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方法文章

从人类母胎界面分离白细胞

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DOI：

10.3791/52863

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2015年5月21日

 ,  ,  ,  , 
1Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Michigan, 3Department of Epidemiology and Biostatistics, Michigan State University, 4Department of Molecular Obstetrics and Genetics, Wayne State University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 6Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离并进一步研究人母胎界面——即底蜕膜和壁蜕膜中浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，已通过流式细胞术分析验证可用于后续实验应用。

摘要

妊娠的特征是白细胞浸润生殖组织以及母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）。该界面是母体与胎儿组织之间的解剖学接触部位，因此在妊娠期间构成一个免疫学作用位点。母胎界面处浸润的白细胞在胚胎着床、妊娠维持以及分娩时机的调控中发挥核心作用。因此，对这些白细胞进行表型和功能特征分析，将有助于揭示导致 妊娠相关疾病。已有多种方案用于从底蜕膜和壁蜕膜中分离浸润性白细胞；然而，由于所用试剂、酶类及孵育时间缺乏一致性，导致这些结果难以相互比较。本文所述为 一种结合温和的机械分离与酶解离技术的新方法，用于保护从母胎界面人体组织中分离的白细胞的胞外和胞内标志物的活性与完整性。除免疫表型分析、细胞培养和细胞分选外，本方案未来还可应用于多种不同研究。按照本方案操作后，所分离的白细胞可用于检测DNA甲基化、目的基因表达水平 体外 白细胞功能即吞噬作用、细胞毒性、T细胞增殖和可塑性 等等。），以及母胎界面活性氧物质的产生。此外，通过采用所述实验方案，本实验室已能够鉴定出母胎界面新的罕见白细胞。

引言

妊娠  其特征是三个不同的免疫学阶段：1）与促炎反应相关的植入和早期胎盘形成即，植入过程类似于“开放性伤口”；2）妊娠中期及大部分妊娠晚期，母胎界面以抗炎状态为主，实现免疫稳态；3）分娩期，表现为促炎状态1-7免疫细胞在母胎界面炎症反应的调控中发挥重要作用，其数量和定位在妊娠过程中发生动态变化6-9.

在人类中，母胎界面是母体组织（蜕膜）与胎儿组织（绒毛膜或滋养层）直接接触的区域。该界面包括：1）壁蜕膜，其衬于子宫腔内未被胎盘覆盖的区域，并与平滑绒毛膜相邻；以及2）底蜕膜，位于胎盘的基底板处，在此被间质滋养层细胞侵入。10 (图1这些接触区域的紧密性为胎儿抗原向母体免疫系统的暴露创造了条件11-13毫不奇怪，白细胞可占蜕膜细胞的30-40%8,9,14,15 除了典型的间质样细胞和腺细胞外8,14,16. 白细胞在母-胎界面的作用涉及多种过程，包括限制滋养层细胞的侵袭17，螺旋动脉重塑18,19母体耐受的维持12,20，以及分娩的启动21-26适应性免疫和固有免疫系统的白细胞， 即，已在蜕膜组织中鉴定出T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞，其比例和活化状态在妊娠过程中呈现时空动态变化6-10,12,14,24,27-30白细胞群体和/或功能的紊乱与 自然流产31子痫前期32宫内生长受限32,33，以及早产7,24因此，研究人类母胎界面处白细胞的表型特征及其功能，将有助于阐明妊娠相关疾病中免疫通路的失调机制。

用于确定白细胞表型和功能特性的最强大工具之一是流式细胞术，该技术可同时对多个参数进行定量分析34-36。通过流式细胞术分析白细胞时，需要将白细胞分离成单细胞悬液。因此，研究白细胞表型和功能特性需要一种从母胎界面分离浸润性白细胞的方法。

