通过siRNA实现基因沉默是一种便捷的实验策略，可用于分析BRCA2依赖的生物学功能，有助于更好地理解癌症生物学。本文介绍了一种高效沉默BRCA2基因的方法，以及在人源细胞系中通过免疫印迹检测和定量BRCA2蛋白表达变化的实验流程。
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摘要
摘要
由于人源BRCA2蛋白分子量较大（约390 kDa），通过常规生化分析方法实现肿瘤抑制蛋白BRCA2的沉默及其检测一直面临重大技术挑战。本文报道了对标准siRNA转染和免疫印迹实验方案的改进，可分别用于在人源上皮细胞系中沉默BRCA2基因并检测内源性BRCA2蛋白。关键技术步骤包括采用较高的siRNA与转染试剂比例，以及在同一实验中进行两轮连续的siRNA转染。结合其他优化措施，通过抗BRCA2抗体的免疫印迹分析显示，该方法可稳定实现超过70%的人源BRCA2基因沉默效率。此外，将细胞裂解液的变性温度由常规的70–100 °C调整为55 °C，并对免疫印迹流程进行其他技术优化，使得即使在起始材料极少或BRCA2蛋白表达水平极低的情况下，仍可检测到完整的BRCA2蛋白。在BRCA2功能完整的细胞（包括肿瘤细胞）中高效沉默BRCA2，为研究由肿瘤中致病性BRCA2突变所影响的新分子通路和细胞功能提供了有价值的策略。本实验方案亦可便捷地适用于其他类似BRCA2的“大分子”蛋白的高效沉默与分析。
引言
BRCA2（乳腺癌易感基因-2）基因编码一种肿瘤抑制蛋白，该蛋白通过调控重组酶Rad51的功能，在DNA双链断裂修复过程中发挥关键作用1。此外，BRCA2还参与转录调控和细胞周期控制2。BRCA2基因的种系突变可导致常染色体显性遗传，使女性对乳腺癌和卵巢癌、男性对前列腺癌的易感性增加，并可能增加其他多种癌症的发病风险3,4。然而，尽管携带BRCA2突变会增加患癌风险，但这些导致BRCA2功能抑制或降低的突变也可能使癌细胞对引起DNA损伤的化疗药物更为敏感5-7。散发性癌症中BRCA2基因突变的发生率较低（< 3%），但在某些癌症类型中已检测到BRCA2蛋白水平下降，提示在散发性癌症的发生过程中，BRCA2蛋白可能通过非突变依赖性机制丢失7,8。因此，全面理解BRCA2在癌症生物学及其他生物学背景下的功能具有重要意义。
在哺乳动物细胞中鉴定基因新功能的一个有力工具是使其表达沉默。例如，近期在多种正常上皮细胞中沉默BRCA2的表达，揭示了BRCA2作为一种调节失巢凋亡抵抗性的新功能，而失巢凋亡抵抗性是癌细胞获得侵袭和转移能力过程中的重要步骤9。基因沉默可通过向细胞中导入靶向特定基因的小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）分子来实现。siRNA具有高效性和操作简便的优点，使其成为旨在深入了解关键生物学过程并鉴定新治疗靶点的基因沉默实验中的首选工具。然而，并非所有基因的表达都能轻易实现有效敲低，且其效率可能因细胞类型不同而存在显著差异。由于细胞内蛋白水平的降低是研究中最相关的表型，因此通过免疫印迹分析目标基因产物来定量评估基因沉默效果至关重要。在这方面，BRCA2蛋白带来了额外挑战：作为一种大分子蛋白（约390 kDa），其在包括免疫印迹在内的常规生化分析中存在技术上的困难。
本文报道了一种优化的实验方案，可高效沉默人上皮细胞系中的BRCA2基因，并通过免疫印迹分析快速、成功地检测BRCA2蛋白的表达下调。
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方案
1. 准备siRNA溶液
- 将5 nmol的乱序对照（Ctrl）和5 nmol的BRCA2 siRNA冻干粉分别重悬于100 µl无RNase的水中（最终siRNA浓度为50 µM）。此为siRNA储存液，需分装为10 µl每份，于-20 °C保存。
- 取10 µl siRNA储存液，加入40 µl无RNase的水，配制成10 µM的siRNA工作液。该稀释液应于-20 °C保存直至使用。
注意：siRNA工作液的冻融次数不应超过3次。
