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方法文章

分离小鼠母胎界面组织中的白细胞

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DOI：

10.3791/52866

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2015年5月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

本文内容

摘要

本文描述了一种从小鼠母胎界面（子宫、蜕膜和胎盘）组织中分离和分析浸润性白细胞的实验方案。该方案可保持大多数细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，可用于后续实验，包括流式细胞术分析。

摘要

妊娠期间的免疫耐受需要母体免疫系统发生特异性改变，以接受并维持胎儿的发育。这种耐受在性交过程中启动，在受精和着床期间建立，并在整个妊娠过程中维持。母胎耐受的活性细胞和分子介质富集于胎儿与母体组织接触的部位，即母胎界面，该界面包括胎盘以及子宫和蜕膜组织。母胎界面由基质细胞和浸润的白细胞组成，其数量和表型特征随着妊娠进程而变化。母胎界面处浸润的白细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和NKT细胞，这些细胞共同构建了维持妊娠的局部微环境。这些细胞之间的失衡或其表型的任何异常改变，被认为是妊娠相关疾病发生的机制之一。因此，研究浸润于母胎界面的白细胞对于阐明导致妊娠并发症的免疫机制至关重要。本文所述方案采用温和的机械解离结合强效的酶学消化方法，使用含有蛋白酶和胶原酶的酶混合物，从鼠类母胎界面组织中分离浸润的白细胞。该方案可实现大量活细胞白细胞的分离（>70%），且具有足够保守的抗原性和功能特性。分离得到的白细胞可通过多种技术进行分析，包括免疫表型分析、细胞分选、成像、免疫印迹、mRNA表达检测、细胞培养等 体外 混合淋巴细胞反应、增殖或细胞毒性检测等功能检测。

引言

妊娠期间的免疫耐受是一个母体免疫系统发生显著变化的时期。这些变化使得母体能够耐受胎儿这一半同种异体移植物1。胎儿表达父源的主要组织相容性复合体（MHC）抗原2，且已在母体血液循环中检测到胎儿细胞3；然而，胎儿并未被母体免疫系统排斥4,5。这一谜题尚未被完全阐明。

最新的假说认为，母胎耐受在性交和受精过程中建立6,7，并持续维持以支持足月妊娠8-10。母胎耐受的破坏被认为是妊娠早、晚期阶段疾病发生的机制之一10-16。母胎耐受涉及多种白细胞亚群的参与，包括T细胞（调节性T细胞、Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞）、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和NKT细胞、树突状细胞以及B细胞，这些细胞在妊娠过程中其密度和定位均会发生动态变化15,17-19。母胎耐受在母胎界面处尤为丰富20——该解剖部位是母体免疫系统与胎儿抗原相互作用的区域20,21。

在胎盘形成过程中，胎儿的绒毛外滋养层细胞侵入子宫黏膜，从而形成母胎界面22-24。在此界面的胎儿侧，包围胎儿的膜在胎盘内形成特化的上皮表面，合体滋养层细胞通过与母体血液的直接接触调控营养物质交换22。在母体侧，蜕膜募集了一群异质性的白细胞，在小鼠中占所有蜕膜细胞的30%至50%。这些细胞除了参与母体免疫耐受外，还在妊娠期间多种过程中发挥关键作用，例如，防御生殖道感染、受精、胚胎着床7,25、蜕膜血管生成26、血管重塑24,27、滋养层细胞侵袭28、胎盘发育24,25，以及最终的分娩启动15,17。因此，研究参与母胎免疫耐受的白细胞对于阐明妊娠相关并发症的发病机制至关重要。

