小鼠肾脏移植技术

摘要

本文的目的是描述在小鼠中进行肾移植手术所需的操作步骤，特别关注动脉吻合的细节。

摘要

首例小鼠肾移植技术由Russell实验室于1973年发表¹。尽管其他实验室花费了数年时间才熟练掌握并应用该技术，但如今该技术已被全球众多实验室广泛使用。1993年，Kalina和Mottram²对原始技术进行了重要改进，采用供体主动脉而非肾动脉进行动脉吻合；该实验室于1999年又进一步推进了此项技术³。尽管研究者可在此模型上达到熟练操作水平，但文献检索显示，许多实验室仍因动脉血栓形成而导致较高比例的移植物丢失。本文介绍一种由本实验室设计的技术，可显著降低其他研究者所报告的动脉血栓发生率^4,5。该技术通过构建供体肾下主动脉的“足跟-足尖”套管结构，实现更大的吻合口以及更平直的血流进入肾脏。

引言

自1973年以来，小鼠肾移植模型已成为一项重要的研究工具，但技术难题限制了其广泛应用。多年来已发表多篇论文，详细阐述了对该手术方法的改进与优化。作为一种主要的血管化实体器官移植模型，该手术的重要性可能仅次于同样由Russell实验室于1973年设计的异位心脏移植模型⁶。这两种模型均适用于研究同种异体排斥反应、移植肾功能延迟恢复以及缺血再灌注损伤的发生机制。

在肾移植中，最常报告的问题之一是动脉血栓形成的相对高发率^4,5,7，我们在实验室中也遇到了这一问题。因此，我们着手对血栓形成的相关文献进行综述，试图找出这一技术问题的可能原因，并设计出可行的解决方案。血栓形成的最可能原因是血液从受体腹主动脉进入供体肾主动脉，再流向供体肾动脉时所经过的路径较为迂曲。这一路径会导致肾动脉内血流紊乱，从而引起血小板活化和血栓形成。根据近期的观察结果及相关文献检索^8-14，我们提出了一种新技术，已将血栓发生率降至0%。

本文所述技术与先前报道的技术不同之处在于采用了一种动脉“ heel-and-toe”套管结构，该结构可改善血流并显著减少血栓形成。该套管通过在肾动脉开口平面处以小于45^o的角度横断腹主动脉下段而形成（图1A & 1B），从而获得长度约为2 mm的套管。静脉Carrel补片则通过将肾静脉横断至下腔静脉（IVC）而形成，从而增加套管的直径。供体腹主动脉下段的heel-and-toe套管以端侧吻合方式连接至受体腹主动脉，而供体肾静脉/下腔静脉补片则以端侧吻合方式连接至受体腹下腔静脉（IVC）。随后，输尿管按Han等³所述方法置入并固定于膀胱内。

本研究中，仅采用未经处理且仅经历热缺血时间的移植器官（即., 无冷缺血）进行比较。此处，热缺血指从供体肾脏血流停止（见下文步骤1.11）至移植肾在受体体内重新灌注（见下文步骤2.11）之间的时间段；冷缺血指肾脏未接受灌注并处于低温保存状态，直至移植手术开始前的这段时间。

方案

所有小鼠均购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港），并根据美国国立卫生研究院（NIH）指南及科罗拉多大学丹佛分校IACUC的批准，在科罗拉多大学丹佛分校芭芭拉·戴维斯中心动物设施的无病原体条件下饲养。

1. 供体肾脏摘取

1. 所有器械均需灭菌，操作全程佩戴无菌手套，并维持无菌区域。所有手术均需在手术显微镜下进行。
2. 从腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）麻醉的小鼠供体中切取供肾。通过夹趾反应判断麻醉深度，并观察呼吸频率。
3. 剪除腹部毛发，使用四点固定法固定小鼠。以聚维酮碘消毒皮肤，并以无菌方式铺巾。
4. 沿腹中线作长约2 cm的垂直切口，进入腹腔。将肠管向上牵开并外置于胸部，术中始终用无菌湿纱布包裹肠管。
5. 辨认腹腔主要血管并游离之，识别任何腰动脉分支，并使用10/0尼龙缝线电凝或结扎。
6. 在左肾血管远端约2 mm处，通过钝性分离将下腔静脉（IVC）与腹主动脉（AA）分开。使用10/0尼龙线结扎并切断肾血管上的小动脉和静脉分支。
7. 通过钝性分离仔细将肾静脉与肾动脉分开。此举有助于在肾静脉近端精确制备Carrel瓣，该瓣将用于与受体下腔静脉行端侧吻合。
8. 辨认、结扎并切断左肾上腺血管。由此可暴露肾上主动脉，并在主动脉周围预置6-0丝线以备结扎，但暂不打结。
9. 游离肾脏、血管及输尿管周围筋膜组织。将肾脏向右侧旋转，结扎并切断任何后侧分支，随后将肾脏复位至左侧。
10. 接下来处理输尿管。在不扰动肾门结构的前提下，小心从周围筋膜中游离输尿管，注意保护输尿管血管。在输精管水平切断输尿管。此时供肾已准备就绪，可进行切取。
11. 缓慢向远端下腔静脉注射300单位肝素，以实现供体肝素化。收紧并打结此前绕于肾上主动脉的6-0丝线，经远端腹主动脉以0.8 ml肝素化生理盐水（100 U/ml）灌注左肾。
12. 灌注完成后立即制备静脉Carrel瓣，以防止血液反流入肾。将肾静脉向肾脏方向牵拉，暴露其下方的腹主动脉和肾动脉。
13. 在肾动脉旁切断主动脉，形成如图 1所示的“足”和“趾”状袖状结构。将肾脏、血管及输尿管从供体中取出。
14. 将肾脏直接转移至预先准备好的受体（冷缺血时间为0分钟 ），或在选定溶液中4 ^oC保存预定时间后进行移植。通过放血和颈椎脱位处死供体动物。获取供肾的总时间约为15–20分钟。