2. 人上皮细胞系的接种
- 从在37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中以单层形式生长于组织培养板中的人上皮细胞系中移除培养基。
- 用室温的PBS洗涤细胞一次（100 mm培养板使用10 ml PBS）。
- 为使细胞从培养板上脱离，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA溶液，并根据细胞类型孵育3-5分钟。
- 在收集脱离的细胞前，加入2 ml含10%胎牛血清的完全培养基以中和胰蛋白酶。
- 将细胞转移至15 ml离心管中。
- 在4 °C下，使用摆动桶转子以320-330 × g离心3分钟。
- 用5 ml不含抗生素的培养基重悬细胞沉淀。
- 按照制造商说明，使用血球计数板在显微镜下或使用自动细胞计数系统对细胞进行计数。
- 将细胞接种于6孔板中，使24小时后细胞融合度达到约80%（每孔2 ml培养基中接种0.5-1 × 106个细胞）。最佳接种细胞数量可能因特定细胞系及其生长速率而异。
注意：此时培养基中不要添加抗生素，因为抗生素会负面影响转染效率。为获得高效的BRCA2 siRNA转染，细胞必须处于较低的传代次数（< 10）。
3. 用 siRNA 转染细胞
- 接种细胞24小时后，进行第一轮转染。
- 将6 µl基于脂质的10 siRNA特异性转染试剂溶于130 µl低血清培养基中。
- 将3 µl 10 µM siRNA（30 pmol）溶于130 µl低血清培养基中。
- 将稀释后的siRNA与稀释的转染试剂混合，室温孵育5–10分钟。
- 孵育期间，移除细胞培养基，加入2 ml预热至37 °C的新鲜培养基（不含抗生素）。
- 向细胞中加入250 µl siRNA-转染试剂复合物（此量适用于6孔板中的单个孔）。
- 将细胞置于37 °C、含5% CO2的加湿培养箱中孵育。
- 24小时后，通过重复步骤3.1.1–3.1.5进行第二轮转染，其中步骤3.1.2修改如下：将5 µl 10 µM siRNA（50 pmol）溶于130 µl低血清培养基中。
- 转染后将细胞在37 °C孵育1–2天，再进行分析。
注：进行两轮转染，并在第二轮中使用较高的siRNA/转染试剂比例，对于实现高效的BRCA2基因沉默至关重要。
- 转染后将细胞在37 °C孵育1–2天，再进行分析。
4. 裂解细胞以进行免疫印迹分析
- 用含有1%非离子型非变性去污剂辛基苯基聚乙氧基乙醇、5 mM 焦磷酸钠、1 mM 正钒酸钠、10 mM 氟化钠、2 mM 苯甲基磺酰氟、10 µg/ml 亮抑酶肽和10 µg/ml 抑肽酶的PBS（pH 7.4）配制新鲜裂解缓冲液。置于冰上保存。
- 从细胞中移除培养基，用冷PBS（每孔2 ml）洗涤细胞一次。为防止PBS残留，请彻底移除孔板中的PBS。
- 向每孔加入200 µl裂解缓冲液。
注意：如果细胞还需用于其他检测，请按照步骤2.1–2.6所述进行胰蛋白酶消化，并根据后续应用将细胞重悬于适当的缓冲液或培养基中。 - 轻轻旋转孔板，使裂解缓冲液均匀分布，并在4 °C下旋转孵育15分钟。
- 使用细胞刮刀将细胞裂解物收集至预冷的微量离心管中。
- 在4 °C下以17,900 × g离心25分钟，将上清液转移至新管中。
- 根据制造商说明书，使用市售的蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。
5. BRCA2 免疫印迹分析
- 通过将50 ml的20x Tris-乙酸盐SDS电泳缓冲液（50 mM Tricine，50 mM Tris碱，0.1% SDS，pH 8.24）用950 ml蒸馏水稀释，配制电泳运行缓冲液。
- 按如下方式制备样品：加入15 µg总细胞裂解物、5 µl含十二烷基硫酸锂（pH 8.4）的4x上样缓冲液、2 µl 10x样品还原剂（0.5 M DTT），并用裂解缓冲液补足至终体积20 µl。
注：本方案即使使用较低量的总蛋白（低至5 µg），也可在正常细胞系中检测到BRCA2。 - 在55 °C下使样品变性10分钟。
