癌症的转移扩散是导致癌症相关死亡的主要原因。本文详细介绍了我们用于建立“类患者”原位同系小鼠模型系统的生存手术方法，该系统可用于研究实体器官肿瘤转移的机制。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
大多数癌症相关死亡是由癌症转移引起的，而非原发性肿瘤本身。然而，癌症转移的潜在机制仍不明确。动物模型对于阐明这些机制以及评估治疗转移性癌症的新策略至关重要。本文详细描述了一种用于研究实体器官肿瘤转移机制的“类患者”原位同系小鼠模型。具体方法是通过存活手术将 BNL 1ME A.7R.1 小鼠肝细胞癌细胞直接植入近交系野生型免疫功能健全的实验小鼠品系 BALB/c 的肝脏（即肿瘤起源器官）中。该方法的成功率和可重复性较高，推荐广泛用于阐明实体器官癌症转移的生物学机制。
引言
肝细胞癌（HCC）是最致命的癌症之一，预后差，生存期短。几乎所有与癌症相关的死亡都是由于疾病从原发器官转移至其他远处器官所致2-6。HCC的发展是一个复杂的过程。因此，能够在动物模型中模拟在转移性HCC中自然存在的肿瘤微环境，可能成为揭示人类相关机制的有效且有用的方法7。然而，癌症转移的机制在很大程度上仍不明确。因此，有必要建立动物模型，以帮助我们阐明HCC等癌症转移的潜在分子机制3,5。
小鼠模型系统是阐明机制和评估转移性人类癌症治疗新策略的非常有用的方法5,8。目前存在的各种小鼠模型系统充分证明了研究人员为准确再现该疾病复杂性所付出的努力5,8,9。
Ogunwobi 及其同事最近采用存活手术方法，成功建立了一种新型同源异位小鼠模型，用于肝细胞癌（HCC）转移的研究3。他们的研究构建了一种“类似患者”的小鼠模型，能够重现侵袭性及转移性肝细胞癌的特征3。他们进一步证明，该小鼠模型系统可用于循环肿瘤细胞生物学的研究，且有望为深入理解癌症转移机制提供新的见解3。
本文旨在详细描述建立这种“类患者”同基因原位小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的方法3。将介绍如何通过存活手术，将BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞直接植入近交系野生型免疫功能健全的BALB/c实验小鼠品系的肝脏（肿瘤起源器官）中3。与其他将人源肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠体内的异种移植肿瘤模型不同，该模型为同基因型，因此适用于研究免疫系统在肿瘤转移过程中的作用3,5,8。该方法有望被广泛应用于实体器官癌症转移机制的研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明
所有动物实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
注意：本实验共使用八只 BALB/c 小鼠。其中五只 BALB/c 小鼠被植入 5 × 106 个 BNL 1ME A.7R.1 小鼠肝细胞癌细胞以诱导原发性肿瘤形成。另外三只未进行细胞植入的 BALB/c 小鼠作为对照组。BNL 1ME A.7R.1 是一种小鼠肝细胞癌细胞系，由化学转化非致瘤性小鼠肝细胞系 BNL CL.2 获得。BNL 1ME A.7R.1 细胞系购自美国模式培养物集存库（ATCC）。
1. 术前准备
- 确保所有接受存活手术的小鼠健康。为确认小鼠健康状况，可通过皮肤牵拉试验检查脱水迹象。实验中不得使用任何有疾病或痛苦表现的小鼠。
- 称量小鼠体重，确保其未过轻。体重应至少达到16–20克。
- 每只小鼠准备5×106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌（HCC）细胞用于移植：
- 吸除BNL 1ME A.7R.1小鼠HCC细胞在10 ml 培养皿中（细胞融合度为60%–70%）的培养基。用5 ml PBS洗涤两次。向培养皿中加入2 ml 胰蛋白酶，并在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育5分钟。
- 随后，用移液器吸取10 µl消化后的细胞悬液，加入血细胞计数板，在显微镜10倍放大下进行细胞计数。计数四个大角方格中的总细胞数，乘以稀释倍数，再除以计数的方格数，最后乘以106，得到细胞浓度（个/ml）。
- 根据计算结果，将每只小鼠所需的500万个细胞收集至无菌的1.5 ml 微量离心管中。标记1.5 ml 微量离心管。