尽管免疫组织化学和免疫荧光技术已为子宫、蜕膜或胎盘白细胞的直接可视化和定位提供了数据29,30，流式细胞术分析进一步揭示了这些组织中白细胞的特定亚群31,32。此外，流式细胞术已被用于测定母胎界面白细胞的密度和比例33，以及细胞外和细胞内蛋白的表达水平8-10,34。对母胎界面白细胞进行流式细胞术分析需要制备单细胞悬液。为了从蜕膜、子宫和胎盘组织中分离浸润的白细胞，已采用两种组织解离方法：机械法和酶解法。这两种方法均可将浸润的白细胞从这些组织的细胞外基质（ECM）中分离出来。酶解法组织解离优于机械法，因其可在减少剪切力相关损伤的情况下获得更高的白细胞得率35。因此，机械组织解离通常需要合并多个组织样本36，这可能会增加样本的变异性与异质性。然而，当目标抗原可能因酶解过程而发生改变，或需要保持目标细胞的功能性（例如，自然杀伤细胞的细胞毒性）时，机械解离可能是更合适的选择35。

使用特定酶进行蛋白水解以降解细胞外基质（ECM），可消除机械解离时观察到的低得率问题。已有若干研究报道了胰蛋白酶32、胶原酶37、DNase31、中性蛋白酶38以及多种酶的商用混合试剂32,39的应用。然而，必须仔细确定并验证不同酶的种类、浓度及消化时间，以确保维持细胞表面抗原表位的完整性，从而满足免疫表型分析的要求。不同的表面结构对各种酶的破坏具有差异性敏感性，其中某些酶（如胰蛋白酶）因会去除多种单克隆抗体所识别的白细胞表面表位而尤为显著。

本文介绍了一种使用蛋白水解和胶原水解酶混合物——Accutase的方法。该酶溶液在解离小鼠母胎界面组织时具有足够的温和性，同时仍保持高效性，且无需添加其他解离试剂或血清来终止解离反应。此外，其成品可直接使用，尽管解离时间需要进行验证，但其稳定性优于上述提及的酶40,41。

联合使用这两种组织解离方法可提高所获细胞的质量和数量；因此，已有若干研究采用机械解离与酶解离相结合的方法，并取得了满意的结果31,32,37。本文所述方案由本实验室建立并验证，采用轻柔的机械解离与高效的酶解离相结合的方式。该方案可用于分离和进一步研究小鼠母胎界面（子宫、蜕膜和胎盘）组织中浸润的白细胞。以下方案还能保持细胞表面标志物的完整性，并获得足量的活细胞，可用于后续实验，流式细胞术分析已证实其有效性。最后，该方案确保了细胞制备的一致性，便于对构成母胎界面的不同小鼠组织进行分析与比较。

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方案

在使用本方案中提及的样本之前，必须获得当地研究伦理委员会和机构审查委员会的动物伦理批准。在处理本方案中提及的动物血液、细胞或有害试剂时，必须遵守适当的生物安全和实验室安全规范。