注：必须使用55 °C。由于BRCA2蛋白具有热敏感性11，更高的变性温度会导致完整全长（390 kDa）BRCA2蛋白显著降解。 - 根据制造商说明书设置电泳槽。
- 将样品和10 µl高分子量预染蛋白标准品加样至预制胶（Tris-乙酸盐 3-8%）中，在120 V下电泳约2小时12。在55 kDa蓝色标记物离开预制胶前停止电泳。
- 用50 ml 20x转移缓冲液、100 ml 100%甲醇和850 ml水配制转膜缓冲液。
- 将PVDF膜（0.45 µm孔径）浸入100%甲醇中活化5分钟，用蒸馏水冲洗后，在转移缓冲液中平衡至少5分钟。将转膜装置的海绵在4 °C的转移缓冲液中浸泡至使用前。
- 电泳结束后，按以下顺序（自下而上）组装转膜“三明治”结构：三片浸透转移缓冲液的海绵、一片浸透转移缓冲液的3MM级滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、一片浸透转移缓冲液的3MM级滤纸、三片浸透转移缓冲液的海绵13,14。将组装好的转膜装置放入电泳槽，在4 °C、350 mA条件下转膜4小时，或在4 °C、180 mA条件下过夜转膜。
注：由于BRCA2是一种非常大的蛋白，必须将转膜时间从1小时（制造商及多数转膜方案推荐）延长至4小时或过夜，以确保高分子量蛋白的完全转移。此外，由于转膜时间较长，必须在4 °C的低温环境中进行，以减少过热并便于拆卸“三明治”结构。半干转系统不适用于大分子蛋白的转膜。 - 转膜完成后，用TBS洗涤膜，然后在室温下用含5%脱脂奶粉的TBS-Tween 0.25%（TBS-T）封闭1小时，并在4 °C下用30 μl抗BRCA2兔多克隆抗体（200 μg/ml）在9 ml TBS-T + 5%脱脂奶粉中（1:300, v/v稀释）孵育过夜。
- 用TBS-T洗涤膜三次，每次10分钟，然后在10 ml TBS-T + 5%脱脂奶粉中加入1 μl辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，室温孵育1小时。随后再用TBS-T洗涤三次，每次10分钟。
- 使用增强化学发光（ECL）Western Blot检测试剂，按照制造商说明书进行ECL免疫检测，以显影BRCA2蛋白。在高分辨率ECL胶片上观察化学发光条带。
- 在同一张膜上使用看家基因（如β-微管蛋白，55 kDa）的抗体进行免疫检测，作为上样对照。使用单克隆抗β-微管蛋白抗体，按1:1,000比例稀释（10 µl抗微管蛋白抗体加入10 ml TBS-T + 5%脱脂奶粉），室温孵育1小时。洗涤后，按BRCA2检测步骤（5.10–5.11）孵育二抗，但使用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗替代抗兔二抗。
- 获取印有化学发光条带的胶片的数字图像，并使用专用图像分析软件（例如，ImageJ）分析条带强度。
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结果
在进行生物学/生物化学实验以研究BRCA2沉默对细胞功能的影响之前，第一步是通过平行使用乱序siRNA（非靶向siRNA）和BRCA2 siRNA来验证沉默的特异性（图1A）。为了获得高效的BRCA2沉默效果，使用高siRNA/转染试剂比例进行第二轮siRNA转染至关重要。事实上，仅进行一轮siRNA转染，或在第二轮中使用较低的siRNA/转染试剂比例（25 pmol siRNA和6 µl转染试剂），将导致基因敲低效率降低（图1B）。第二步是确定实现最高基因沉默水平所需的最短作用时间。根据细胞类型的不同，该时间通常在第二轮siRNA转染后24至48小时之间。例如，Nthy甲状腺细胞在24小时即可达到充分沉默，而PNT1A前列腺细胞则需要长达48小时才能实现有效的BRCA2基因敲低（图2A）。BRCA2的沉默效果在第二次转染周期后的7天内保持相对稳定（图2B）。值得注意的是，若将细胞裂解液在高于55 °C的温度下变性（如100 °C加...
