原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

摘要

我们介绍一种制备支撑脂双层的方案，并利用原子力显微镜和力谱技术对其进行表征。

摘要

原子力显微镜（AFM）是一种多功能、高分辨率的成像技术，可用于观察生物膜。该技术具有足够的放大能力，能够检测膜的亚结构甚至单个分子。AFM 还可作为力探针，用于测量膜的相互作用及机械特性。在 AFM 研究中，通常采用支撑脂双层作为膜模型。在本实验方案中，我们将演示如何制备支撑脂双层，并利用原子力显微镜对其结构和机械性能进行表征，包括脂双层厚度和穿刺力。

原子力显微镜成像和力谱技术提供的信息有助于确定膜的机械和化学特性。这些特性在细胞过程中发挥着重要作用，例如维持细胞在环境压力下的稳态、促使膜蛋白聚集以及稳定蛋白质复合物。

引言

原子力显微镜（AFM）通过使用带有极尖锐针尖的悬臂扫描样品表面的特定区域，从而生成表面图像¹。悬臂的运动可探测样品的表面形貌。由于AFM能够在空气环境中分析固定样品，或在液体环境中接近天然状态下进行分析，具有高度的适用性，因此已被广泛应用于蛋白质、DNA和膜等生物分子的研究^2-5。

除了在纳米尺度范围内具有高分辨率成像能力外，原子力显微镜（AFM）的悬臂还可作为弹簧，用于探测样品的相互作用力（粘附力与排斥力）以及机械性能^5,6。这一技术被称为力谱法。在此模式下，探针首先接近样品并对样品施加作用力，随后撤回直至与样品失去接触（图1A）。所生成的曲线显示了悬臂在接近和撤回过程中力随距离的变化关系。由此可推导出多种性质，包括用于衡量材料刚性的弹性模量以及粘附力等。

支撑脂双层是一种位于固体基底上的生物模型膜，通常以云母、硼硅酸盐玻璃、熔融石英或氧化硅作为基底⁷。可通过多种技术制备支撑脂双层，如囊泡沉积法、Langmuir-Blodgett法和旋涂法^8,9。原子力显微镜（AFM）成像已被用于监测这些支撑脂双层的形成过程¹⁰，以及探测不同组分膜所形成的多种结构^11-15。

在支撑双层膜上进行力谱测量会在接近曲线中产生一个峰值。该峰值表示穿透双层膜所需的力，称为穿透力。双层膜的厚度也可通过力曲线进行测量⁶。双层膜的典型穿透力范围为1–50 nN⁶。这些性质取决于脂质的堆积状态（液相或凝胶相）和结构（酰基链长度及不饱和度），并可受膜活性物质的影响而改变¹⁶。关于膜破裂的理论已有阐述¹⁷，其他实验参数如悬臂刚度、针尖半径和接近速度也会影响穿透力的大小^15,16,18。力谱技术已被用于分析不同脂质相的性质^11,19、组成依赖性变化^12,20，以及多肽等其他生物分子对膜稳定性的影响²¹。

支撑双层膜的平坦取向有利于将原子力显微镜（AFM）与其他方法（如表面等离子共振²²和荧光显微镜^11,19）相结合，从而更全面地表征膜的结构与性质。

本详细视频实验方案旨在通过囊泡沉积法制备支撑脂双层，并利用原子力显微镜（AFM）和力谱技术对其进行分析。尽管可使用不同尺寸的囊泡制备脂双层，本方案重点介绍小单层囊泡和大单层囊泡的应用。已对相分离为液态有序相（L_o）和液态无序相（L_d）的支撑脂双层进行了表征^11,15。该膜由二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）、鞘磷脂（SM）和胆固醇（Chol）按2:2:1的比例组成。此组分模拟了脂筏结构，脂筏被认为可作为蛋白质转运与分选、细胞信号传导及其他细胞过程的重要平台^23,24。