1. 小鼠操作与组织采集

  1. 准备无菌工作台并获取用于组织采集的无菌器械，包括大号和小号手术剪、镊子及细尖镊。准备若干小型培养皿，标注相应的组织名称，并加入已平衡至室温（20 - 22 °C）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（3 - 5 ml）。另准备一个未标记的大培养皿，加入1×PBS溶液（10 - 15 ml）。
  2. 使用二氧化碳（CO₂）处死一只妊娠小鼠（交配后10.5至19.0天，或分娩前）2). 为确保小鼠被安乐死，采用颈椎脱位法。
    注意：在10.5天胚胎发育期（dpc）之前，很难手动将蜕膜组织从子宫组织中分离。如果无需分离蜕膜白细胞，可使用未妊娠小鼠或妊娠小鼠在 <10.5 天的胚胎也可以按照本方案进行操作。
  3. 使用无菌手术剪，完全切除下腹部的皮肤和肌肉组织。用镊子移开所有其他器官，直至子宫和卵巢可见。保持子宫附着，用镊子将其移出腹膜腔。图1A).
  4. 在每侧子宫角的输卵管远端及子宫-输卵管交界处定位卵巢。使用小型手术剪在子宫-输卵管交界处做切口，将子宫角从含有子宫血管的系膜中分离；随后在宫颈处切除，使子宫角与腹膜腔分离。图1B).
  5. 使用小型手术剪，在子宫颈与子宫角下段之间做一切口。此过程中保留一部分子宫颈相连图1C以避免打开子宫角。
  6. 将子宫角（包括子宫颈）浸入盛有1x PBS溶液（10–15 ml）的大培养皿中，以充分润湿着床部位。
  7. 在1×PBS溶液中用小型手术剪修剪子宫角上的脂肪组织。解剖过程中始终保持组织浸没在1×PBS溶液中。
  8. 用镊子固定子宫角，使用小型手术剪在植入间区域进行横向剪切，从子宫中移除一个植入位点图1D植入部位包含胎儿，其周围为绒毛尿囊膜，以及子宫、蜕膜和胎盘组织。
  9. 使用镊子固定位置，并在胎盘和蜕膜组织附近的子宫壁上做一个小切口（图1E）。修剪胎盘/蜕膜的周边，直至其与子宫壁以及包含胎儿的绒毛膜羊膜完全分离（图1F).
  10. 去除胎盘及附着的蜕膜组织，置于1x PBS溶液中（3 - 5  毫升；参见步骤 1.12。
  11. 将连同附着于子宫组织的绒毛膜羊膜包裹的胎儿置于盛有1×PBS溶液的培养皿中（3 - 5 mL）。  ml）。这些组织的水合将有助于从子宫壁上分离绒毛尿囊膜（参见步骤 1.14）。
  12. 使用精细尖头镊子，轻轻将蜕膜组织（白色至灰白色层）从胎盘表面剥离。操作此步骤时应小心谨慎，以保持胎盘和蜕膜组织的完整性。图1G).
  13. 将胎盘和蜕膜组织分别放入两个标记好的培养皿中，每个培养皿内加入1x PBS溶液（3 - 5 mL）。  各1毫升。
  14. 用精细镊子轻轻将子宫壁从绒毛尿囊膜上剥离。这些即为子宫组织。
  15. 将子宫组织置于盛有1x PBS溶液的培养皿中（3 - 5  毫升
  16. 重复步骤 1.8 至 1.15，直至处理完所有植入位点。
  17. 收集多个子宫、蜕膜和胎盘组织，以提高酶消化过程中细胞的得率。组织用量取决于每窝胎仔数量；然而，白细胞分离需要 >2 块组织
    注意：有关不同妊娠天数着床部位解剖的更详细信息，请参见第二章中的图片 小鼠妊娠研究指南42.

