本文描述了一种从小鼠母胎界面(子宫、蜕膜和胎盘)组织中分离和分析浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持大多数细胞表面标志物的完整性,并获得足量的活细胞,可用于后续实验,包括流式细胞术分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文描述了一种从小鼠母胎界面(子宫、蜕膜和胎盘)组织中分离和分析浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持大多数细胞表面标志物的完整性,并获得足量的活细胞,可用于后续实验,包括流式细胞术分析。
妊娠期间的免疫耐受需要母体免疫系统发生特异性改变,以接受并维持胎儿的发育。这种耐受在性交过程中启动,在受精和着床期间建立,并在整个妊娠过程中维持。母胎耐受的活性细胞和分子介质富集于胎儿与母体组织接触的部位,即母胎界面,该界面包括胎盘以及子宫和蜕膜组织。母胎界面由基质细胞和浸润的白细胞组成,其数量和表型特征随着妊娠进程而变化。母胎界面处浸润的白细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞,这些细胞共同构建了维持妊娠的局部微环境。这些细胞之间的失衡或其表型的任何异常改变,被认为是妊娠相关疾病发生的机制之一。因此,研究浸润于母胎界面的白细胞对于阐明导致妊娠并发症的免疫机制至关重要。本文所述方案采用温和的机械解离结合强效的酶学消化方法,使用含有蛋白酶和胶原酶的酶混合物,从鼠类母胎界面组织中分离浸润的白细胞。该方案可实现大量活细胞白细胞的分离(>70%),且具有足够保守的抗原性和功能特性。分离得到的白细胞可通过多种技术进行分析,包括免疫表型分析、细胞分选、成像、免疫印迹、mRNA表达检测、细胞培养等 体外 混合淋巴细胞反应、增殖或细胞毒性检测等功能检测。
妊娠期间的免疫耐受是一个母体免疫系统发生显著变化的时期。这些变化使得母体能够耐受胎儿这一半同种异体移植物1。胎儿表达父源的主要组织相容性复合体(MHC)抗原2,且已在母体血液循环中检测到胎儿细胞3;然而,胎儿并未被母体免疫系统排斥4,5。这一谜题尚未被完全阐明。
最新的假说认为,母胎耐受在性交和受精过程中建立6,7,并持续维持以支持足月妊娠8-10。母胎耐受的破坏被认为是妊娠早、晚期阶段疾病发生的机制之一10-16。母胎耐受涉及多种白细胞亚群的参与,包括T细胞(调节性T细胞、Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和NKT细胞、树突状细胞以及B细胞,这些细胞在妊娠过程中其密度和定位均会发生动态变化15,17-19。母胎耐受在母胎界面处尤为丰富20——该解剖部位是母体免疫系统与胎儿抗原相互作用的区域20,21。
在胎盘形成过程中,胎儿的绒毛外滋养层细胞侵入子宫黏膜,从而形成母胎界面22-24。在此界面的胎儿侧,包围胎儿的膜在胎盘内形成特化的上皮表面,合体滋养层细胞通过与母体血液的直接接触调控营养物质交换22。在母体侧,蜕膜募集了一群异质性的白细胞,在小鼠中占所有蜕膜细胞的30%至50%。这些细胞除了参与母体免疫耐受外,还在妊娠期间多种过程中发挥关键作用,例如,防御生殖道感染、受精、胚胎着床7,25、蜕膜血管生成26、血管重塑24,27、滋养层细胞侵袭28、胎盘发育24,25,以及最终的分娩启动15,17。因此,研究参与母胎免疫耐受的白细胞对于阐明妊娠相关并发症的发病机制至关重要。
尽管免疫组织化学和免疫荧光技术已为子宫、蜕膜或胎盘白细胞的直接可视化和定位提供了数据29,30,流式细胞术分析进一步揭示了这些组织中白细胞的特定亚群31,32。此外,流式细胞术已被用于测定母胎界面白细胞的密度和比例33,以及细胞外和细胞内蛋白的表达水平8-10,34。对母胎界面白细胞进行流式细胞术分析需要制备单细胞悬液。为了从蜕膜、子宫和胎盘组织中分离浸润的白细胞,已采用两种组织解离方法:机械法和酶解法。这两种方法均可将浸润的白细胞从这些组织的细胞外基质(ECM)中分离出来。酶解法组织解离优于机械法,因其可在减少剪切力相关损伤的情况下获得更高的白细胞得率35。因此,机械组织解离通常需要合并多个组织样本36,这可能会增加样本的变异性与异质性。然而,当目标抗原可能因酶解过程而发生改变,或需要保持目标细胞的功能性(例如,自然杀伤细胞的细胞毒性)时,机械解离可能是更合适的选择35。
使用特定酶进行蛋白水解以降解细胞外基质(ECM),可消除机械解离时观察到的低得率问题。已有若干研究报道了胰蛋白酶32、胶原酶37、DNase31、中性蛋白酶38以及多种酶的商用混合试剂32,39的应用。然而,必须仔细确定并验证不同酶的种类、浓度及消化时间,以确保维持细胞表面抗原表位的完整性,从而满足免疫表型分析的要求。不同的表面结构对各种酶的破坏具有差异性敏感性,其中某些酶(如胰蛋白酶)因会去除多种单克隆抗体所识别的白细胞表面表位而尤为显著。
本文介绍了一种使用蛋白水解和胶原水解酶混合物——Accutase的方法。该酶溶液在解离小鼠母胎界面组织时具有足够的温和性,同时仍保持高效性,且无需添加其他解离试剂或血清来终止解离反应。此外,其成品可直接使用,尽管解离时间需要进行验证,但其稳定性优于上述提及的酶40,41。
联合使用这两种组织解离方法可提高所获细胞的质量和数量;因此,已有若干研究采用机械解离与酶解离相结合的方法,并取得了满意的结果31,32,37。本文所述方案由本实验室建立并验证,采用轻柔的机械解离与高效的酶解离相结合的方式。该方案可用于分离和进一步研究小鼠母胎界面(子宫、蜕膜和胎盘)组织中浸润的白细胞。以下方案还能保持细胞表面标志物的完整性,并获得足量的活细胞,可用于后续实验,流式细胞术分析已证实其有效性。最后,该方案确保了细胞制备的一致性,便于对构成母胎界面的不同小鼠组织进行分析与比较。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在使用本方案中提及的样本之前,必须获得当地研究伦理委员会和机构审查委员会的动物伦理批准。在处理本方案中提及的动物血液、细胞或有害试剂时,必须遵守适当的生物安全和实验室安全规范。
