本文介绍了一种分离并进一步研究人母胎界面——即底蜕膜和壁蜕膜中浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，已通过流式细胞术分析验证可用于后续实验应用。
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本文内容
摘要
摘要
妊娠的特征是白细胞浸润生殖组织以及母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）。该界面是母体与胎儿组织之间的解剖学接触部位，因此在妊娠期间构成一个免疫学作用位点。母胎界面处浸润的白细胞在胚胎着床、妊娠维持以及分娩时机的调控中发挥核心作用。因此，对这些白细胞进行表型和功能特征分析，将有助于揭示导致 妊娠相关疾病。已有多种方案用于从底蜕膜和壁蜕膜中分离浸润性白细胞；然而，由于所用试剂、酶类及孵育时间缺乏一致性，导致这些结果难以相互比较。本文所述为 一种结合温和的机械分离与酶解离技术的新方法，用于保护从母胎界面人体组织中分离的白细胞的胞外和胞内标志物的活性与完整性。除免疫表型分析、细胞培养和细胞分选外，本方案未来还可应用于多种不同研究。按照本方案操作后，所分离的白细胞可用于检测DNA甲基化、目的基因表达水平 体外 白细胞功能即吞噬作用、细胞毒性、T细胞增殖和可塑性 等等。），以及母胎界面活性氧物质的产生。此外，通过采用所述实验方案，本实验室已能够鉴定出母胎界面新的罕见白细胞。
引言
妊娠 其特征是三个不同的免疫学阶段：1）与促炎反应相关的植入和早期胎盘形成即，植入过程类似于“开放性伤口”；2）妊娠中期及大部分妊娠晚期，母胎界面以抗炎状态为主，实现免疫稳态；3）分娩期，表现为促炎状态1-7免疫细胞在母胎界面炎症反应的调控中发挥重要作用，其数量和定位在妊娠过程中发生动态变化6-9.
在人类中，母胎界面是母体组织（蜕膜）与胎儿组织（绒毛膜或滋养层）直接接触的区域。该界面包括：1）壁蜕膜，其衬于子宫腔内未被胎盘覆盖的区域，并与平滑绒毛膜相邻；以及2）底蜕膜，位于胎盘的基底板处，在此被间质滋养层细胞侵入。10 (图1这些接触区域的紧密性为胎儿抗原向母体免疫系统的暴露创造了条件11-13毫不奇怪，白细胞可占蜕膜细胞的30-40%8,9,14,15 除了典型的间质样细胞和腺细胞外8,14,16. 白细胞在母-胎界面的作用涉及多种过程，包括限制滋养层细胞的侵袭17，螺旋动脉重塑18,19母体耐受的维持12,20，以及分娩的启动21-26适应性免疫和固有免疫系统的白细胞， 即，已在蜕膜组织中鉴定出T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞，其比例和活化状态在妊....
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方案
该方案适用于从底蜕膜和壁蜕膜中分离白细胞，以进行流式细胞术免疫表型分析。此外，分离的细胞还可用于细胞分选、细胞培养、RNA提取和细胞学分析。在处理本方案中提及的样本前，必须获得当地研究伦理委员会和机构审查委员会的人类伦理批准。本研究中人类样本的采集和使用已获以下机构审查委员会批准： 尤妮斯·肯尼迪·施赖弗 美国卫生与公共服务部（DHHS，贝塞斯达，马里兰州，美国）国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD），美国国立卫生研究院（NIH）及韦恩州立大学（底特律，密歇根州，美国）。在采集组织样本前，已从所有孕妇处获得书面知情同意。
注意：在处理本方案中提及的动物血液、细胞或有害试剂时，必须遵守适当的生物安全和实验室安全措施。
1. 人蜕膜组织的解剖
注意：底板位于胎盘下方并与之相连，代表母体表面。绒毛膜羊膜包括羊膜和绒毛膜。底板包含底蜕膜，而绒毛膜包含壁蜕膜（图1）。
- 基底蜕膜
- 从胎盘的一个绒毛叶中解剖出一块基底板（图 1A 和 图 1B）。
- 将其放置在无菌切割板上，使胎盘绒毛朝上。显示胎盘绒毛的一侧通常呈血红色，外观呈毛发状组织；基底板则表面光滑，颜色呈淡红色。
- 使用锋利的精细剪刀和镊子去除绒毛组织和血管....