2. 子宫、蜕膜和胎盘组织解离

  1. 标记若干个无菌的2 ml锥形管，并注明相应的组织名称，同时将含有1,000 µl 酶解液的离心管置于冰上。
  2. 从盛有1x PBS溶液的培养皿中，转移两块（100 - 150 mg）子宫、蜕膜或胎盘组织至已标记的2 ml锥形管中。
  3. 向每个2 ml锥形管中加入500 µl预冷的酶解液。
  4. 使用无菌精细剪刀开始剪切浸没在酶解液中的组织，直至组织被充分剪碎。随着时间推移，悬液将呈现乳白色。此步骤不应超过2分钟，以避免对样本过度操作。
  5. 组织解离完成后，向每个2 ml锥形管中再加入500 µl预冷的酶解液。
  6. 将2 ml锥形管放回冰上。
  7. 对每种组织重复步骤2.2至2.6，直至所有组织均处理完毕。
  8. 将所有含有匀浆组织（剪碎的组织 + 酶解液）的2 ml锥形管从冰上转移至37 ºC培养箱中，并进行轻柔的轨道振荡（80 rpm），孵育30 - 35分钟。开始计时前，请确保培养箱温度已稳定。
  9. 孵育结束后，从培养箱中取出含有解离组织的2 ml锥形管，并立即置于冰上，以防止进一步消化。
  10. 根据组织类型标记无菌的50 ml锥形管，打开管盖并更换为无菌细胞筛网（孔径100 µm）。
  11. 使用约20 ml的1x PBS溶液，将2 ml锥形管中的解离组织通过细胞筛网过滤。组织碎片将滞留在筛网上，而细胞悬液则通过筛网进入50 ml管中。
  12. 使用移液管以20 ml的1x PBS溶液对细胞筛网中的解离组织进行2 - 3次洗涤。
  13. 用1 ml 1x PBS溶液冲洗空的2 ml锥形管，并将冲洗液倒入细胞筛网中。
  14. 从50 ml锥形管上取下细胞筛网，盖上管盖。在4 ºC条件下以1,250 x g离心10分钟。
  15. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。细胞沉淀中含有分离得到的白细胞和基质细胞。
  16. 将细胞沉淀重悬于1 ml不含胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中，轻轻混匀。请勿使用涡旋振荡器。
  17. 在5 ml聚苯乙烯塑料管中加入500 µl未稀释的FBS，然后缓慢地将细胞悬液铺加在其上方。
  18. 在室温下以1,100 x g离心10分钟，不启用刹车，使活细胞形成沉淀，而细胞碎片则保留在PBS/FBS界面处。
  19. 吸除上清液，注意不要触碰细胞沉淀。此时的细胞沉淀主要含有活细胞。
  20. 可选步骤：如需富集单个核细胞，可使用20%饱和多糖溶液，具体操作如下：
    1. 将细胞沉淀用不含FBS的RPMI培养基（1,000 µl）重悬。
    2. 在5 ml聚苯乙烯塑料管中加入1 ml 20%饱和多糖溶液，并根据生产商说明书，缓慢地将细胞悬液铺加在该溶液上方。加样过程中应避免20%饱和多糖溶液与细胞悬液混合。
    3. 使用摆动转子在室温下以500 x g离心30分钟，不启用刹车。关闭刹车至关重要，以防止细胞混合并破坏密度梯度。单个核细胞将位于20%饱和多糖溶液与1x PBS溶液之间的界面处。
    4. 吸除并弃去上清液。此时的细胞沉淀主要含有单个核细胞。
      注：如需进行活率染色和胞内染色，请参见步骤3；如需进行免疫表型分析，请参见步骤4；如仅进行活率染色和胞外染色，请参见步骤5；如需对分离的白细胞进行细胞培养，请参见步骤6；如需进行磁珠分选，请参见步骤7。

3. 可固定细胞的活力染色

  1. 将细胞沉淀重悬于 1,100 µl 的 1x PBS 溶液中。使用微量移液器轻轻混匀。
  2. 取 100 µl 细胞悬液转移至一个 5 ml 聚苯乙烯塑料管中，再向该管中加入 400 µl 的 1x PBS 溶液。此管作为组织自发荧光的对照。置于 4 ºC 保存，直至步骤 3.5。
  3. 将剩余的 1,000 µl 细胞悬液转移至一个新的 5 ml 聚苯乙烯塑料管中。加入 1 µl 活性染料，并轻轻混匀。于 4 ºC 避光孵育 30 分钟。
  4. 孵育结束后，加入 1,000 µl 的 1x PBS 溶液。用手轻轻混匀。
  5. 将两个 5 ml 聚苯乙烯塑料管（步骤 3.2 和 3.3）在 4 ºC 下以 1250 × g 离心 10 分钟。吸除并弃去上清液。
    注意：细胞沉淀（步骤 3.3）将在步骤 4 中使用；细胞沉淀（步骤 3.2）将作为组织自发荧光的对照。

