓶中，瓶内含4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸缓冲液），室温下固定过夜。
8. 将组织块转移至装有新鲜且标签清晰的小瓶中，瓶内含蔗糖溶液（30%溶于0.1 M磷酸缓冲液），4 °C保存至少两天。
9. 将组织段置于冷冻模具中，并包埋于组织冷冻介质中。进行纵向组织学切片时，应使组织块的背侧面朝上，并利用定位标记在冷冻模具中正确 orient 组织块。
10. 将冷冻模具置于-20 °C冷冻，用恒冷切片机切成50 µm厚的切片。注意：切片可直接贴附于防脱载玻片上，过夜干燥；或者将切片漂浮于盛有0.1 M磷酸缓冲液的48孔板中，随后利用定位标记将组织切片定向贴附于载玻片上。

5. 腰段脊髓解剖及组织学制备

1. 将动物尸体仰卧放置。
2. 沿动物腹部正中线做切口，移除内脏。解剖出腹后壁肌肉以暴露脊柱的腹侧面。
3. 找到最尾端的短肋骨及其相邻的第13胸椎（T13），此处为T13脊神经前根穿出骨骼的位置。
   1. 依次逐个移除位于T13前方的两到三节椎骨即使用精细的外科咬骨钳暴露T12、T11以及必要时的T10椎体，沿T13腹侧根追踪至其进入脊髓腹侧的位置，并用永久性记号笔标记该处。
   2. 从这一点开始，重复相同的操作，以确定 L1、L2、L3、L4、L5、L6 和 S1 节段腹根进入点的位置，并用交替的颜色进行标记。
4. 按照第4.5-4.10节所述的相同步骤进行腰髓解剖。

结果

乙酰胆碱酯酶组织化学染色可显示肌肉横向上运动终板的位置。图1展示了对整只大鼠前肢进行此类染色的结果。若肌肉纤维上的非特异性背景染色过强，建议优化硫酸铵溶液的浓度（例如，使用5–7%而非10%）以及标本在溶液中的浸渍时间。图2展示了在小鼠肱三头肌运动终板区域沿其长度注射逆行神经示踪剂后，颈段脊髓中出现的一列标记的运动神经元。逆行标记的运动神经元通常形成一条纵向柱状结构，跨越脊髓的多个节段。图3展示了通过选择性地将Fluoro-Gold靶向肱三头肌运动终板区域，所获得的不同数量的脊髓运动神经元标记结果。当示踪剂注入整个运动终板区域时，标记神经元数量最多，而仅靶向运动终板区域的特定部分则摄取较少。

讨论

通过肌内注射将治疗性转基因靶向输送至相应的α运动神经元，并实现逆行转运，以此作为神经肌肉疾病实验性治疗的策略并非全新。例如，该递送方法已被用于延缓ALS（肌萎缩侧索硬化）不同进展阶段SOD1小鼠和大鼠的神经肌肉退行性变^1,9-12，以及脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠的疾病进程¹³。尽管前景可观，这些基因治疗策略的疗效仍存在局限。对此，我们提出，通过选择性靶向肌肉纤维上的运动终板（MEP），有望提高脊髓运动神经元对转基因的摄取效率。需要强调的是，在上述研究中，病毒载体的肌内注射并未参考靶向肌肉中运动终板区域的具体位置进行。

在对后肢和前肢运动终板（MEPs）分布的分析过程中，我们总结出了一些规律。首先，运动终板区域横跨整个肌肉的宽度。此外，运动终板始终与肌纤维走向呈正交排列。值得注意的是，运动终板区域并不总位于肌肉最粗的部分——即通常被称为“肌腹”的区域，而该区域往往是团注式肌内注射的目标位置。需要指出的是，目前的分析是在C57Bl6小鼠^22-23和Long Evans大鼠²¹上进行的，结果表明在这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	无	稀释至 5%
Drummond PCR 微量移液器 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	配带推杆
碘化乙酰硫代胆碱	Sigma Life Science	A5751-25G
无水硫酸铜(II)	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	25608-930
甘氨酸	Ajax Finechem	1083-500G
右旋糖酐-四甲基罗丹明-生物素	Life Technologies	D-3312	溶于蒸馏水中
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g 异氟烷吸入麻醉剂
Autoclip 9 mm 伤口夹	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia 注射液	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
甲醛溶液	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus 玻片	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
硫化铵	Sigma-Aldrich	A1952	稀释至 10%
Marcain Spinal 0.5%（盐酸布比卡因）	Astrazenca		稀释至 0.25%