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结果
母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）人组织的解剖方法如图所示 图1。该步骤包括基板的解剖，其中包含底蜕膜（图1A-D。通过从基板上移除胎盘绒毛（胎儿面），可获得底蜕膜 （图1C））。通过轻轻刮取绒毛膜获取壁蜕膜（图1E-F). 图2 展示了使用磁性细胞分选法从足月妊娠的壁蜕膜中分离的巨噬细胞（CD14+）的形态。分离的巨噬细胞在培养3天后仍保持释放细胞因子的能力（数据未显示）。从底蜕膜和壁蜕膜中分离得到的活细胞产量如图所示 图3，且在两者中均高于90%。 图4 显示在活细胞门控范围内分析多形核和单个核白细胞的设门策略，包括足月妊娠时的T细胞（CD3+）、中性粒细胞（CD15+）、巨噬细胞（CD14+）、NK细胞（CD56+）、NKT细胞（CD3+CD56+）和B细胞（CD19+）。 图5 显示足月妊娠分离的蜕膜细.......
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讨论
表征人类母胎界面浸润性白细胞的功能和表型特征，对于理解导致免疫机制的基础至关重要 妊娠相关疾病。已有多种技术被用于在整个妊娠期间从人类母胎界面分离白细胞 10,14,25,28,37,42,43然而，这些技术各不相同，所使用的酶或酶组合不同，解离时间各异，未明确说明组织用量，且最重要的是，并未始终说明分离细胞的活力。本文所述方案可从人类母胎界面（底蜕膜和壁蜕膜）中分离出浸润性白细胞，获得 高产量的活细胞，并提供了经我们验证的商业试剂、缓冲液配制、组织用量及孵育时间的详细信息 实验室
白细胞分离过程的第一个关键步骤是组织解离；此步骤包括机械性解离和/或酶解解离。在分离壁蜕膜时，通过刮除绒毛膜可成功实现机械性解离（图1F）；而在分离基蜕膜时，则通过从基底层修剪胎盘绒毛来完成（图1C）10,28。因此，本文所述方案将这两种操作均列为初始步骤。然而，需要注意的是，基底层（母体组织）与胎盘绒毛（胎儿组织）之间存在紧密连接，这可能导致在从基蜕膜中分离白细.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国卫生与公共服务部（DHHS）下属的美国国立儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH/DHHS）提供资助。部分研究经费还来自韦恩州立大学围产期倡议项目（Wayne State University Perinatal Initiative in Maternal, Perinatal and Child Health）。 我们衷心感谢韦恩州立大学的 Maureen McGerty 对本文稿提出的宝贵审阅意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖 | |||
| 无菌解剖工具：手术剪、镊子和精细尖头镊子 | 任意供应商 | 20012-027 | |
| 1× 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life Technologies | (1X PBS) | |
| 大、小培养皿 | 任意供应商 | ||
| 细胞解离 | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (细胞脱离溶液) |
| 无菌2 ml安全锁锥形管 | 任意供应商 | ||
| 50 ml锥形离心管 | 任意供应商 | ||
| 100 µm细胞筛 | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml圆底聚苯乙烯试管 | 任意供应商 | ||
| 移液管 | 任意供应商 | ||
| C管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 细胞培养 | |||
| RPMI 1640培养基 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS 和 1% P/S) |
| 塑料培养腔载玻片 | Thermo Scientific | 177437 | |
| 培养箱 | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| 细胞计数仪 | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| 显微镜 | Olympus | Olympus CKX41 | |
| 细胞分离 | |||
| MS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 细胞分离仪 | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm预分离滤器 | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| 多支架架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml安全锁锥形管 | 任意供应商 | ||
| MACS缓冲液 | (0.5% 牛血清白蛋白，2 mM EDTA 和 1X PBS) | ||
| 试剂 | |||
| FcR阻断剂 | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc阻断) |
| 抗人细胞表面抗原抗体 | BD Biosciences | (表1) | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD活力染料 | BD Biosciences | 564406 | |
| 裂解/固定缓冲液 | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS缓冲液 | (0.1% BSA，0.05%叠氮化钠，1X PBS，pH=7.4) | ||
| 染色缓冲液 | BD Biosciences | 554656 | |
| 0.4%台盼蓝溶液 | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20%密度梯度介质（1.077 ± 0.001 g/ml） |
| 其他仪器 | |||
| 带摇床的培养箱 | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| 离心机 | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| 真空系统 | 任意供应商 | ||
| 自动组织解离仪 | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |
参考文献
- Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
- Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta. 24, Suppl A. S33-S46 (2003).
- Romero, R., et al.
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