4. 免疫表型分析

  1. 将细胞沉淀重悬于 50 µl 抗小鼠 CD16/CD32 抗体中（用 FACS 缓冲液 [0.1% BSA、0.05% 叠氮化钠、1× PBS 溶液，pH 7.4] 按 1:100 稀释）。轻轻混匀细胞悬液，切勿使用涡旋振荡器。
  2. 将细胞悬液置于 5 ml 聚苯乙烯管中，于 4 °C 避光孵育 10 分钟。
  3. 孵育结束后，向管中加入 50 µl 针对白细胞的单克隆抗体（识别细胞外表面标志物）或同型对照抗体（抗体稀释比例需预先验证）。例如，为分析白细胞亚群，可使用识别以下小鼠白细胞表面标志物的抗小鼠抗体：CD45、Ly6G、F4/80、CD11c、CD49b、B220、CD3、CD4 和 CD8（表 1）。
  4. 在向 5 ml 聚苯乙烯管中加入针对细胞外标志物的抗体后，轻轻混匀，于 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  5. 在上述孵育期间，如需进行后续步骤，请将固定缓冲液（用去离子水按 1:5 稀释）预热至 37 ºC，并在使用前于避光条件下保持在 37 ºC。
  6. 30 分钟孵育结束后，在 5 ml 聚苯乙烯管中加入 500 µl FACS 缓冲液，轻轻混匀。此步骤用于洗涤细胞并去除未结合的过量抗体。
  7. 在 4 °C 下以 1,250 × g 离心 10 分钟。吸除并弃去上清液。
    注意：若无需进行胞内染色，请参见步骤 5；若需进行胞内染色，则在此处进行通透和胞内染色操作，随后进行固定（步骤 4.8）。
  8. 向细胞沉淀中加入 500 µl 预热的固定缓冲液，于 37 ºC 避光孵育 10 分钟。
  9. 向 5 ml 聚苯乙烯管中加入 500 µl FACS 缓冲液，轻轻混匀。
  10. 在 4 °C 下以 1,250 × g 离心 10 分钟。吸除并弃去上清液。
  11. 向每个样本中加入 500 µl FACS 缓冲液。此时样本可用于流式细胞术分析。建议立即上机检测以获得最佳结果。

5. 不可固定细胞的活力染色

  1. 细胞表面免疫表型分析后，将细胞沉淀重悬于 500 µl FACS 缓冲液中。
  2. 上机前立即加入 1 µl 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，200 µg/ml）。
  3. 加入 DAPI 后 1 - 2 分钟内使用流式细胞仪检测样本。

6. 细胞培养

  1. 在无菌通风橱内准备工作站。使用水浴将 RPMI 培养基预热至 37 °C。
  2. 用 1000 µl FACS 缓冲液重悬细胞沉淀，用于细胞计数。
  3. 按照制造商说明书，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板及 0.4% 台盼蓝溶液对活细胞数量进行计数。记录总活细胞数。
  4. 在 4 °C 条件下以 1,250 × g 离心 10 分钟，去除 FACS 缓冲液。
  5. 用预热的 RPMI 培养基 500 µl 轻柔吹打 2 至 3 次，重悬细胞沉淀。
  6. 将所需数量的细胞接种于无菌 24 孔板中，在 37 °C 培养。培养时间根据具体研究问题确定。

7. 磁珠分选细胞

  1. 准备一个洁净的工作站，配备以下材料：MS 柱、磁性细胞分选器、15 ml 圆底离心管、30 µm 预分离滤器和多管架。
  2. 用 500 µl MACS 缓冲液（0.5% BSA，2 mM EDTA，1× PBS 溶液，pH 7.2）重悬细胞沉淀。
  3. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板，以及 0.4% 台盼蓝溶液，计数并记录总活细胞数。
  4. 在 4 °C 条件下以 1,250 × g 离心 10 分钟。吸除并弃去上清液，加入 500 µl MACS 缓冲液。
  5. 按照制造商的建议进行磁性分离操作。
  6. 通过流式细胞术或显微镜检测纯度。

