从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。

摘要

癌症转移是导致癌症相关死亡的首要原因。近期研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中具有重要作用。事实上，CTCs的数量与肿瘤大小相关。本文详细描述了一种从同源小鼠肝细胞癌（HCC）模型中分离和扩增CTCs的方法，该方法可用于后续分析实体器官肿瘤转移中潜在的重要分子机制。该方法高效且可重复，是一种非侵入性技术，因此有望替代可能伴随并发症的人体组织侵入性活检。因此，本文所述方法能够从全血样本中分离和扩增CTCs，以便对其进行检测和表征。该技术未来有望被改进并应用于临床，例如用于诊断和个体化靶向治疗。

引言

自1869年Thomas Ashworth首次观察到循环肿瘤细胞（CTCs）以来，癌症研究领域已知这类细胞的存在¹。此后研究表明，CTCs在肿瘤转移和疾病进展中具有重要作用^2-5。如今，实体瘤是全球发病率和死亡率的主要原因。CTCs是一类稀有细胞，起源于原发性肿瘤，通过血液系统迁移至不同器官，但仅有极小部分最终形成转移灶^2-5。值得注意的是，肿瘤大小与CTC数量之间存在正相关关系^3,4。

对循环肿瘤细胞（CTC）生物学的理解有助于寻找靶向治疗策略。此外，CTCs 可能具有诊断应用价值。为了实现这些潜在的临床应用，需要克服当前研究 CTCs 所面临的一些挑战。其中一个挑战与 CTCs 可能以单个细胞或细胞簇的形式存在，并且可能能够根据血液微环境的变化改变其表型有关²。此外，检测 CTCs 非常困难，部分原因在于血液中 CTCs 的数量极少（每毫升数个至数百个），而每毫升血液中却含有约十亿个血细胞⁶。尽管如此，近年来针对实体器官肿瘤来源的 CTCs 潜在临床应用的研究已显著加强。

尽管做出了这些努力，由于循环肿瘤细胞（CTCs）极为稀少以及现有技术工具的不足，研究和理解CTCs作用的挑战依然存在。尽管面临这些挑战，CTCs在癌症转移研究中的巨大临床应用潜力仍激励着人们持续推进相关研究。

我们最近成功地从肝细胞癌（HCC）转移的原位同系小鼠模型中分离出循环肿瘤细胞（CTCs），并在细胞培养中实现了其扩增。⁵本文的目的是详细描述该成功方法学的各个方面。此方法学的意义在于，该方法可经过适当修改，成功地分离并在体外培养中扩增人源循环肿瘤细胞（CTCs），从而提高实现这一目标的可能性 体外 循环肿瘤细胞生物学研究。

循环肿瘤细胞（CTCs）具有多种潜在的临床应用价值。CTCs 可能可用于预后评估、治疗反应监测、筛查、肿瘤分子改变的动态监测以及个体化治疗⁴。因此，深入理解 CTCs 的生物学特性有望在临床上产生重大影响。

方案

伦理声明：所有动物实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

1. 实验前准备步骤

1. 到达动物房后，最初将3只BALB/c小鼠饲养于带滤帽和木屑垫料的笼子中。确保小鼠可自由获取食物（Purina啮齿类动物饲料）和饮水。垫料和食物应每周更换两次，笼子应每周清洗一次。
2. 使用异氟烷蒸发器联合氧气以每分钟1升的恒定流速对小鼠实施全身麻醉。该系统为自给式，包含一个精密蒸发器。
3. 将动物置于一个塑料箱内，该箱连接有精密蒸发器及气体/麻醉系统。初始时将蒸发器设定为2.5，待动物失去意识后，将蒸发器调低至2。
4. 此时切换阀门管路，将其密封至箱体，并打开通向鼻罩的通路。
5. 将动物转移至准备区域，正确放置并连接鼻罩（用于维持麻醉）。
6. 每只小鼠准备5 × 10⁶个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞用于移植。BNL 1ME A.7R.1细胞应在培养基（含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）中生长，置于37 °C、含空气和5% CO₂的加湿培养箱内的细胞培养皿中孵育。
7. 使用带有20 G针头的注射器，将含有5 × 10⁶个BNL 1ME A.7R.1小鼠肝细胞癌细胞的100 µl PBS注入BALB/c小鼠肝脏的一个叶中，以生成原发性肿瘤。移植后，将BALB/c小鼠饲养于笼中，饲养条件与移植前相同。
8. 在实验终点时，肝细胞癌的临床证据表现为体况评分显著下降（通常在4周后可检测到）。此时，肝脏中很可能已形成原发性肿瘤，同时肺部已出现转移灶。随后，开始循环肿瘤细胞的分离与扩增操作。

