同时 离体 通过双视网膜功能测试 体内 视网膜电图系统

摘要

离体视网膜电图（ex vivo ERG）可用于直接记录动物或人离体完整视网膜中视网膜细胞的电活动。本文展示了如何改造常用的活体视网膜电图（in vivo ERG）系统，以用于离体视网膜电图（ex vivo ERG）记录，从而解析视网膜细胞的电活动。

摘要

体内电视网膜图（ERG）信号由来自不同视网膜细胞类型的多个重叠成分以及眼外来源的噪声组成。离体ERG 提供了一种有效的方法，可直接从动物或供体眼球中完整分离的视网膜来解析视网膜细胞的功能。此外，离体ERG 还可用于测试潜在治疗药物在动物或人类视网膜组织上的有效性和安全性。本文展示了如何利用市售的体内ERG 系统对分离的小鼠视网膜进行离体ERG 记录。我们将标准体内系统的光照、电子和加热单元，与定制的样品支架、重力控制的灌流系统以及电磁噪声屏蔽装置相结合，利用市售体内系统配套的采集软件，同时对两个视网膜记录低噪声的离体ERG 信号。此外，我们还演示了如何将该方法与药理学处理相结合，通过去除特定的 ERG 成分来解析某些视网膜细胞类型的功能。

引言

视网膜电图（ERG）是一种成熟的技术，可用于记录由光刺激引发的视网膜电活动。ERG信号主要由视网膜电阻性细胞外空间中沿感光细胞和双极细胞轴向流动的径向电流所引起的电压变化产生。最早的ERG信号于1865年由Holmgren在鱼眼表面记录得到¹。Einthoven和Jolly在1908年²将光刺激开始时的ERG反应分为三个不同的波形，即a波、b波和c波，目前已知这些波形主要分别反映感光细胞、ON型双极细胞和色素上皮细胞的活动^3-8。ERG可在麻醉动物或人眼上记录（in vivo），也可在离体眼球制备⁹、离体完整视网膜（ex vivo）^3,10-15上记录，或使用微电极在特定视网膜层记录（局部ERG）^4,16。其中，in vivo ERG目前是评估视网膜功能最广泛使用的方法。它是一种非侵入性技术，可用于诊断目的，或用于追踪动物或患者视网膜疾病的进展。然而，in vivo ERG记录产生的信号复杂，包含多个重叠的成分，且常受到眼外生理噪声（例如，呼吸和心脏活动）的干扰。

局部视网膜电图可用于记录视网膜特定层次的信号，但与其他视网膜电图记录方式相比，其侵入性最强，信噪比（SNR）最低。此外，局部视网膜电图技术要求高，且需要昂贵的设备例如， 显微镜和显微操作仪）。来自完整离体视网膜的经视网膜ERG（离体 ERG）在两者之间提供了一种折衷方案 体内 以及局部ERG方法，可对动物或人类完整视网膜进行稳定且高信噪比的记录¹⁷最近，该方法已成功用于研究哺乳动物、灵长类动物及人类视网膜中视杆细胞和视锥细胞的光感受器功能^18-20此外，由于色素上皮的缺失 离体 视网膜，ERG 信号中的正向 c 波成分被消除，显现出显著的负性慢 PIII 成分 离体 记录。缓慢的PIII组分已被证实起源于视网膜中Müller胶质细胞的活动^21-23因此， 离体 ERG 方法也可用于研究完整视网膜中的 Müller 细胞。多项研究还表明 离体 ERG 记录可用于测量视网膜周围药物剂的浓度²⁴ 并测试药物的安全性和有效性^25-27.

目前已有多种商用的活体（in vivo）系统，被许多并不具备丰富电生理学背景的实验室广泛使用。相比之下，离体（ex vivo）设备直到最近才问世¹⁷，因此目前仅有极少数实验室正在利用这一强大技术。若能将离体（ex vivo）视网膜电图（ERG）记录技术推广至更多实验室，将有助于推动我们对视网膜生理学与病理学的认识，并促进致盲性疾病的新型疗法的开发。本文展示了一种简单且经济的离体（ex vivo）ERG装置¹⁷，并说明了如何将其与多种市售的活体（in vivo）ERG系统结合使用，以记录完整野生型小鼠视网膜中视杆细胞和视锥细胞介导的信号（a波和b波）以及穆勒细胞（Müller cells）的功能（慢PIII波）。

