循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。
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本文内容
摘要
摘要
癌症转移是导致癌症相关死亡的首要原因。近期研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中具有重要作用。事实上，CTCs的数量与肿瘤大小相关。本文详细描述了一种从同源小鼠肝细胞癌（HCC）模型中分离和扩增CTCs的方法，该方法可用于后续分析实体器官肿瘤转移中潜在的重要分子机制。该方法高效且可重复，是一种非侵入性技术，因此有望替代可能伴随并发症的人体组织侵入性活检。因此，本文所述方法能够从全血样本中分离和扩增CTCs，以便对其进行检测和表征。该技术未来有望被改进并应用于临床，例如用于诊断和个体化靶向治疗。
引言
自1869年Thomas Ashworth首次观察到循环肿瘤细胞（CTCs）以来，癌症研究领域已知这类细胞的存在1。此后研究表明，CTCs在肿瘤转移和疾病进展中具有重要作用2-5。如今，实体瘤是全球发病率和死亡率的主要原因。CTCs是一类稀有细胞，起源于原发性肿瘤，通过血液系统迁移至不同器官，但仅有极小部分最终形成转移灶2-5。值得注意的是，肿瘤大小与CTC数量之间存在正相关关系3,4。
对循环肿瘤细胞（CTC）生物学的理解有助于寻找靶向治疗策略。此外，CTCs 可能具有诊断应用价值。为了实现这些潜在的临床应用，需要克服当前研究 CTCs 所面临的一些挑战。其中一个挑战与 CTCs 可能以单个细胞或细胞簇的形式存在，并且可能能够根据血液微环境的变化改变其表型有关2。此外，检测 CTCs 非常困难，部分原因在于血液中 CTCs 的数量极少（每毫升数个至数百个），而每毫升血液中却含有约十亿个血细胞6。尽管如此，近年来针对实体器官肿瘤来源的 CTCs 潜在临床应用的研究已显著加强。
尽管做出了这些努力，由于循环肿瘤细胞（CTCs）极为稀少以及现有技术工具的不足，研究和理解CTCs作用的挑战依然存在。尽管面临这些挑战，CTCs在癌症转移研究中的巨大临床应用潜力仍激励着人们持续推进相关研究。
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方案
伦理声明：所有动物实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 实验前准备步骤
- 到达动物房后，最初将3只BALB/c小鼠饲养于带滤帽和木屑垫料的笼子中。确保小鼠可自由获取食物（Purina啮齿类动物饲料）和饮水。垫料和食物应每周更换两次，笼子应每周清洗一次。
- 使用异氟烷蒸发器联合氧气以每分钟1升的恒定流速对小鼠实施全身麻醉。该系统为自给式，包含一个精密蒸发器。
- 将动物置于一个塑料箱内，该箱连接有精密蒸发器及气体/麻醉系统。初始时将蒸发器设定为2.5，待动物失去意识后，将蒸发器调低至2。
- 此时切换阀门管路，将其密封至箱体，并打开通向鼻罩的通路。
- 将动物转移至准备区域，正确放置并连接鼻罩（用于维持麻醉）。
- 每只小鼠准备5 × 106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞用于移植。BNL 1ME A.7R.1细胞应在培养基（含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）中生长，置于37 °C、含空气和5% CO2的加湿培养箱内的细胞培养皿中孵育。
- 使用带有20 G针头的注射器，将含有5 × 106个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞的100 µl PBS注入BALB/c小鼠肝脏的一个叶中，以生成原发性肿....