2. 循环肿瘤细胞分离用全血采集

注意：应正确消毒手术区域，并确保该区域无杂物。根据制造商的建议，对所有手术器械进行高压灭菌或浸泡在消毒剂中。

1. 在实验终点（出现肿瘤发育的临床证据）时，通过人道安乐死方法处死小鼠。小鼠的安乐死应采用 CO₂ 窒息法。需仔细观察小鼠，确认麻醉已充分起效。将二氧化碳缓慢通入密闭容器中，持续时间为 5 - 10 分钟，以引起呼吸停止。随后进行心脏穿刺放血及颈椎脱位。⁵
2. 使用连接 1 ml 注射器的 25 G 针头采集全血。用 0.01 ml 肝素对注射器进行肝素化处理。将针头以约 45° 角立即穿刺剑突下方的皮肤。缓慢推进针头以穿刺心脏，随后降低针头角度。稳定保持针头和注射器的位置，从心脏中抽出 500 µl - 1,000 µl 全血。
3. 取下注射器和针头，将血液转移至预先标记的无热原 1.5 ml 离心管中。将采集的全血在 1,167 × g 条件下离心 5 分钟。
   注意：离心后全血样本分为三层：底部为红细胞压积层（红细胞层），中间为薄层的白膜层（buffy coat），顶部为血浆层。
4. 小心用移液器吸取上层血浆，转移至另一无热原 1.5 ml 离心管中，用于后续实验，如无细胞核酸的检测⁷。
5. 为分离循环肿瘤细胞（CTCs），将白膜层收集至另一无热原 1.5 ml 离心管中，用于红细胞（RBC）裂解前的准备。此步骤旨在去除白膜层中残留的红细胞。

3. 红细胞（RBC）裂解缓冲液配方

1. 配制1 L红细胞裂解缓冲液。
2. 分别配制500 ml氯化铵溶液和500 ml三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液，然后混合，得到1 L终浓度为155 mM氯化铵和10 mM Tris的红细胞裂解缓冲液。
3. 将缓冲液调节至pH 7.5。红细胞裂解缓冲液储存于+2至+8 °C，使用前立即恢复至室温。

4. 白膜层红细胞裂解

1. 向含有采集的血沉棕黄层的无菌无热原1.5 ml离心管中加入1 ml红细胞裂解缓冲液。
2. 通过反复倒置混匀管内液体。将混匀后的液体在室温下静置孵育5分钟。随后以1,167 × g离心5分钟。
3. 离心后可见白色沉淀。缓慢且小心地将红色上清液弃入10%次氯酸钠溶液中，避免扰动沉淀。若沉淀不呈白色，则需重复步骤3.1–3.5。适当延长红细胞裂解缓冲液中的孵育时间至10–15分钟可能有助于改善结果。
4. 在生物废弃物经10%次氯酸钠溶液处理24小时完成去污后，安全处置生物废弃物。

5. 细胞培养中的传代

注意：肿瘤细胞通常是快速生长的细胞，而白细胞在接种到培养皿中的原始细胞混合物中含量丰富。经过多次更换培养基以及循环肿瘤细胞（CTCs）的连续传代后，所有白细胞均被去除，仅留下相对纯净的CTCs群体。

1. 将上清液弃入10%次氯酸钠溶液后，用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）至少洗涤白色沉淀一次，并将沉淀重悬于完全培养基中，用于细胞培养传代。
2. 洗涤完成后，向沉淀中加入1 ml完全BNL 1ME A.7R.1培养基（含10%热灭活FBS、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺），并将沉淀在培养基中充分重悬。
3. 将重悬的细胞混合液接种至细胞培养皿中。将培养皿置于37 °C、含空气和5% CO₂的加湿培养箱中孵育。
4. 每两到三天更换一次细胞培养基。五至七天后，循环肿瘤细胞（CTCs）将贴附于培养皿表面并开始增殖。这些细胞在连续传代超过25代以及经历多次冻融循环后仍可保持活性⁵。

6. 肝细胞癌循环肿瘤细胞系的验证

1. 采用基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，仅扩增小鼠β-珠蛋白基因的一个特异性DNA片段，以确认新建立的CTC细胞系与最初植入的BNL 1ME A.7R.1 HCC细胞系一样均为小鼠细胞。该方法最初由Steube et al.^5,8描述并验证。
2. 使用特异性抗体对肝细胞特异性标志物cAMP应答元件结合蛋白3样3（CREB3L3）进行免疫染色。该检测可确认新建立的CTC细胞确实为肝细胞，与最初植入的BNL 1ME A.7R.1细胞系一致。⁵