方案

所有实验方案均遵循《实验动物护理和使用指南》，并经华盛顿大学机构动物研究委员会批准。

1. 设置灌流系统和样本夹持器

1. 在实验当天新鲜配制用于视网膜灌流的溶液。使用蒸馏去离子水。可选用以下三种溶液之一：
   1. 配制含碳酸氢盐的Ames溶液（1 L）：1瓶Ames培养基和1.9 g NaHCO₃；
   2. 配制Locke溶液（单位：mM）：112.5 NaCl、3.6 KCl、2.4 MgCl₂、1.2 CaCl₂、10.0 HEPES、20.0 NaHCO₃、3.0 Na琥珀酸盐、0.5 Na谷氨酸盐、0.02 EDTA、10.0 葡萄糖，以及0.1% MEM维生素和氨基酸；
   3. 配制HEPES缓冲Ringer溶液（单位：mM）：133.3 NaCl、3.3 KCl、2.0 MgCl₂、1.0 CaCl₂、10.0 葡萄糖、0.01 EDTA、12.0 HEPES，用约5.8 ml的1 M NaOH将pH调节至7.5，并加入0.72 g/L Leibovitz L-15培养基。在任何灌流介质中，使用20–50 μM DL-AP4和50–100 μM BaCl₂以分离光感受器反应。
2. 配制电极溶液²⁸（单位：mM）：140.0 NaCl、3.6 KCl、2.4 MgCl₂、1.2 CaCl₂、3 HEPES、0.01 EDTA，用NaOH将pH调节至7.4–7.5。电极溶液可在室温下保存数月。
3. 准备并测试标本夹持器。
   1. 将黑色/灰色滤纸粘贴在标本夹持器底部部件的穹顶表面（见图1A）。在穹顶平坦顶部的边缘小心涂抹双组分5分钟环氧胶。如有必要，可在解剖显微镜下操作。
   2. 等待胶水接近干燥（约4分钟），然后使用平整物品将滤纸压在穹顶上。滤纸应在实验至少一天前粘贴完成。滤纸可多次使用，但在连续记录一个月后应予以更换。更换滤纸前，使用70%乙醇仔细清洁穹顶上的胶残留物。
   3. 将电极通道中充满电极溶液，尽量避免产生气泡，并将带有螺纹接头的颗粒电极旋入电极通道中（见图1A和图1B）。用四个螺丝连接夹持器的上部和下部部件，并用电极溶液填充灌流管路。
   4. 使用万用表测量每对电极引线之间的电阻和电压（图1B）。若通道无气泡且电极状态良好，则电阻应低于100 kΩ，电压应低于10 mV。
4. 将400–700 ml灌流液倒入玻璃瓶中。另取300 ml用于视网膜解剖，并将其存放在冰箱中。将灌流管路置于热交换块中，并将预热的热交换块放置在加热板上（见图1D）。
5. 使用带有CO₂/O₂气体接口（若使用Ames或Locke溶液）和灌流管路接口的瓶盖密封玻璃瓶（见图1D）。将装有灌流液的瓶子预热至37 ^oC，并将其置于加热板上，或置于设定为37–39 ^oC水浴的光刺激装置顶部¹⁷。
   1. 通过用灌流液填充管路以启动重力驱动流动，对灌流管路进行预充。
      1. 在LKC系统中，将瓶子放置在刺激器单元顶部¹⁷，以提供足够的重力流，随后通过流速调节器进行调节，从而在实验过程中不受瓶内灌流液液面下降的影响。
      2. 在Ocuscience系统中，将灌流瓶置于法拉第笼内以最小化噪声，并将来自标本夹持器的长灌流输出管路（见步骤2.8）放置在远低于标本夹持器（及灌流瓶）的位置，以增强溶液的重力驱动。对这些输出管路进行屏蔽，并将屏蔽层连接至放大器接地端，以防止电磁噪声耦合到ERG信号中。
6. 使用流速调节器将灌流速度调节至3–5 ml/min。从配有适当减压阀的气瓶中接入5% CO₂/95% O₂混合气体，并调节气体流速，使气体通过砂芯曝气头在瓶内持续稳定地鼓泡，以维持灌流液的气体平衡。