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讨论
由于BRCA2基因的种系突变会增加多种癌症的发病风险，包括女性和男性乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌以及黑色素瘤3,4，已有大量研究致力于阐明BRCA2蛋白的生物学功能。由于分析BRCA2这类巨大蛋白存在技术上的困难，大多数研究主要基于遗传学方法。本文所述的BRCA2蛋白表达沉默与分析方法，为在广泛的生物学实验中研究BRCA2肿瘤抑制基因的功能提供了一种高效工具。该沉默实验方案基于标准的siRNA转染流程，但包含若干关键性改进以及确保BRCA2基因稳定且高效敲低的操作要点。siRNA转染方案安全、快速且高效；与通常使用慢病毒载体的shRNA方法不同，该方法无需特殊的生物安全防护措施，可在任何具备细胞培养条件的实验室中轻松实施。同样，免疫印迹（immunoblotting）方案也经过优化，可高效检测BRCA2这类大分子量蛋白。该免疫印迹方案还已验证可用于检测在酵母细胞中异源表达的重组人BRCA2蛋白9。
本文报道了高效递送siRNA的若干重要影响因素。其中包括进行两轮转染，以及使用较高的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由FIRB-Merit基金项目RBNE08YFN3_005和RBNE08HWLZ_012，以及意大利经济与财政部资助国家研究委员会（CNR）的“FaReBio di Qualità”项目提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| 对照 siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus 非靶向对照试剂池 |
| Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂 | Life Technologies | 13778075 | 转染试剂 |
| OPTI-MEM I 低血清培养基 | Life Technologies | 31985-070 | 转染实验用培养基 |
| NuPAGE Tris-乙酸盐 3-8% 1.5 mm 预制胶 | Life Technologies | EA0378 | 蛋白电泳用凝胶 |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液 | Life Technologies | NP0007 | 蛋白电泳用试剂 |
| NuPAGE 样品还原剂 (10x) | Life Technologies | NP0004 | 蛋白电泳用试剂 |
| NuPAGE 抗氧化剂 | Life Technologies | NP0005 | 蛋白电泳用试剂 |
| HiMark 预染蛋白标准品 | Life Technologies | LC5699 | 凝胶电泳预染标记物 |
| XCell SureLoc Mini-Cell 电泳系统 | Life Technologies | EI0002 | 蛋白电泳/转膜设备 |
| NuPAGE Tris-乙酸盐 SDS 电泳缓冲液 | Life Technologies | LA0041 | Western 印迹试剂 |
| PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 | Western 印迹试剂 |
| NuPAGE 转膜缓冲液 | Life Technologies | NP0006-1 | Western 印迹试剂 |
| BRCA2 H-300 兔多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 稀释 |
| β-微管蛋白单克隆抗体 | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 稀释 |
| 脱脂奶粉 | Sigma Aldrich | 70166 | Western 印迹试剂 |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Western 印迹试剂 |
| SuperSignal West Pico/Femto 化学发光底物 | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | 化学发光检测系统 |
| PNT1A 细胞 | SIGMA Aldrich (ECACC 提供) | 95012614 | PNT1A 人正常前列腺上皮细胞，经 SV40 永生化 |
| Nthy 细胞 | SIGMA Aldrich (ECACC 提供) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 人甲状腺滤泡上皮细胞系 |
| 细胞增殖检测试剂盒 I (MTT) | Roche | 11465007001 | 细胞增殖检测用试剂盒 |
参考文献
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