分离小鼠母胎界面组织中的白细胞

摘要

本文描述了一种从小鼠母胎界面（子宫、蜕膜和胎盘）组织中分离和分析浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持大多数细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，可用于后续实验，包括流式细胞术分析。

摘要

妊娠期间的免疫耐受需要母体免疫系统发生特异性改变，以接受并维持胎儿的发育。这种耐受在性交过程中启动，在受精和着床期间建立，并在整个妊娠过程中维持。母胎耐受的活性细胞和分子介质富集于胎儿与母体组织接触的部位，即母胎界面，该界面包括胎盘以及子宫和蜕膜组织。母胎界面由基质细胞和浸润的白细胞组成，其数量和表型特征随着妊娠进程而变化。母胎界面处浸润的白细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞，这些细胞共同构建了维持妊娠的局部微环境。这些细胞之间的失衡或其表型的任何异常改变，被认为是妊娠相关疾病发生的机制之一。因此，研究浸润于母胎界面的白细胞对于阐明导致妊娠并发症的免疫机制至关重要。本文所述方案采用温和的机械解离结合强效的酶学消化方法，使用含有蛋白酶和胶原酶的酶混合物，从鼠类母胎界面组织中分离浸润的白细胞。该方案可实现大量活细胞白细胞的分离（>70%），且具有足够保守的抗原性和功能特性。分离得到的白细胞可通过多种技术进行分析，包括免疫表型分析、细胞分选、成像、免疫印迹、mRNA表达检测、细胞培养等 体外 混合淋巴细胞反应、增殖或细胞毒性检测等功能检测。

引言

妊娠期间的免疫耐受是一个母体免疫系统发生显著变化的时期。这些变化使得母体能够耐受胎儿这一半同种异体移植物¹。胎儿表达父源的主要组织相容性复合体（MHC）抗原²，且已在母体血液循环中检测到胎儿细胞³；然而，胎儿并未被母体免疫系统排斥^4,5。这一谜题尚未被完全阐明。

最新的假说认为，母胎耐受在性交和受精过程中建立^6,7，并持续维持以支持足月妊娠^8-10。母胎耐受的破坏被认为是妊娠早、晚期阶段疾病发生的机制之一^10-16。母胎耐受涉及多种白细胞亚群的参与，包括T细胞（调节性T细胞、Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞）、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和NKT细胞、树突状细胞以及B细胞，这些细胞在妊娠过程中其密度和定位均会发生动态变化^15,17-19。母胎耐受在母胎界面处尤为丰富²⁰——该解剖部位是母体免疫系统与胎儿抗原相互作用的区域^20,21。

在胎盘形成过程中，胎儿的绒毛外滋养层细胞侵入子宫黏膜，从而形成母胎界面^22-24。在此界面的胎儿侧，包围胎儿的膜在胎盘内形成特化的上皮表面，合体滋养层细胞通过与母体血液的直接接触调控营养物质交换²²。在母体侧，蜕膜募....

方案

在使用本方案中提及的样本之前，必须获得当地研究伦理委员会和机构审查委员会的动物伦理批准。在处理本方案中提及的动物血液、细胞或有害试剂时，必须遵守适当的生物安全和实验室安全规范。

1. 小鼠操作与组织采集

1. 准备无菌工作台并获取用于组织采集的无菌器械，包括大号和小号手术剪、镊子及细尖镊。准备若干小型培养皿，标注相应的组织名称，并加入已平衡至室温（20 - 22 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（3 - 5 ml）。另准备一个未标记的大培养皿，加入1×PBS溶液（10 - 15 ml）。
2. 使用二氧化碳（CO₂）处死一只妊娠小鼠（交配后10.5至19.0天，或分娩前）₂). 为确保小鼠被安乐死，采用颈椎脱位法。
   注意：在10.5天胚胎发育期（dpc）之前，很难手动将蜕膜组织从子宫组织中分离。如果无需分离蜕膜白细胞，可使用未妊娠小鼠或妊娠小鼠在 <10.5 天的胚胎也可以按照本方案进行操作。
3. 使用无菌手术剪，完全切除下腹部的皮肤和肌肉组织。用镊子移开所有其他器官，直至子宫和卵巢可见。保持子宫附着，用镊子将其移出腹膜腔。图1A).
4. 在每侧子宫角的输卵管远端及子宫-输卵管交界处定位卵巢。使用小型手术剪在子宫-输卵管交界处做切口，将子宫角从含有子宫血管的系膜中分离；随后在宫颈处切除，使子宫角与腹膜腔分离。图1B....