2. 肾脏移植技术

1. 用戊巴比妥（60mg/kg 腹腔注射初剂量，必要时追加 25mg/kg 腹腔注射）麻醉受体小鼠。通过夹趾法判断麻醉深度，并观察呼吸频率。剪除腹部毛发，使用四点固定法固定小鼠，并在眼睛上涂抹眼用软膏。用聚维酮碘消毒皮肤，以无菌方式铺巾。
2. 沿腹中线做一长约 2 cm 的垂直切口，进入腹腔。将肠管向上牵拉并外置于胸部。在整个手术过程中，用无菌湿纱布包裹肠管以保持湿润。
3. 此时行右侧肾切除术。使用 6-0 丝线结扎肾动脉和肾静脉。在结扎线远端切除肾脏。使用 6-0 丝线结扎输尿管，然后在靠近肾脏侧将其切断。
4. 游离肾血管下方的腹主动脉和下腔静脉（IVC）。在吻合部位的上方和下方分别围绕腹主动脉和下腔静脉放置 4-0 棉线结扎线。使用 10-0 尼龙缝线识别并结扎术野内的任何腰动脉分支。
5. 结扎棉线，先结扎远端（下方），再结扎近端（上方）。这样可在腹主动脉内保留少量血液，便于后续主动脉切开。
6. 使用 30G 针头刺入腹主动脉管腔，形成主动脉切口。用精细显微剪刀将切口纵向延长至约 2 mm 长。
7. 以下述方式将供体主动脉袖状结构（heel-and-toe cuff）与受体腹主动脉行端侧吻合。在供体主动脉和受体主动脉切口的下角处各置入一针 10-0 尼龙缝线作为固定缝线并打结。
8. 在供体主动脉的对侧和受体腹主动脉切口的上角处再置入第二针 10-0 尼龙缝线并打结。从上至下沿主动脉侧壁连续缝合，并与先前放置的固定缝线打结固定；随后以连续缝合法缝合主动脉内侧壁并打结。
9. 以下述方式将供体肾静脉与受体下腔静脉（IVC）行端侧吻合。用 30G 针头穿刺下腔静脉，再用精细显微剪刀延长切口。使用 10-0 尼龙缝线将供体肾静脉与下腔静脉切口的下角固定并打结。在肾静脉与下腔静脉之间行连续缝合，并打结闭合。
   注意：至关重要的是，缝针必须贯穿血管全层，包括血管外膜和内膜。翻转血管边缘可确保内膜与内膜直接接触，有助于吻合口的密封和愈合。尽管止血凝血剂有助于减少渗漏，但我们建议外科医生主要依赖良好的手术技术。
10. 确保吻合口“干净”，即缝合时对侧管壁未被误缝。否则将导致显著的血流受阻，可能引起移植失败，严重时甚至导致后肢瘫痪。
    注意：另一个至关重要的因素是确保吻合缝线的张力适中。过松会导致不可逆的渗漏，过紧则会引起狭窄而阻碍血流。若发生在动脉侧，将导致移植物灌注不良；若发生在静脉侧，则会导致肾脏充血。
11. 松开远端的 4-0 棉线结扎线，恢复静脉血流。观察静脉吻合口止血情况后，逐渐松开近端的 4-0 棉线结扎线，并观察动脉吻合口是否止血良好。
12. 确认两个吻合口均稳固后，移除小鼠体内的棉线结扎线。用 20G 针头在膀胱壁上穿刺两个小孔。
13. 将弯钳尖端穿过两个小孔，用弯钳将供体输尿管拉入膀胱内，并用两针 10-0 尼龙缝线将输尿管近端固定于膀胱壁。修剪从第二个小孔中突出的多余输尿管长度，使输尿管自然回缩至膀胱内，然后用两针 10-0 尼龙缝线闭合该小孔。
14. 将肠管复位至腹腔内。使用 5-0 丝线以连续缝合法分两层关闭腹壁。
15. 关闭腹腔时，向腹腔内注射 1.0 ml 无菌温生理盐水作为液体复苏；术后皮下注射 0.8 ml 生理盐水。手术期间无需其他支持性措施。
16. 将动物置于保温毯上恢复。总移植手术时间约为 35–45 分钟。在手术开始时皮下注射镇痛药（如丁丙诺啡，0.05 mg/kg，0.1–0.2 ml），术后每 6–12 小时重复给药一次，持续 72 小时。