方案

1. 支持性脂双层（SLB）的制备^11,12,21

1. 脂质混合物与多层囊泡悬浮液的制备
   1. 提前配制以下缓冲液。
      1. 配制 PBS 缓冲液，其浓度为 2.7 mM KCl、1.5 mM KH₂PO₄，8 mM Na₂HPO₄，以及 137 mM NaCl，pH 7.2。
      2. 配制含150 mM NaCl、10 mM HEPES、pH 7.4的SLB（支撑脂双层）缓冲液。
      3. 配制 1 M CaCl₂ 溶液₂.
   2. 将以下脂质溶解于氯仿中，达到所需浓度：例如，二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）25 mg/ml，鞘磷脂（SM）25 mg/ml，胆固醇（Chol）10 mg/ml。
   3. 取18.38 µl DOPC、17.10 µl SM和11.30 µl Chol，配制成总脂质质量为1 mg、摩尔比为2:2:1（DOPC:SM:Chol）的溶液。根据步骤1.1.2中所配脂质的浓度，相应调整各脂质体积，但须保持DOPC:SM:Chol的摩尔比为2:2:1，因为改变摩尔比将改变膜的相态特性²⁵.
   4. 通过涡旋充分混匀溶液。如需通过荧光显微镜观察双分子层，可加入终浓度为0.05 mol %的荧光脂质染料。
      注意：长链双烷基碳菁类染料家族（如 DiD、DiI 和 DiO）可覆盖广泛的波长范围，非常适合用于标记脂质膜。 alternatively，也可使用荧光标记的脂质，如罗丹明-磷脂酰乙醇胺（rhodamine-phosphatidylethanolamine）或 BODIPY-胆固醇（BODIPY-cholesterol）。无论采用何种染料，均应根据显微镜设置优化染料浓度，需注意与脂质结合的荧光探针浓度过高时可能改变脂质的行为。¹⁹.
   5. 使用 N₂ 吹干氯仿₂ 气体（或任何可用的惰性气体，如 Ar 和 He）。
   6. 在真空条件下进一步干燥脂质混合物至少1小时。
      注意：若需储存该脂质混合物，应用惰性气体（N₂）吹扫去除空气₂，Ar 或 He）并置于 -20 °C 保存。将过量的氯仿脂质分装至小型棕色小瓶中，以与脂质混合物相同的方式干燥，用惰性气体（N₂，Ar 或 He）并在 -20 °C 下保存。
   7. 将干燥的脂质溶解于PBS缓冲液中，浓度为10 mg/ml。
   8. 剧烈涡旋混合物约20秒至1分钟，直至形成含有多层囊泡的浑浊悬液。确保瓶壁无脂质膜残留。
   9. 将该悬液分装为每份10 µl（1 mg脂质可分装为10份）。
   10. -20 °C 保存，以备后续使用。
2. 单层囊泡的制备
   注意：可采用超声法或挤压法来制备不同大小的单层囊泡。超声法利用声能震荡混合物，使多层囊泡悬浮液的层状结构分离，这一过程以浑浊悬浮液变得澄清为标志。挤压法则迫使多层囊泡通过具有特定孔径的膜滤器。
   1. 超声处理法
      1. 取10 µl多层脂质悬浮液，加入150 µl SLB缓冲液。
      2. 将混合物转移至小型（2 ml）带盖玻璃小瓶中，并用帕拉膜密封。
      3. 在室温下使用水浴超声仪对混合物进行超声处理10分钟，或直至溶液变澄清，以制备小单层囊泡（SUVs，直径小于50 nm）。
   2. 挤出法
      1. 取10 µl多层脂质悬浮液，加入150 µl SLB缓冲液。
      2. 将悬液转移至冻存管中。