结果

本文所述方法已证明可成功分离循环肿瘤细胞（CTCs）。在实验终点，小鼠被实施人道安乐死，过程包括二氧化碳窒息、心脏穿刺放血以及颈椎脱位。该操作的关键步骤示意图见图2。通过心脏穿刺获取的全血样本采用上述方案进行处理。随后，通过离心分离获得白膜层，并对其进行红细胞裂解。接着再次离心以收集白色沉淀，该沉淀用PBS洗涤后重悬于完全细胞培养基中，用于细胞培养扩增。可能出现的一个问题是所获得的沉淀颜色不够清晰。此问题可通过延长红细胞裂解缓冲液的孵育时间至10–15分钟，或重复裂解步骤来轻松解决。在图1中展示了来自三只不同小鼠的CTCs在培养中扩增的代表性图像，并与BNL 1ME A.7R.1细胞进行了对比。快速增殖能力和细胞形态有助于判断接种的细胞是否为CTCs。然而，仍需通过第5.1–5.2步中所述的PCR和免疫染色等验证技术来确认是否成功建立可存活的CTC细胞系。

讨论

本研究描述了如何从肝细胞癌同系小鼠的全血中分离和扩增循环肿瘤细胞。本工作的目的是促进对癌症转移机制的持续研究。

导致多种癌症预后不良的一个因素是未能及时检测，从而导致恶性肿瘤广泛播散³。循环肿瘤细胞（CTCs）起源于原发性肿瘤，通过血液扩散至远端器官。因此，CTCs在癌症转移过程中具有重要作用，并具有多种临床应用潜力，例如可用于癌症诊断^3,9,10。多项临床研究数据支持这一观点，表明CTCs与多种癌症（如胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等）的疾病进展具有强相关性^3,11,12。尽管CTCs在癌症诊断中可能具有重要价值，但由于其在数十亿血细胞中数量极少，分离和表征CTCs仍面临巨大挑战^3,7。

使用我们的技术分离CTCs的意义在于，它提供了一个可重复的模型，可针对临床应用潜力进行优化。这最终可能使该方法有望替代目前更具侵入性且伴随副作用的活检操作。^3,13外周静脉采血等对该方法的改进有望使其在临床环境中得到应用。当然，应当认识到...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝素钠盐 1 g	VWR	89508-852
BTX 管 Micro 1.5 ml 透明无菌	VWR	89511-254	1.5 ml  无热原 Eppendorf 管
BD 25 G × 1 英寸无菌针头	VWR	BD305125	25 G 针头
Slp Tip SRNG 1 ml，每包200个	VWR	BD309659	1 ml 注射器吸头
1 ml 鲁尔锁注射器，Pk 100	VWR	BD309628	1 ml 注射器
VWR 组织镊 6	VWR	82027-446	镊子
Cyromold 中号 15 x 15 x 5 mm，100 个/包	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct 化合物 4 盎司	VWR	25608-930	辛化合物
VWR 载玻片 25 x 75 mm，每包72片	VWR	48311-703	载玻片
VWR 盖玻片 #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	盖玻片
VWR 载玻片盒 True North Fm Pu	VWR	89140-278	载玻片盒
Super HT PAP笔	VWR	89427-058	PAP笔
无RNase和DNase的水，2 L	VWR	101454-204	无核酸酶水
Tris缓冲液超纯级500 g	VWR	97061-796	Tris 缓冲液
氯化铵 ACS 级 2，5 千克	VWR	97062-048	氯化铵缓冲液
Falcon 组织培养皿 60 x 15 mm 聚苯乙烯材质	VWR	353002	组织培养皿
Clorox 杀菌漂白剂，常规型	VWR	89501-620	Clorox 漂白剂
不含钙的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） &和镁（500 ml）	赛默飞世尔科技	21-040-CV	PBS，1×
DMEM，1倍浓度  含4.5 g/L葡萄糖 &L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	10-017-CV	用于BNL 1ME A.7R.1细胞的DMEM 1x培养基
胎牛血清	赛默飞世尔科技	35-010-CV	FBS
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液	赛默飞世尔科技	30-002-Cl	青霉素-链霉素
Sorvall Biofuge pico	赛默飞世尔科技	75002411	13,000 rpm 离心机