3. 对侧肾切除术

1. 根据实验方案要求，在植入手术后的数天内，在异氟烷麻醉下（5% 吸入式异氟烷用于诱导，1.5–2.0% 用于维持）进行对侧肾切除术。
2. 进入腹腔，轻柔地将肠管向动物右侧牵拉。暴露左肾，并钝性分离周围筋膜。
3. 使用 6-0 丝线结扎肾动脉、肾静脉和输尿管，然后在结扎线以上切除并移除肾脏。总手术时间约为 10 分钟。

4. 移植物评估

1. 采用碱性苦味酸法（Jaffe 反应）测定血清肌酐。

结果

该手术技术既可用于简单的移植物存活/排斥研究，也可用于相当复杂的实验方案。在下图中，我们展示了采用这种改进的动脉吻合技术的优势。通过该技术，我们将动脉血栓的发生率从35%显著降低至0%，从而提高了实验效率。我们已使用该技术超过一年，并持续保持0%的血栓发生率。图1描述了动脉“足跟-足尖”套管的制备方法，这是本新技术的基础。该套管可实现更长的吻合段以及更平直的血流进入肾脏的路径。这两个特点均显著减少了血流湍动，从而降低了血小板活化和血栓形成的可能性。

图1. 供体血管袖套制备及动脉吻合结果的示意图。（A） 动脉跟趾式袖套形成的线图。通过在肾动脉开口处...

讨论

掌握这种移植技术难度较大，但一旦成功，它将成为一种非常强大的研究工具。耐心细致的外科医生/研究人员将通过注重细节和技术操作的一致性而获得回报，这是掌握任何外科手术的关键，尤其是在小型动物模型中更为重要。掌握小鼠肾移植技术存在多方面的技术难点，因此在尝试该手术之前，极有必要先积累其他小型动物移植模型的操作经验。

确保吻合口“干净”非常重要；即 缝合时必须避免夹住相对的血管壁，以保持管腔通畅。否则将导致血流严重受阻，极有可能造成移植失败，在极端情况下甚至导致后肢瘫痪。同样至关重要的是，缝合针必须穿透包括血管外膜和内膜在内的全层血管壁，这样才能使血管边缘正确外翻，确保内膜与内膜接触，从而促进吻合口的封闭与愈合。尽管止血凝血剂有助于减少渗漏，但我们建议外科医生应依赖良好的手术技术。

还必须注意确保吻合缝线的张力处于最佳状态，过松会导致不可逆的渗漏，过紧则会引起血流减少。若发生在动脉侧，将导致移植物灌注不良；若发生在静脉侧，则会导致肾脏充血。达到合适的张力需要通过实践和经验积累，其他小型动物微血管模型的操作经...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器	Roboz 编号	Fine Science Tools 编号	Arosurgical 编号
直型显微解剖镊 #5	RS-5015	11295-51
弯型显微解剖镊 #7	RS-5047	11297-00
弯型锯齿镊	RS-5137	11052-10
Vannas 显微解剖剪，短头	RS-5610		09.140.08
显微解剖剪，直头，锐利，长柄		11.602.11
微型弹簧手柄持针器			11.549.15
直型蚊式钳		91308-12
显微解剖剪，直头，钝头	RS-5962	14078-10
显微解剖剪，弯头，钝头	RS-5981	14079-10
微型牵开器	RS-6540
器械托盘，10” x 6 ½” x ¾”	RT-1350S
丝线缝合线，5/0，22.5米卷装		18020-50
缝合线
10/0 尼龙线			T4A10Q07
5/0 丝线			E19A05N
手套		手术巾
Medex Supply Biogel 手套		Precept，#64-9012-9
注射器		棉签
B-D 1cc 胰岛素注射器，#329424		Fisher 品牌，#23-400-100
聚维酮碘棉签
PDI，#B40600
4/0 棉线结扎线
与器械一同高压灭菌的国产棉线