      3. 将冻存管浸入液氮中数秒，冷冻脂质悬浮液。
      4. 将冻存管置于室温或37 °C水浴中浸泡数分钟，以解冻脂质悬浮液。重复冻融步骤至少10次。
      5. 为了挤出脂质悬浮液，使用孔径为200 nm的聚碳酸酯膜（也可使用其他孔径，如100 nm或400 nm）和商用挤出装置²⁶.
         注意：目前市面上有两种商用挤出装置：一种手动挤出装置适用于小体积样品（200 µl 至几 ml）。在此情况下，通过手动将悬浮液在两个注射器之间来回推挤，使样品透过膜完成挤出。根据制造商的不同，可能需要合并脂质样品以达到设备所需的最小体积。对于较大体积（最高达 50 ml），则使用更复杂的装置，利用压缩气体将悬浮液强制通过聚碳酸酯膜。装置的设置和挤出条件可能因型号而异。使用前请参考制造商提供的说明书。本实验方案适用于小体积样品的手动挤出装置。
      6. 通过将水通入挤出器，使挤出器在水中平衡。将膜浸入水中。
      7. 将膜置于两个活塞之间，组装装置，并通过将缓冲液从一个注射器经挤出器推至另一个注射器，使装置在缓冲液中平衡。 此步骤还可用于进一步检测系统的密封性。若发现泄漏，应拆解装置并更换膜后重新组装。
      8. 使用挤出器的一支注射器（“污染侧”）吸取脂质悬浮液。
      9. 将装有脂质悬浮液的注射器连接至一侧腔室，另一侧腔室连接空注射器。
      10. 将注射器推入一端，使溶液穿过膜进入对侧的注射器。这是第1步^st 通过。
      11. 通过膜反复推注共31次，使溶液最终位于相对侧的注射器（“洁净侧”）。
          注意：挤出后检查膜是否破损。若膜已破裂，则表明挤出过程未成功，需重复该步骤。
      12. 将注射器中的液体排入小离心管中。大型单层囊泡（LUVs）在4 °C保存时可保持稳定1-2天。
3. 云母片与盖玻片的制备
   1. 先用清水清洗盖玻片，再用乙醇清洗，然后晾干。
   2. 取云母片，用胶带剥离其外层。
   3. 将云母圆盘粘附到盖玻片上。建议使用透明光学胶，以便可用荧光显微镜观察双层膜结构。
   4. 使用光学胶/润滑脂将塑料圆筒（外径 2.5 cm，内径 2 cm，高度 0.5 cm）固定。确保所有连接处密封，无泄漏。若需重复使用圆筒，应使用润滑脂，以便将其从盖玻片上轻松拆下并清洗。塑料圆筒的尺寸取决于原子力显微镜（AFM）悬臂夹具的大小，应相应调整。
4. 单层囊泡在固体基底上的沉积
   1. 将全部脂质体溶液直接用移液器转移至云母表面。加入更多SLB缓冲液，使总体积达到300 µl。
   2. 加入0.9 µl的1 M氯化钙溶液，使终浓度达到3 mM Ca²⁺.
   3. 37 °C 孵育 2 分钟，然后 65 °C 孵育至少 10 分钟。双分子层始终用缓冲液覆盖。接触空气或产生气泡会将其破坏。孵育过程中可根据需要补充缓冲液，尤其是在较高温度下孵育时。
      ​注意：孵育温度根据所需的脂质混合物和相态而异。形成支撑双层膜至少需要10分钟的孵育时间，但具体时间可能更长，取决于温度和组分。
   4. 用预热至65 °C的SLB缓冲液清洗双层膜15–20次，以去除钙离子和未融合的囊泡。清洗过程中需格外小心，确保双层膜始终浸没在缓冲液下，并轻柔地用移液器加样，避免破坏双层膜结构。
   5. 在进行原子力显微镜（AFM）测量前，将支撑双层膜冷却至室温。此步骤旨在形成膜的不同相态，并尽量减少仪器中的热漂移。