已有多种方法用于分离人母胎界面的白细胞10,14,25,27,37-39。部分方法采用机械解离10,25,27,38，而另一些则使用酶消化法37,40进行组织解离。由于机械解离获得的细胞得率较低且细胞活力下降41，而酶解解离可能影响细胞活力及细胞表面标志物的保留42，因此本文所述方法结合了温和的机械解离与酶预处理，以提高分离白细胞的得率，同时不损害 细胞活力。类似的方法组合已被证明在从母胎界面的蜕膜组织中分离白细胞时具有高效性39。因此，本文所述方案采用自动组织解离仪进行机械解离，与传统的 opposing 手术刀片、剃刀刀片或手术剪切碎组织相比，可提高操作的一致性并节省时间和人力10,28。用于组织解离的酶选用的是 Accutase。与常用的胶原酶43、中性蛋白酶44和胰蛋白酶45不同，Accutase（一种细胞解离溶液）兼具广谱蛋白酶和胶原酶活性，有助于实现高效而温和的组织解离46,47。解离后，通过密度梯度离心法从蜕膜细胞总群中富集白细胞。此前已使用过多种密度梯度介质，其中最常见的是 Percoll（胶体二氧化硅颗粒悬浮液）48和 Ficoll（一种高分子合成的蔗糖聚合物）49。先前研究已证实蔗糖聚合物在分离效率上的优越性50，而本文所述方案进一步证明该密度梯度介质可获得足够高的单个核白细胞纯度。

因此，本文所述方案结合了机械法组织解离与自动组织解离仪、酶消化法与细胞解离液，以及密度梯度介质（1.077 ± 0.001 g/ml）进行白细胞分离，以从人蜕膜组织中分离白细胞。该方案已被证实可有效保持细胞表面抗原的完整性，同时维持细胞活力。所获得的白细胞可用于多种应用，包括流式细胞术免疫表型分析及功能研究 体外.

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方案

该方案适用于从底蜕膜和壁蜕膜中分离白细胞，以进行流式细胞术免疫表型分析。此外，分离的细胞还可用于细胞分选、细胞培养、RNA提取和细胞学分析。在处理本方案中提及的样本前，必须获得当地研究伦理委员会和机构审查委员会的人类伦理批准。本研究中人类样本的采集和使用已获以下机构审查委员会批准： 尤妮斯·肯尼迪·施赖弗 美国卫生与公共服务部（DHHS，贝塞斯达，马里兰州，美国）国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD），美国国立卫生研究院（NIH）及韦恩州立大学（底特律，密歇根州，美国）。在采集组织样本前，已从所有孕妇处获得书面知情同意。
注意：在处理本方案中提及的动物血液、细胞或有害试剂时，必须遵守适当的生物安全和实验室安全措施。

1. 人蜕膜组织的解剖

注意：底板位于胎盘下方并与之相连，代表母体表面。绒毛膜羊膜包括羊膜和绒毛膜。底板包含底蜕膜，而绒毛膜包含壁蜕膜（图1）。

  1. 基底蜕膜
    1. 从胎盘的一个绒毛叶中解剖出一块基底板（图 1A 和 图 1B）。
    2. 将其放置在无菌切割板上，使胎盘绒毛朝上。显示胎盘绒毛的一侧通常呈血红色，外观呈毛发状组织；基底板则表面光滑，颜色呈淡红色。
    3. 使用锋利的精细剪刀和镊子去除绒毛组织和血管。操作过程中保持组织浸没在1×PBS（不含Ca2+和Mg2+）中（图 1C）。收集2至3块此类组织，并用1×PBS彻底冲洗以去除血液（图 1D）。
  2. 壁蜕膜
    1. 解剖一块羊膜绒毛膜（约10 cm × 10 cm，图 1E），将其放置在切割板上，使绒毛膜面朝上。绒毛膜侧含有血凝块，通常呈淡黄色。
    2. 使用精细镊子尽可能去除大部分血凝块（图 1E）。用无菌1×PBS冲洗膜组织，清除多余血液，直至1×PBS流出液变澄清。
    3. 使用一次性无菌细胞刮刀轻轻刮取膜上的蜕膜层。在操作过程中向膜上添加无菌1×PBS（图 1F）。收集蜕膜组织并将其置于含有无菌1×PBS的50 ml塑料管中（图 1G）。

2. 机械解离与酶消化

  1. 将从底蜕膜（步骤 1.1.3）或壁蜕膜（步骤 1.2.3）分离的组织置于 50 ml 塑料管中，用无菌 1× PBS 洗涤。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，收集组织沉淀。
  2. 小心吸除组织沉淀上方的上清液，避免扰动沉淀。
    注意：此时沉淀物非常松散，因其含有红细胞。若沉淀体积约为或小于 3 ml，将沉淀重悬于 6 ml 预热至 37 °C 的细胞解离溶液中。若沉淀体积大于 3 ml，则加入更多细胞解离溶液（加入量约为组织样本体积的 2 倍）。
  3. 将匀浆后的组织（底蜕膜 + 细胞解离溶液 或 壁蜕膜 + 细胞解离溶液）转移至 C 管中。
  4. 将 C 管放入自动组织解离仪中，并运行相应的程序。
    注意：底蜕膜的程序运行时间为 17 秒，每轮总转数为 668；壁蜕膜的程序运行时间为 37 秒，每轮总转数为 235。这些程序已针对从底蜕膜或壁蜕膜中高效分离白细胞并保持良好细胞得率和活力进行了优化。
  5. 组织经机械解离后，使用市售的细胞解离溶液（如 accutase；一种含有蛋白酶和胶原酶的混合酶溶液）在 37 °C 条件下轻柔振荡消化 45 分钟。