- 将5×106个BNL 1ME A.7R.1小鼠HCC细胞重悬于100 µl磷酸盐缓冲液（PBS）中。移植手术前，将细胞置于冰上保存。
- 进行小鼠术前准备操作（如麻醉诱导和毛发修剪）时，应远离无菌器械和材料，以避免污染。
- 通过异氟烷蒸发器吸入异氟烷诱导小鼠全身麻醉，同时以每分钟1 L 的恒定流速供给氧气（浓度约2.1%）。注：该系统为自给式，包含精密蒸发器、氧气供应装置以及与呼吸回路相连的活性炭罐，用于气体/麻醉剂的清除。
- 确保麻醉深度足够，以防止动物在手术过程中感到疼痛。通过脚趾夹捏试验观察动物是否无反应，以确认麻醉效果。
- 此时，切换阀门管线，密封至箱体，并打开至鼻罩。
- 一旦小鼠进入麻醉状态，立即在其角膜上涂抹少量眼用软膏，以预防干燥和损伤。
- 随后将动物转移至准备区域，正确放置并连接鼻罩（用于维持麻醉）。在该准备区域，对预定手术切口部位进行脱毛处理。
- 确保手术区域远离其他所有活动区域。
- 确保手术工作台稳固，并在术前进行适当消毒，保持清洁、无污染且无杂物。在其上方覆盖无菌布巾或无菌手术托盘。
- 仅允许实施手术的人员进入手术区域。确保手术室已使用适当的清洁剂清洗打扫，并喷洒合适的消毒剂。
- 应将手术区域置于远离门窗的位置，因为空气流动可能传播灰尘，导致手术部位污染。
- 使用无菌器械进行存活手术。可按照制造商建议将器械浸泡于消毒剂中，或进行高压灭菌。使用已准备就绪的基本无菌耗材。
- 按功能分类放置器械，以帮助防止无菌区域受到污染。
- 在切口部位（中线切口）周围约1英寸范围内剃毛，以便暴露动物肝脏。将去除的毛发远离手术区域处理。
- 剃毛后，使用含皂消毒剂（聚维酮碘外科 scrub）擦洗手术区域，并用无菌PBS溶液冲洗去除多余消毒剂。重复此操作数次，整个擦洗过程持续约5分钟。摘除并丢弃已使用的手套。
- 之后，更换防护服装，如手术衣、刷手服和口罩。接着使用适当的刷手液清洁双手，再佩戴外科手套。注：此步骤至关重要，可防止潜在污染物脱落并污染手术部位。
2. 手术
- 在整个麻醉期间提供外部热源以保持体温。由于麻醉会干扰体温调节，动物可能会出现一定程度的低体温，因此需维持其体温。
- 手术过程中始终将小鼠仰卧位放置。
- 使用外科胶带将小鼠的前肢、后肢和尾巴固定在手术台上。
- 在剑突下方立即做一条直线切口。
- 使用无菌自持式外科牵开器暴露肝脏。
- 用带有20G针头的注射器，缓慢而小心地将含有5×106个BNL 1ME A.7R.1小鼠HCC细胞的100 µl PBS注入肝脏右叶。
- 拔出针头后，用无菌棉签压迫至少1分钟 ，以防止因肝脏血管丰富可能引起的出血。
- 先用可吸收缝线缝合皮下组织，再用外科夹闭合皮肤。随后再次用聚维酮碘溶液清洗伤口。注意：这将确保手术切口的闭合。
- 皮下注射100 µl生理盐水。
3. 术后
- 手术后立即将小鼠转移到带有术后识别卡的清洁笼具中，以便饲养人员了解小鼠状况。提供食物和饮水。注意：根据我们的经验，刚接受手术的小鼠在术后最初24小时 内单独饲养，并提供湿润饲料和饮水，恢复效果最佳。
- 使用产生不超过38 ºC热量的加热灯为动物保温。使用温度计监测温度，直至小鼠完全恢复。
- 将动物饲养在笼具中，最好使用纸屑作为垫料，以确保其舒适。
- 初步恢复后，观察动物是否有不适、出血、疼痛或痛苦的迹象。给予丁丙诺啡（0.05–0.1 mg/kg）以缓解疼痛。密切监测其活动、行为、外观以及饮水和进食情况，持续约2小时。若小鼠能够自主活动，则将其转移回常规饲养区域，并在术后24小时 内每6–12小时 监测一次。如有需要，可进行体重检测。
- 然而，如果动物恢复过程中出现问题，应采取适当的辅助护理措施。若小鼠无法恢复，则应通过CO2窒息法配合颈椎脱位实施人道安乐死，并遵循机构批准的安乐死操作指南。
- 术后检查是否存在肝细胞癌（HCC）的临床证据，通常表现为体况评分显著下降。注意：此时肝脏中可能已形成原发性肿瘤，肺部也可能已出现转移灶。
- 此时，对实验中涉及的所有小鼠（包括实验组和对照组）实施人道安乐死。采用二氧化碳窒息法：在5–10分钟内缓慢向密闭室中释放二氧化碳，导致呼吸停止。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