2. 原子力显微镜测量^11,12

1. 成像
   注意：在接触模式或轻敲模式下进行原子力显微镜成像。在溶液中对支撑双层膜进行成像；切勿让溶液完全蒸发，否则会破坏双层膜结构。由于实验中使用缓冲液，请注意采取安全措施，确保原子力显微镜的任何部件均避免液体溅洒。
   1. 选择一个较软的悬臂梁（建议弹簧常数低于 0.2 N/m），并将其安装到原子力显微镜上。悬臂梁刚度的选择在力谱测量中更为关键（这将在后文讨论）。
   2. 将样品安装至原子力显微镜载物台上，并确保所有隔振模块均已开启。等待至少 15 分钟，以使系统达到平衡并减少热漂移。根据原子力显微镜的具体配置，调谐和成像参数可能有所不同，请参考制造商提供的操作手册。
   3. 使原子力显微镜探针接近样品直至接触。
   4. 由于脂双层通常高度为 4 nm，应使用仪器中能提供最高 z 轴分辨率的 Z 范围（例如 1.5 µm）。
   5. 选择成像区域。为获得脂双层的整体形貌，可从 50 µm × 50 µm 或 25 µm × 25 µm 的区域开始成像。若发现更小的结构特征，可进一步在更小区域（如 10 µm × 10 µm 或 2 µm × 2 µm）进行成像。成像区域的选择也取决于压电扫描器的工作范围，请查阅仪器说明书以确定合适参数。
   6. 由于双层膜极为脆弱，在成像过程中应调节原子力显微镜探针的设定点，以保持作用力最小，同时校正热漂移，并维持与样品的接触。在接触模式下，应尽量降低设定点；在轻敲模式下，则应尽量提高设定点。
   7. 使用原子力显微镜制造商提供的专用软件，通过将每条扫描线拟合至多项式调平函数来处理图像。对于在扫描过程中失去与膜接触的扫描线，应使用该软件进行去线处理。
2. 力谱测量
   1. 按照制造商的操作规程校准悬臂梁。校准可将光电二极管的电信号转换为力（图 1B）。
      1. 校准探针的灵敏度，以测量其在 z 压电驱动下的位移（以长度单位表示），而非以伏特为单位的电信号。
         注意：原子力显微镜通过检测聚焦于悬臂梁背面的激光反射变化来感知悬臂梁的弯曲程度。激光照射到一个可空间分辨激光光斑位置的光电二极管上。当悬臂梁因接触样品而发生弯曲时，光电二极管会检测到这种变化，称为“垂直偏转”，其单位为电压。由于悬臂梁由 z 压电驱动器移动，因此垂直偏转与 z 方向的位移相关。垂直偏转与 z 位移之间的比值称为灵敏度，用于将电压信号转换为距离。
      2. 使用热噪声频率法计算悬臂梁的弹簧常数，该方法通常已集成于原子力显微镜软件中。该方法通过绘制噪声引起的振动幅度随振荡频率的变化关系，生成功率谱密度图。该图在共振频率附近会出现一个峰值，振幅最大的频率即为共振频率。通过在该峰值周围拟合洛伦兹函数，软件可自动计算弹簧常数。有关热噪声法理论的一些有用参考资料见文献^27–30。
   2. 在对双层膜某一区域完成成像后，选择双层膜中一个 5 µm × 5 µm 的区域进行力谱测量。
   3. 设置原子力显微镜，在该区域内以 16 × 16 的网格采集力曲线，从而获得每个区域共 256 条力曲线。相邻两点之间的间距应足够大，以避免一个测量点探测的膜区域与下一个点重叠。该间距取决于探针半径，两点之间 100 nm 的距离较为理想。将 5 µm × 5 µm 区域划分为 16 × 16 的网格。根据相态大小的不同，也可选择更小或更大的区域，并相应调整网格尺寸。
   4. 设置 z 压电位移为 400 nm。该参数决定了 z 压电驱动的最大移动范围，应足够大以确保在每次测量之间悬臂梁能完全从样品表面撤回。
   5. 设置接近速度为 800 nm/sec，回撤速度为 200 nm/sec。可根据所研究的双层膜组成和脂质相态，选择 400 至 6,000 nm/sec 之间的接近速度^6,16。
   6. 在完成所有参数设置后，点击原子力显微镜软件中的“运行”按钮，开始采集力曲线。
   7. 将力曲线保存为力-高度曲线（反映 z 压电驱动的位移）。此形式未考虑探针接触样品时悬臂梁的弯曲。在数据处理阶段，原子力显微镜软件可对悬臂梁弯曲进行校正，得到力-针尖-样品分离距离曲线（图 1C），从而获得准确的双层膜厚度值。校正参数通常已包含在校准过程中，并随每条力曲线一同保存。通过从某一点的压电位移中减去垂直偏转量，即可计算出针尖-样品分离距离。
      注意：在接近阶段的力曲线中出现的峰值（即使悬臂梁仍在接近过程中，力值已开始下降），即为膜的穿透力；而该峰值位置与力值重新开始上升的位置之间的差值，则反映了膜的厚度。
   8. 每种实验条件下至少采集 500 条力曲线，以获得良好的统计结果。使用 Origin 或 MatLab 等软件绘制数值直方图，并将直方图拟合为高斯分布，以获得分布的峰值和宽度。