3. 白细胞的分离

  1. 孵育后，向消化混合物中加入 10 ml 的 1× PBS，通过 100 µm 细胞滤筛过滤至 50 ml 塑料离心管中。根据消化混合物的黏稠程度，可能需要为同一样品使用多个细胞滤筛。
  2. 用 1× PBS 填满离心管，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。小心移除细胞沉淀上方的 1× PBS，并用 5 ml 冰冷的 FACS 缓冲液重悬细胞沉淀。
    注意：若需同时研究多形核与单核白细胞，请转至步骤 6.1；若仅研究单核白细胞，请继续进行步骤 3.3。
  3. 在 15 ml 塑料离心管中加入 5 ml 密度为 20% 的梯度介质（1.077 + 0.001 g/ml），然后将细胞悬液缓慢地叠加在密度梯度介质上方。在分层操作过程中，必须避免密度梯度介质与细胞悬液混合。
  4. 使用水平转子在 4 ˚C 下以 500 × g 离心 30 分钟，离心过程中不得启用刹车。关闭刹车至关重要，以防止细胞混合并破坏梯度层。白细胞将位于密度梯度介质与 FACS 缓冲液之间的界面处。
  5. 使用移液器小心地移除上层含有 FACS 缓冲液和细胞碎片的液体。界面处的条带含有蜕膜单核细胞以及部分多形核白细胞。
  6. 将界面处的所有细胞完全转移至新的 15 ml 塑料离心管中，并加入至少 3 倍体积的 FACS 缓冲液。
  7. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。吸除上清液，并用 FACS 缓冲液洗涤细胞，随后在室温下再次以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞。
    注意：如需进行细胞培养，请参见步骤 4；如需进行细胞分选，请参见步骤 5；如需进行免疫表型分析，请参见步骤 6。

4. 应用——细胞培养

  1. 将第3.7步的细胞重悬于1 ml RPMI 1640培养基中。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板结合0.4%台盼蓝溶液计数活细胞。
  2. 补加RPMI培养基至细胞浓度为1 × 106 个细胞/ml。细胞现可进行培养。

5. 应用——用于原代细胞培养的巨噬细胞分离

  1. 为分离CD14+细胞，使用CD14微珠（每107个细胞加入20 µl微珠）对第3.7步的细胞进行磁性标记，在4 ˚C孵育15分钟，并通过施加磁场将CD14+细胞与其他类型的细胞分离。用MACS缓冲液洗涤两次并撤去磁场后，用MACS缓冲液洗脱磁性保留的CD14+细胞。
  2. 离心后，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中。细胞即可用于铺板（图2）。

6. 应用——免疫表型分析

  1. 若要将细胞用于免疫表型分析，将第 3.7 步中的细胞重悬于 1 ml 的 1× PBS 中。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板配合 0.4% 台盼蓝溶液计数活细胞。
  2. 使用可固定的活率染料对细胞进行标记（图 3）。用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于染色缓冲液中。加入 Fc 受体阻断剂，在 4 °C 下孵育 15 分钟。
  3. 加入与荧光染料偶联的细胞外抗体。例如，在本方案中使用抗 CD3、抗 CD19、抗 CD14、抗 CD15 和抗 CD56 抗体（表 1）。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  4. 用 1× PBS 洗涤两次后，将细胞重悬于 500 µl 染色缓冲液中，并使用流式细胞仪进行分析。用于分析蜕膜组织中白细胞亚群的设门策略示意图见 图 4。

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结果

母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）人组织的解剖方法如图所示 图1。该步骤包括基板的解剖，其中包含底蜕膜（图1A-D。通过从基板上移除胎盘绒毛（胎儿面），可获得底蜕膜 （图1C））。通过轻轻刮取绒毛膜获取壁蜕膜（图1E-F). 图2 展示了使用磁性细胞分选法从足月妊娠的壁蜕膜中分离的巨噬细胞（CD14+）的形态。分离的巨噬细胞在培养3天后仍保持释放细胞因子的能力（数据未显示）。从底蜕膜和壁蜕膜中分离得到的活细胞产量如图所示 图3，且在两者中均高于90%。 图4 显示在活细胞门控范围内分析多形核和单个核白细胞的设门策略，包括足月妊娠时的T细胞（CD3+）、中性粒细胞（CD15+）、巨噬细胞（CD14+）、NK细胞（CD56+）、NKT细胞（CD3+CD56+）和B细胞（CD19+）。 图5 显示足月妊娠分离的蜕膜细...