结果

在图1中展示了从小鼠母胎界面分离组织的过程；该操作包括打开腹腔（图1A,B）、子宫角（图1C），包括着床部位（图1D），以及在16.5天妊娠期（dpc）收集子宫组织（图1E）、胎盘（图1F）和蜕膜组织（图1G）。图2展示了在16.5 dpc时通过磁性细胞分选法从蜕膜和子宫组织中分离得到的巨噬细胞（F4/80+）的形态。分离得到的巨噬细胞保持分泌细胞因子的能力（数据未显示）。从蜕膜、子宫和胎盘中分离获得的活细胞产量如图3所示，所有组织中细胞活力均高于70%。图4展示了在单细胞和活细胞门控范围内分析多形核和单核白细胞的设门策略，包括T细胞（CD45+CD3+）、中性粒细胞（CD45+Ly6G+）、巨噬细胞（CD45+F4/80+）、树突状细胞（CD45+CD11c+）和NK细胞（CD45+CD49b+），检.......

讨论

系统收集记录母胎界面浸润性白细胞丰度及其表型特征的一致性数据，对于理解妊娠相关并发症的发病机制至关重要。已有多种技术被用于从妊娠期间小鼠母胎界面组织中分离浸润性白细胞^{31,38,39,43-46}。然而，这些技术各不相同，所使用的酶或酶组合不同，解离时间各异，未明确说明组织用量，更重要的是，并未始终提供所分离细胞的存活率信息。本文所述方案可实现从小鼠母胎界面组织中高存活率地分离浸润性白细胞，并提供了经实验室验证的商用试剂、缓冲液配制、组织用量及孵育时间的详细信息。

白细胞分离过程中最关键的步骤之一是组织解离；该步骤涉及机械匀浆和/或酶促反应，可能会影响用于表型鉴定的细胞外蛋白的完整性⁴⁷。本文所述方案提供了一种新方法，结合使用温和的机械和酶法组织解离技术，以保持从小鼠胎盘以及蜕膜和子宫组织中分离出的白细胞表面细胞外标志物的完整性。

单个酶或不同酶的组合已被用于从母胎界面的小鼠组织中分离浸润性白细胞^31,32,39,44。在许多情况下，这些在实验室中手工配制至特定浓.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磁性细胞分离
MS 柱	Militenyi Biotec	130-042-201
细胞分离器	Militenyi Biotec	130-042-102
30 μm 预分离滤器	Militenyi Biotec	130-041-407
多柱支架	Militenyi Biotec	130-042-303
15 ml 锥形管	Thermo Fisher	339650
MACS 缓冲液	Militenyi Biotec	实验室配制	(0.5% 牛血清白蛋白, 2 mM EDTA 和 1× PBS, pH 7.2)
试剂
Accutase 酶解液	Life Technologies	A11105-01
抗小鼠 CD16/CD32 抗体	BD Biosciences	533142
抗小鼠细胞外抗体	BD Biosciences/eBiosciences		表 1
叠氮化钠	Fisher	S227-500
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906-100G
LIVE/DEAD 活性染料	Life Technologies	L23105
固定缓冲液	BD Biosciences	558049
FACS 缓冲液	BD Biosciences	实验室配制	0.1% BSA, 0.05% 叠氮化钠, 1× PBS, pH 7.4
0.4% 台盼蓝溶液	BIO-RAD	145-0013
胎牛血清 (FBS)	Life Technologies	16000-044
其他仪器
带摇床的培养箱	Thermo Scientific	MaxQ 4450
流式细胞仪	BD LSRFortessa
离心机	Thermo Scientific	Legend LXTR
真空系统			实验室自制
培养箱	Thermo Scientific	Incubator 3307
水浴锅	Precision	51221035
细胞计数仪	BIO-RAD	TC20 自动细胞计数仪
光学与荧光显微镜	Zeiss 和 Olympus	Zeiss LSM780 和 Olympus CKX41