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结果
本文所述方法已证明可成功分离循环肿瘤细胞（CTCs）。在实验终点，小鼠被实施人道安乐死，过程包括二氧化碳窒息、心脏穿刺放血以及颈椎脱位。该操作的关键步骤示意图见图2。通过心脏穿刺获取的全血样本采用上述方案进行处理。随后，通过离心分离获得白膜层，并对其进行红细胞裂解。接着再次离心以收集白色沉淀，该沉淀用PBS洗涤后重悬于完全细胞培养基中，用于细胞培养扩增。可能出现的一个问题是所获得的沉淀颜色不够清晰。此问题可通过延长红细胞裂解缓冲液的孵育时间至10–15分钟，或重复裂解步骤来轻松解决。在图1中展示了来自三只不同小鼠的CTCs在培养中扩增的代表性图像，并与BNL 1ME A.7R.1细胞进行了对比。快速增殖能力和细胞形态有助于判断接种的细胞是否为CTCs。然而，仍需通过第5.1–5.2步中所述的PCR和免疫染色等验证技术来确认是否成功建立可存活的CTC细胞系。
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讨论
本研究描述了如何从肝细胞癌同系小鼠的全血中分离和扩增循环肿瘤细胞。本工作的目的是促进对癌症转移机制的持续研究。
导致多种癌症预后不良的一个因素是未能及时检测，从而导致恶性肿瘤广泛播散3。循环肿瘤细胞（CTCs）起源于原发性肿瘤，通过血液扩散至远端器官。因此，CTCs在癌症转移过程中具有重要作用，并具有多种临床应用潜力，例如可用于癌症诊断3,9,10。多项临床研究数据支持这一观点，表明CTCs与多种癌症（如胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等）的疾病进展具有强相关性3,11,12。尽管CTCs在癌症诊断中可能具有重要价值，但由于其在数十亿血细胞中数量极少，分离和表征CTCs仍面临巨大挑战3,7。
使用我们的技术分离CTCs的意义在于，它提供了一个可重复的模型，可针对临床应用潜力进行优化。这最终可能使该方法有望替代目前更具侵入性且伴随副作用的活检操作。3,13外周静脉采血等对该方法的改进有望使其在临床环境中得到应用。当然，应当认识到.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
奥贡沃比博士实验室的工作得到了美国国立卫生研究院少数族裔健康与健康差异研究所（国家少数族裔机构研究中心项目资助号 MD007599）的资助。本手稿的内容完全由作者负责，不一定代表NIMHD或NIH的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肝素钠盐 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX 管 Micro 1.5 ml 透明无菌 | VWR | 89511-254 | 1.5 ml 无热原 Eppendorf 管 |
| BD 25 G × 1 英寸无菌针头 | VWR | BD305125 | 25 G 针头 |
| Slp Tip SRNG 1 ml，每包200个 | VWR | BD309659 | 1 ml 注射器吸头 |
| 1 ml 鲁尔锁注射器，Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml 注射器 |
| VWR 组织镊 6 | VWR | 82027-446 | 镊子 |
| Cyromold 中号 15 x 15 x 5 mm，100 个/包 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct 化合物 4 盎司 | VWR | 25608-930 | 辛化合物 |
| VWR 载玻片 25 x 75 mm，每包72片 | VWR | 48311-703 | 载玻片 |
| VWR 盖玻片 #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | 盖玻片 |
| VWR 载玻片盒 True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | 载玻片盒 |
| Super HT PAP笔 | VWR | 89427-058 | PAP笔 |
| 无RNase和DNase的水，2 L | VWR | 101454-204 | 无核酸酶水 |
| Tris缓冲液超纯级500 g | VWR | 97061-796 | Tris 缓冲液 |
| 氯化铵 ACS 级 2，5 千克 | VWR | 97062-048 | 氯化铵缓冲液 |
| Falcon 组织培养皿 60 x 15 mm 聚苯乙烯材质 | VWR | 353002 | 组织培养皿 |
| Clorox 杀菌漂白剂，常规型 | VWR | 89501-620 | Clorox 漂白剂 |
| 不含钙的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） &和镁（500 ml） | 赛默飞世尔科技 | 21-040-CV | PBS，1× |
| DMEM，1倍浓度 含4.5 g/L葡萄糖 &L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠 | 赛默飞世尔科技 | 10-017-CV | 用于BNL 1ME A.7R.1细胞的DMEM 1x培养基 |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 35-010-CV | FBS |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 30-002-Cl | 青霉素-链霉素 |
| Sorvall Biofuge pico | 赛默飞世尔科技 | 75002411 | 13,000 rpm 离心机 |
参考文献
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: W....
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