2. 样品制备

1. 组装洁净且锋利的解剖器械，包括直刃显微剪刀、一至两把45^o 镊子、刀片和一块矩形滤纸。
2. 在大型培养皿中倒入约 200 ml 冷灌注液，使标本架的整个底部（包括穹顶）均可浸入溶液中。此步骤在将视网膜安装到穹顶上时尤为重要（见步骤 2.6）。尽管某些溶液设计为用碳氧混合气（5% CO₂ + 95% O₂）饱和₂ / 95% O₂₂），这对解剖目的并非必需，因此在本文所述实验中未进行。
3. 在典型的实验中，将动物置于12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，并在记录前使其在黑暗中适应6–12小时。通过CO₂处死动物。₂ 在红光或红外光下进行吸入后颈椎脱位，并在红光或红外光下完成以下所有操作（使用 例如， 显微镜光源前的红色滤光片。
   1. 用镊子将眼睛取出并放入培养基中。每次将一只眼睛放在一小片纸上（例如， 使用普通滤纸并用镊子夹住眼球，在锯齿缘水平处剪开一个小口（此操作在溶液外进行）。
4. 沿锯齿缘（或更靠近眼球赤道部）用显微剪刀剪开，移除角膜和晶状体。将眼杯放入大培养皿的冷培养基中，并对另一只眼重复相同操作。
5. 从眼球杯顶部向视神经方向剪开一个小切口，操作时将剪刀置于视网膜与巩膜之间，以尽可能保持视网膜完整。用两把镊子分别夹住切口两侧的巩膜，向相反方向拉开镊子，以分离视网膜。
   1. 剪断视神经，并尽量减少对视网膜远端表面的物理接触以分离视网膜。在解剖过程中，RPE 大多会自动从视网膜上脱离。相较于快速完成解剖，避免对视网膜造成机械扰动更为重要；通常情况下，视网膜在溶液中孵育至少 30 min 对其反应特性无明显影响。
6. 将视网膜安装在样品架的穹顶上（图1C). 将标本夹的底部浸入含有已解剖视网膜的培养皿中。推动视网膜，使感光细胞侧（分离视网膜的凸面）向上滑过穹顶，然后提起标本夹，使视网膜附着在滤纸上。对另一侧视网膜重复此操作。
7. 小心干燥记录槽板，以防止视网膜之间发生电串扰以及噪声和信号分流。标本槽底部穹顶周围设有O型圈，可防止溶液在槽的上下部分之间溢出，并有助于实现各视网膜光感受器侧与神经节细胞侧的电隔离。使用四枚螺丝将槽的上部固定（参见 图1B）并使用注射器和针头将灌注液注入灌注通道中。
8. 将样本架移至换热块旁，并将灌注管路的输入端和输出端连接到样本架上（图1D）。将电极连接到ERG放大器（顶部电极连接至放大器的接地/负极插孔），并根据所使用的设备，通过适配器将刺激器/控制单元固定在样品架上，或将加热垫插入刺激器单元中 体内 使用ERG系统。

3. 记录

1. 使用 in vivo 系统的软件配置放大器和刺激参数。将采集频率设置为 1 至 10 kHz 之间的值，低通滤波设置为 300 Hz。不要使用高通滤波。如有必要，使用 60 Hz（或在欧洲使用 50 Hz）的陷波滤波器。
2. 在无光照刺激以及弱光刺激下记录基线（例如，-35 dB 或 0.3 mCd sm^-2 的绿光），以检测电极与视网膜样本之间的电连接是否良好。在开始数据采集前等待 10 – 20 分钟，使视网膜温度和功能达到稳定状态。
   1. 根据具体实验选择刺激参数并开始数据采集。例如，在记录暗视反应系列时，使用从 -40 到 0 dB 或从 0.1 到 1,000 mCd sm^-2 的绿光。在明视记录中，由于需要通过背景光（3 – 30 Cd m^-2）或探针闪光（约 1.3 Cd sm^-2 = 1 dB，见 图 3）抑制视杆细胞，应使用亮约 2 至 3 个对数单位的闪光。
   2. 然而，请注意，精确的光强数值可能在一定程度上依赖于系统的校准和实验条件。作为经验法则，当使用绿光时，与 in vivo 记录相比，光强应下调 5 至 10 倍¹⁷。可在视网膜上方使用带孔径的黑色遮盖物（商业适配系统中包含）以减少样本槽中的光散射，并促进商用 in vivo 系统的全视野球对双侧视网膜实现均匀且一致的刺激。
      注：对于暗适应视网膜的记录，典型实验中使用的测试闪光仅漂白极小部分感光色素，因此色素上皮（RPE）驱动的再生缺失不会造成影响。此外，已有研究表明，锥细胞色素的再生仍可在离体视网膜中通过 Müller 细胞视觉循环进行²⁰。
3. 由于实验通常持续 30 分钟至数小时，在实验过程中需监测基线漂移、噪声水平和反应稳定性，这些参数的变化可能提示存在技术问题。
   ​注：噪声增加或反应幅度降低可能提示灌流系统或电极通道中存在气泡、温度过低或过高、溶液泄漏/溢出或视网膜移位。