1. 小鼠操作与组织采集
2. 子宫、蜕膜和胎盘组织解离
3. 可固定细胞的活力染色
4. 免疫表型分析
5. 不可固定细胞的活力染色
6. 细胞培养
7. 磁珠分选细胞
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在图1中展示了从小鼠母胎界面分离组织的过程;该操作包括打开腹腔(图1A,B)、子宫角(图1C),包括着床部位(图1D),以及在16.5天妊娠期(dpc)收集子宫组织(图1E)、胎盘(图1F)和蜕膜组织(图1G)。图2展示了在16.5 dpc时通过磁性细胞分选法从蜕膜和子宫组织中分离得到的巨噬细胞(F4/80+)的形态。分离得到的巨噬细胞保持分泌细胞因子的能力(数据未显示)。从蜕膜、子宫和胎盘中分离获得的活细胞产量如图3所示,所有组织中细胞活力均高于70%。图4展示了在单细胞和活细胞门控范围内分析多形核和单核白细胞的设门策略,包括T细胞(CD45+CD3+)、中性粒细胞(CD45+Ly6G+)、巨噬细胞(CD45+F4/80+)、树突状细胞(CD45+CD11c+)和NK细胞(CD45+CD49b+),检...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
系统收集记录母胎界面浸润性白细胞丰度及其表型特征的一致性数据,对于理解妊娠相关并发症的发病机制至关重要。已有多种技术被用于从妊娠期间小鼠母胎界面组织中分离浸润性白细胞31,38,39,43-46。然而,这些技术各不相同,所使用的酶或酶组合不同,解离时间各异,未明确说明组织用量,更重要的是,并未始终提供所分离细胞的存活率信息。本文所述方案可实现从小鼠母胎界面组织中高存活率地分离浸润性白细胞,并提供了经实验室验证的商用试剂、缓冲液配制、组织用量及孵育时间的详细信息。
白细胞分离过程中最关键的步骤之一是组织解离;该步骤涉及机械匀浆和/或酶促反应,可能会影响用于表型鉴定的细胞外蛋白的完整性47。本文所述方案提供了一种新方法,结合使用温和的机械和酶法组织解离技术,以保持从小鼠胎盘以及蜕膜和子宫组织中分离出的白细胞表面细胞外标志物的完整性。
单个酶或不同酶的组合已被用于从母胎界面的小鼠组织中分离浸润性白细胞31,32,39,44。在许多情况下,这些在实验室中手工配制至特定浓...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无利益冲突。
NGL 得到了韦恩州立大学母婴、围产期及儿童健康围产期计划的支持。我们衷心感谢韦恩州立大学的 Maureen McGerty 和 Amy E. Furcron 对本稿件的审阅。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磁性细胞分离 | |||
| MS 柱 | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 细胞分离器 | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μm 预分离滤器 | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| 多柱支架 | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml 锥形管 | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS 缓冲液 | Militenyi Biotec | 实验室配制 | (0.5% 牛血清白蛋白, 2 mM EDTA 和 1× PBS, pH 7.2) |
| 试剂 | |||
| Accutase 酶解液 | Life Technologies | A11105-01 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32 抗体 | BD Biosciences | 533142 | |
| 抗小鼠细胞外抗体 | BD Biosciences/eBiosciences | 表 1 | |
| 叠氮化钠 | Fisher | S227-500 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| LIVE/DEAD 活性染料 | Life Technologies | L23105 | |
| 固定缓冲液 | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS 缓冲液 | BD Biosciences | 实验室配制 | 0.1% BSA, 0.05% 叠氮化钠, 1× PBS, pH 7.4 |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | BIO-RAD | 145-0013 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| 其他仪器 | |||
| 带摇床的培养箱 | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| 流式细胞仪 | BD LSRFortessa | ||
| 离心机 | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| 真空系统 | 实验室自制 | ||
| 培养箱 | Thermo Scientific | Incubator 3307 | |
| 水浴锅 | Precision | 51221035 | |
| 细胞计数仪 | BIO-RAD | TC20 自动细胞计数仪 | |
| 光学与荧光显微镜 | Zeiss 和 Olympus | Zeiss LSM780 和 Olympus CKX41 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。