将5×106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞植入Balb/c小鼠的肝脏中。术后63天可观察到肝细胞癌发展的临床证据。随后，对小鼠实施人道安乐死。对安乐死的小鼠进行剖检，切除肺和肝脏，并进行仔细的大体检查以识别肉眼可见的肿瘤。在一只小鼠中，观察到肝脏表面存在一个浅表性肿瘤，并部分与腹壁粘连（图1A）。在第二只小鼠中，观察到肝脏外观异常，该异常极似浅表性肿瘤（图1B）。如预期所示，未植入BNL 1ME A.7R.1肝细胞癌细胞的对照组小鼠未出现任何肿瘤，这一点由对照小鼠的肝脏（图1D）和肺（图1E）所证实。此外，携带肿瘤的小鼠肺部也呈现一定程度的异常，可见出血性坏死区域（图1C）。根据以往经验，这些肺组织可能含有转移性病灶3。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文深入描述了Ogunwobi及其同事近期报道的一种成功建立肝细胞癌（HCC）转移的原位同系小鼠模型的方法（图2）3。该操作的成瘤率通常较高。我们此前观察到的成瘤率可达100%3。然而，成瘤率可能因操作者的熟练程度而有所差异。在最近一次由一名正在接受培训的新入学研究生开展的实验中，成瘤率低至40%。尽管大多数实验因小鼠体况评分下降而在4至6周时终止，但根据我们将相同细胞皮下接种至同品系小鼠的经验，我们认为原发性肿瘤可能在2至3周内即已形成。在成功的实验中，我们通常预期观察到一个肿瘤结节。虽然我们预计肺转移在4至6周之间出现，但肝脏内的肿瘤发生可能要早得多。
良好的外科技术和无菌条件对于该存活手术方法的成功至关重要。用于存活手术的小鼠应健康状况良好。建议在手术前后对小鼠进行称重。在我们最近的实验中，小鼠术前平均体重为18克，实验终点时（术后植入63天）平均体重仅为22克。在此期间体重仅增加4克，可能是由于肿瘤引起的全身性疾病导致体重增长有所下降。若在实验过程中每周称重一次或两次，将能对此情况进行更客观的评估...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Pascal DuBois对本文的校对。作者还感谢纽约市立大学亨特学院动物实验中心的工作人员。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）RCMI基金对亨特学院的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型解剖镊子 | Roboz | (RS-5040) | 尖端尺寸 0.20 × 0.12 mm |
| 格拉费微型解剖钳，带锯齿弯头 | Roboz | (RS-5111) | 1×2 齿，弯头宽度 0.6 mm |
| 微型解剖牵开器—Agricola 型（3×3 齿） | Roboz | (RS-6501) | 钝头，3×3 齿，深度 4 mm，展开宽度 25 mm |
| 微型解剖牵开器—Goldstein 型（3×3 齿） | Roboz | (RS-6503) | 钝头，3×3 齿，深度 4 mm，展开宽度 19 mm |
| 詹姆斯卡尺（用于测量肿瘤） | Roboz | (RS-6466) | 80 mm / 3 英寸刻度，镀铬 |
| 微型解剖剪，大环直剪，锋利刃口 | Roboz | (RS-5852) | 刀片长 23 mm，总长 4 英寸，扁平柄身，大环手柄 |
| 带刀片的手术刀，适用于精细解剖操作 | Roboz | (RS-9861-36) | |
| 手术刀柄 | Roboz | (RS-9884) | 实心结构 |
| Littauer 缝线剪 | Roboz | (RS-7074) | 长度 4.5 英寸 |
| Brown 缝合针持，便于打结 | Roboz | (RS-7960) | 凸面钳口，精细锯齿 |
| Reflex 7 mm 伤口夹及 Reflex 7 夹施加器 | Roboz | (RS-9262) | 安全、可靠的伤口闭合替代方法 |
| 器械托盘及盖子 | Roboz | RT-1350S | |
| 迷你剃毛器，带可拆卸刀头 | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500（即 Germ Terminator）干式灭菌器 | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | 用于微型解剖器械的快速去污。 器械可在 15 秒内完成去污。 |
| 显微注射针 | VWR | BD305125 | 25G 针头 |
参考文献
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765(2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
