在培养的人类细胞中沉默BRCA2以鉴定新型BRCA2调控的生物学功能

摘要

通过siRNA实现基因沉默是一种便捷的实验策略，可用于分析BRCA2依赖的生物学功能，有助于更好地理解癌症生物学。本文介绍了一种高效沉默BRCA2基因的方法，以及在人源细胞系中通过免疫印迹检测和定量BRCA2蛋白表达变化的实验流程。

摘要

由于人源BRCA2蛋白分子量较大（约390 kDa），通过常规生化分析方法实现肿瘤抑制蛋白BRCA2的沉默及其检测一直面临重大技术挑战。本文报道了对标准siRNA转染和免疫印迹实验方案的改进，可分别用于在人源上皮细胞系中沉默BRCA2基因并检测内源性BRCA2蛋白。关键技术步骤包括采用较高的siRNA与转染试剂比例，以及在同一实验中进行两轮连续的siRNA转染。结合其他优化措施，通过抗BRCA2抗体的免疫印迹分析显示，该方法可稳定实现超过70%的人源BRCA2基因沉默效率。此外，将细胞裂解液的变性温度由常规的70–100 °C调整为55 °C，并对免疫印迹流程进行其他技术优化，使得即使在起始材料极少或BRCA2蛋白表达水平极低的情况下，仍可检测到完整的BRCA2蛋白。在BRCA2功能完整的细胞（包括肿瘤细胞）中高效沉默BRCA2，为研究由肿瘤中致病性BRCA2突变所影响的新分子通路和细胞功能提供了有价值的策略。本实验方案亦可便捷地适用于其他类似BRCA2的“大分子”蛋白的高效沉默与分析。

引言

BRCA2（乳腺癌易感基因-2）基因编码一种肿瘤抑制蛋白，该蛋白通过调控重组酶Rad51的功能，在DNA双链断裂修复过程中发挥关键作用¹。此外，BRCA2还参与转录调控和细胞周期控制²。BRCA2基因的种系突变可导致常染色体显性遗传，使女性对乳腺癌和卵巢癌、男性对前列腺癌的易感性增加，并可能增加其他多种癌症的发病风险^3,4。然而，尽管携带BRCA2突变会增加患癌风险，但这些导致BRCA2功能抑制或降低的突变也可能使癌细胞对引起DNA损伤的化疗药物更为敏感^5-7。散发性癌症中BRCA2基因突变的发生率较低（< 3%），但在某些癌症类型中已检测到BRCA2蛋白水平下降，提示在散发性癌症的发生过程中，BRCA2蛋白可能通过非突变依赖性机制丢失^7,8。因此，全面理解BRCA2在癌症生物学及其他生物学背景下的功能具有重要意义。

在哺乳动物细胞中鉴定基因新功能的一个有力工具是使其表达沉默。例如，近期在多种正常上皮细胞中沉默BRCA2的表达，揭示了BRCA2作为一种调节失巢凋亡抵抗性的新功能，而失巢凋亡抵抗性是癌细胞获得侵袭和转移能力过程中的重要步骤⁹。基因沉默可通过向细胞中导入靶向特定基因的小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）分子来实现。siR....

方案

1. 准备siRNA溶液

1. 将5 nmol的乱序对照（Ctrl）和5 nmol的BRCA2 siRNA冻干粉分别重悬于100 µl无RNase的水中（最终siRNA浓度为50 µM）。此为siRNA储存液，需分装为10 µl每份，于-20 °C保存。
2. 取10 µl siRNA储存液，加入40 µl无RNase的水，配制成10 µM的siRNA工作液。该稀释液应于-20 °C保存直至使用。
   注意：siRNA工作液的冻融次数不应超过3次。

2. 人上皮细胞系的接种

1. 从在37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中以单层形式生长于组织培养板中的人上皮细胞系中移除培养基。
2. 用室温的PBS洗涤细胞一次（100 mm培养板使用10 ml PBS）。
3. 为使细胞从培养板上脱离，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA溶液，并根据细胞类型孵育3-5分钟。
4. 在收集脱离的细胞前，加入2 ml含10%胎牛血清的完全培养基以中和胰蛋白酶。
5. 将细胞转移至15 ml离心管中。
6. 在4 °C下，使用摆动桶转子以320-330 × g离心3分钟。
7. 用5 ml不含抗生素的培养基重悬细胞沉淀。
8. 按照制造商说明，使用血球计数板在显微镜....