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结果

在图1中展示了从小鼠母胎界面分离组织的过程；该操作包括打开腹腔（图1A,B）、子宫角（图1C），包括着床部位（图1D），以及在16.5天妊娠期（dpc）收集子宫组织（图1E）、胎盘（图1F）和蜕膜组织（图1G）。图2展示了在16.5 dpc时通过磁性细胞分选法从蜕膜和子宫组织中分离得到的巨噬细胞（F4/80+）的形态。分离得到的巨噬细胞保持分泌细胞因子的能力（数据未显示）。从蜕膜、子宫和胎盘中分离获得的活细胞产量如图3所示，所有组织中细胞活力均高于70%。图4展示了在单细胞和活细胞门控范围内分析多形核和单核白细胞的设门策略，包括T细胞（CD45+CD3+）、中性粒细胞（CD45+Ly6G+）、巨噬细胞（CD45+F4/80+）、树突状细胞（CD45+CD11c+）和NK细胞（CD45+CD49b+），检...

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讨论

系统收集记录母胎界面浸润性白细胞丰度及其表型特征的一致性数据，对于理解妊娠相关并发症的发病机制至关重要。已有多种技术被用于从妊娠期间小鼠母胎界面组织中分离浸润性白细胞31,38,39,43-46。然而，这些技术各不相同，所使用的酶或酶组合不同，解离时间各异，未明确说明组织用量，更重要的是，并未始终提供所分离细胞的存活率信息。本文所述方案可实现从小鼠母胎界面组织中高存活率地分离浸润性白细胞，并提供了经实验室验证的商用试剂、缓冲液配制、组织用量及孵育时间的详细信息。

白细胞分离过程中最关键的步骤之一是组织解离；该步骤涉及机械匀浆和/或酶促反应，可能会影响用于表型鉴定的细胞外蛋白的完整性47。本文所述方案提供了一种新方法，结合使用温和的机械和酶法组织解离技术，以保持从小鼠胎盘以及蜕膜和子宫组织中分离出的白细胞表面细胞外标志物的完整性。

单个酶或不同酶的组合已被用于从母胎界面的小鼠组织中分离浸润性白细胞31,32,39,44。在许多情况下，这些在实验室中手工配制至特定浓...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

NGL 得到了韦恩州立大学母婴、围产期及儿童健康围产期计划的支持。我们衷心感谢韦恩州立大学的 Maureen McGerty 和 Amy E. Furcron 对本稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磁性细胞分离
MS 柱Militenyi Biotec130-042-201
细胞分离器Militenyi Biotec130-042-102
30 μm 预分离滤器Militenyi Biotec130-041-407
多柱支架Militenyi Biotec130-042-303
15 ml 锥形管Thermo Fisher339650
MACS 缓冲液Militenyi Biotec实验室配制(0.5% 牛血清白蛋白, 2 mM EDTA 和 1× PBS, pH 7.2)
试剂
Accutase 酶解液Life TechnologiesA11105-01
抗小鼠 CD16/CD32 抗体BD Biosciences533142
抗小鼠细胞外抗体BD Biosciences/eBiosciences表 1
叠氮化钠FisherS227-500
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
LIVE/DEAD 活性染料Life TechnologiesL23105
固定缓冲液BD Biosciences558049
FACS 缓冲液BD Biosciences实验室配制0.1% BSA, 0.05% 叠氮化钠, 1× PBS, pH 7.4
0.4% 台盼蓝溶液BIO-RAD145-0013
胎牛血清 (FBS)Life Technologies16000-044
其他仪器
带摇床的培养箱Thermo ScientificMaxQ 4450
流式细胞仪BD LSRFortessa
离心机Thermo ScientificLegend LXTR
真空系统实验室自制
培养箱Thermo ScientificIncubator 3307
水浴锅Precision51221035
细胞计数仪BIO-RADTC20 自动细胞计数仪
光学与荧光显微镜Zeiss 和 OlympusZeiss LSM780 和 Olympus CKX41

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