4. 清洁

1. 将标本架从灌流管线上拆下，打开后用滤纸冲洗视网膜。取下电极，并用蒸馏水冲洗（勿使用乙醇）。用乙醇和/或蒸馏水清洁标本架（包括灌流通道）。小心地用>70% 乙醇冲洗灌流管路。
2. 用蒸馏水冲洗灌流瓶（勿使用洗涤剂）。也可使用乙醇清洁灌流瓶。

结果

我们按照上述实验方案并参照图1所示方法，使用不同的标准灌流溶液（图2）记录了暗适应的野生型（WT）C57BL/6小鼠视网膜的闪光反应。在Ames’和Locke’s溶液中，视杆细胞光感受器的反应波形、动力学特征及敏感度表现相似（图2A和B）。然而，在HEPES缓冲的Ringer溶液（无碳酸氢盐或5% CO₂ / 95% O₂）条件下，反应幅度显著减小。我们还发现，在这些条件下b波的稳定性受到影响。加入40 μM APB（DL-AP4）可有效消除三种溶液中的正性b波（图2D-F）。去除b波后，暴露出一个大幅的慢负波（图2D），该波形被认为与Müller细胞活性相关²¹。加入100 μM氯化钡可消除该成分，从而揭示出ex vivo ERG信号中的光感受器反应（图2D-F）。在Ames’和Locke’s溶液中，我们可记录到高达1...

讨论

我们在此展示了获得高质量结果的关键步骤 离体 使用双分离小鼠视网膜同步记录ERG信号 体内 ERG 系统组件以及一个 离体 ERG 适配器。本研究中，我们使用同一种溶液（Ames’、Locke’s 或 Ringer 溶液）灌注动物的双眼视网膜，但也可选择用不同溶液分别灌注每侧视网膜。 例如， 用于药物测试。获得高质量数据的最重要步骤包括：屏蔽电磁噪声、仔细分离视网膜、使用先进的定制标本夹具实现稳定且相对较快的灌流，以及在所有样品制备过程中使用暗红色（或红外）光源。本文所述方法允许同时立即使用两只视网膜，并可实现双重用途 体内 ERG 检测设置与操作 在体内 和 离体 视网膜电图记录

我们近期设计的定制离体ERG标本夹持器¹⁷现已实现商业化，通过有效电学隔离视网膜的近端和远端部分，并优化视网膜上方的灌注液流（高溶液交换率），显著提高了信噪比。由于离体ERG信号中不存在低频噪声成分，即使是非常微弱的反应也...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体内 ERG 系统	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
体内 ERG 系统	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
离体 适配器	OcuScience	Ex VIVO ERG 适配器	www.ocuscience.us/id107.html
解剖显微镜	North Central Instruments	Leica M80	可使用任意品牌
红外发射器	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler 夜视镜	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	军用级产品
红色滤光片	Rosco Laboratories	Roscolux #27 中红	可替代红外系统使用
红色头灯	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
显微剪刀	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont #5 镊子	WPI, Inc.	14101
剃须刀片	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
天平	Metler Toledo	AB54-S/FACT	可使用任意品牌
pH 计及电极	Beckman Coulter	pHI 350	可使用任意品牌
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	可使用任意品牌
KCl	Sigma-Aldrich	60129	可使用任意品牌
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M 溶液
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M 溶液
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	可使用任意品牌
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	可使用任意品牌
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297	可使用任意品牌
Ames 培养基	Sigma-Aldrich	A1420	可使用任意品牌
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	可使用任意品牌
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	可使用任意品牌
琥珀酸二钠盐	Sigma-Aldrich	224731	可使用任意品牌
L-谷氨酸	Sigma-Aldrich	G2834	可使用任意品牌
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528	可使用任意品牌
Leibovitz L-15 培养基	Sigma-Aldrich	L4386	可使用任意品牌
MEM 维生素	Sigma-Aldrich	M6895
MEM 氨基酸	Sigma-Aldrich	M5550
碳酰气（Carbogen）	Airgas	UN3156	5% CO2