结果

在进行生物学/生物化学实验以研究BRCA2沉默对细胞功能的影响之前，第一步是通过平行使用乱序siRNA（非靶向siRNA）和BRCA2 siRNA来验证沉默的特异性（图1A）。为了获得高效的BRCA2沉默效果，使用高siRNA/转染试剂比例进行第二轮siRNA转染至关重要。事实上，仅进行一轮siRNA转染，或在第二轮中使用较低的siRNA/转染试剂比例（25 pmol siRNA和6 µl转染试剂），将导致基因敲低效率降低（图1B）。第二步是确定实现最高基因沉默水平所需的最短作用时间。根据细胞类型的不同，该时间通常在第二轮siRNA转染后24至48小时之间。例如，Nthy甲状腺细胞在24小时即可达到充分沉默，而PNT1A前列腺细胞则需要长达48小时才能实现有效的BRCA2基因敲低（图2A）。BRCA2的沉默效果在第二次转染周期后的7天内保持相对稳定（图2B）。值得注意的是，若将细胞裂解液在高于55 °C的温度下变性（如100 °C加.......

讨论

由于BRCA2基因的种系突变会增加多种癌症的发病风险，包括女性和男性乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌以及黑色素瘤^3,4，已有大量研究致力于阐明BRCA2蛋白的生物学功能。由于分析BRCA2这类巨大蛋白存在技术上的困难，大多数研究主要基于遗传学方法。本文所述的BRCA2蛋白表达沉默与分析方法，为在广泛的生物学实验中研究BRCA2肿瘤抑制基因的功能提供了一种高效工具。该沉默实验方案基于标准的siRNA转染流程，但包含若干关键性改进以及确保BRCA2基因稳定且高效敲低的操作要点。siRNA转染方案安全、快速且高效；与通常使用慢病毒载体的shRNA方法不同，该方法无需特殊的生物安全防护措施，可在任何具备细胞培养条件的实验室中轻松实施。同样，免疫印迹（immunoblotting）方案也经过优化，可高效检测BRCA2这类大分子量蛋白。该免疫印迹方案还已验证可用于检测在酵母细胞中异源表达的重组人BRCA2蛋白⁹。

本文报道了高效递送siRNA的若干重要影响因素。其中包括进行两轮转染，以及使用较高的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BRCA2 siRNA	Dharmacon	L-003462-00	SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
对照 siRNA	Dharmacon	D-001810-10-05	ON-TARGETplus 非靶向对照试剂池
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	Life Technologies	13778075	转染试剂
OPTI-MEM I 低血清培养基	Life Technologies	31985-070	转染实验用培养基
NuPAGE Tris-乙酸盐 3-8% 1.5 mm 预制胶	Life Technologies	EA0378	蛋白电泳用凝胶
NuPAGE LDS 上样缓冲液	Life Technologies	NP0007	蛋白电泳用试剂
NuPAGE 样品还原剂 (10x)	Life Technologies	NP0004	蛋白电泳用试剂
NuPAGE 抗氧化剂	Life Technologies	NP0005	蛋白电泳用试剂
HiMark 预染蛋白标准品	Life Technologies	LC5699	凝胶电泳预染标记物
XCell SureLoc Mini-Cell  电泳系统	Life Technologies	EI0002	蛋白电泳/转膜设备
NuPAGE Tris-乙酸盐 SDS 电泳缓冲液	Life Technologies	LA0041	Western 印迹试剂
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010	Western 印迹试剂
NuPAGE 转膜缓冲液	Life Technologies	NP0006-1	Western 印迹试剂
BRCA2 H-300 兔多克隆抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-8326	1:300 稀释
β-微管蛋白单克隆抗体	Sigma Aldrich	T4026-100UL	1:1,000 稀释
脱脂奶粉	Sigma Aldrich	70166	Western 印迹试剂
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379	Western 印迹试剂
SuperSignal West Pico/Femto 化学发光底物	Pierce Thermo Scientific	34080/34096	化学发光检测系统
PNT1A 细胞	SIGMA Aldrich (ECACC 提供)	95012614	PNT1A 人正常前列腺上皮细胞，经 SV40 永生化
Nthy 细胞	SIGMA Aldrich (ECACC 提供)	90011609	Nthy-ori 3-1 人甲状腺滤泡上皮细胞系
细胞增殖检测试剂盒 I (MTT)	Roche	11465007001	细胞增殖检测用试剂盒