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讨论

表征人类母胎界面浸润性白细胞的功能和表型特征，对于理解导致免疫机制的基础至关重要 妊娠相关疾病。已有多种技术被用于在整个妊娠期间从人类母胎界面分离白细胞 10,14,25,28,37,42,43然而，这些技术各不相同，所使用的酶或酶组合不同，解离时间各异，未明确说明组织用量，且最重要的是，并未始终说明分离细胞的活力。本文所述方案可从人类母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）中分离出浸润性白细胞，获得 高产量的活细胞，并提供了经我们验证的商业试剂、缓冲液配制、组织用量及孵育时间的详细信息 实验室

白细胞分离过程的第一个关键步骤是组织解离；此步骤包括机械性解离和/或酶解解离。在分离壁蜕膜时，通过刮除绒毛膜可成功实现机械性解离（图1F）；而在分离基蜕膜时，则通过从基底层修剪胎盘绒毛来完成（图1C）10,28。因此，本文所述方案将这两种操作均列为初始步骤。然而，需要注意的是，基底层（母体组织）与胎盘绒毛（胎儿组织）之间存在紧密连接，这可能导致在从基蜕膜中分离白细...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由美国卫生与公共服务部（DHHS）下属的美国国立儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH/DHHS）提供资助。部分研究经费还来自韦恩州立大学围产期倡议项目（Wayne State University Perinatal Initiative in Maternal, Perinatal and Child Health）。 我们衷心感谢韦恩州立大学的 Maureen McGerty 对本文稿提出的宝贵审阅意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖
无菌解剖工具：手术剪、镊子和精细尖头镊子 任意供应商20012-027
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies(1X PBS)
大、小培养皿任意供应商
细胞解离
AccutaseLife TechnologiesA11105-01(细胞脱离溶液)
无菌2 ml安全锁锥形管任意供应商
50 ml锥形离心管任意供应商
100 µm细胞筛FALCON/Corning352360
5 ml圆底聚苯乙烯试管任意供应商
移液管任意供应商
C管Miltenyi Biotec130-093-237
细胞培养
RPMI 1640培养基 Life Technologies22400-089(1X) (10% FBS 和 1% P/S)
塑料培养腔载玻片Thermo Scientific177437
培养箱Thermo Scientific CorporationHEPA Class 100
水浴锅Fisher ScientificISOTEMP 110
细胞计数仪NexelcomCellometer Auto2000
显微镜OlympusOlympus CKX41
细胞分离
MS柱Miltenyi Biotec130-042-201
细胞分离仪Miltenyi Biotec130-042-109
30 μm预分离滤器Miltenyi Biotec130-041-40
多支架架Miltenyi Biotec130-042-303
15 ml安全锁锥形管任意供应商
MACS缓冲液 (0.5% 牛血清白蛋白，2 mM EDTA 和 1X PBS)
试剂
FcR阻断剂Miltenyi Biotec130-059-901(Fc阻断)
抗人细胞表面抗原抗体 BD Biosciences(表1)
牛血清白蛋白 SigmaA7906
LIVE/DEAD活力染料BD Biosciences564406
裂解/固定缓冲液 BD Biosciences346202
FACS缓冲液 (0.1% BSA，0.05%叠氮化钠，1X PBS，pH=7.4)
染色缓冲液 BD Biosciences554656
0.4%台盼蓝溶液Life Technologies15250-011
FicollGE Healthcare17-1440-0220%密度梯度介质（1.077 ± 0.001 g/ml）
其他仪器
带摇床的培养箱Thermo ScientificMAXQ 4450
流式细胞仪BD BiosciencesLSR-Fortessa
离心机 Beckman CoulterSpinChron DLX
真空系统任意供应商
自动组织解离仪 Miltenyi BiotecgentleMACS Dissociator

参考文献

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