结果

由 DOPC:SM:Chol (2:2:1) 组成的支持性脂双层通过原子力显微镜（AFM）成像（图 2 A-C）。由于脂质组成，观察到富含 SM/Chol 的 L_o 相和富含 DOPC 的 L_d 相。AFM 成像获得的高度轮廓可提供关于膜结构的重要信息。通过分析高度轮廓，可测量膜存在缺陷时的双层厚度（图 2B），或提供 L_o 与 L_d 相之间的高度差异。此外，AFM 可用于特异性选择代表这些相的区域，并利用力谱法分析其机械性能（图 2 D-F）。力谱模式获得的力曲线用于测量穿透力，即通过确定力曲线上峰值处的力值来获得（图 2D 和 E）；膜厚度则通过从力曲线峰值处的距离值减去力曲线重新开始上升时的距离值得出（图 2D 和 F）。

讨论

在氯化钙诱导囊泡吸附并破裂后，于云母表面形成了由 DOPC:SM:Chol (2:2:1) 组成的支撑脂双层膜（SLB）。该脂质组分分离为液态无序相（L_d）和液态有序相（L_o）。L_o 相富含鞘磷脂和胆固醇，流动性较低/黏度较高，相较于 L_d 相更为致密（图 1A）¹¹。L_o 相与 L_d 相的分离表现为高于周围区域的环形结构（图 1B, C）。这些平台区域为 L_o 相，周围则被 L_d 相包围。膜缺陷（或膜上的孔洞）也可见到（图 1B，蓝色箭头），跨越该缺陷的高度剖面可显示双层膜的厚度。通过原子力显微镜（AFM）高度剖面也可观察 L_d 与 L_o 相之间的高度差异（图 1C）。

脂质混合物的制备非常重要，因为其组成决...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	以冻干粉末形式提供于密封小瓶中。开启后，将全部粉末溶于氯仿。额外部分应储存为干燥的脂膜，在惰性气体氛围下，于 -20 °C 保存。有关储存和操作的更多信息，请访问 此处。
鞘磷脂（脑源，猪源）	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	以冻干粉末形式提供于大型密封塑料容器中。开启后，取少量粉末溶于氯仿。额外部分应储存为干燥的脂膜，在惰性气体氛围下，于 -20 °C 保存。有关储存和操作的更多信息，请访问 此处。
胆固醇	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	以冻干粉末形式提供于大型密封塑料容器中。开启后，取少量粉末溶于氯仿。额外部分应储存为干燥的脂膜，在惰性气体氛围下，于 -20 °C 保存。有关储存和操作的更多信息，请访问 此处。
氯化钠 (NaCl)，99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
氯化钾 (KCl)，88%	Sigma	P9541
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)，>99%	AppliChem GmbH	A1046
磷酸二氢钾 (KH2PO4)，99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
二水合氯化钙 (CaCl2)，分子生物学级	AppliChem GmbH	A4689
HEPES，分子生物学级	AppliChem GmbH	A3724
玻璃盖玻片，24 × 60 mm，厚度 1 mm	Duran Group	2355036
冲压模具套装	Precision Brand Products, Inc	40105
光学胶	Norland Products, Inc.	NOA 88	一种液体胶，在长波长紫外光照射下固化。
[header]
云母块	NSC Mica Exports Ltd.		这些云母片面积至少为 1 平方英寸，厚度介于 0.006 英寸至 0.016 英寸之间。公司会将其切割为特定尺寸以便运输。可使用冲压模具套装从小块云母上冲出小型云母圆片。  始终使用手套或镊子操作云母。
实验室设备润滑脂	Borer Chemie AG	Glisseal N
脂质体挤出仪	Avestin	LiposoFast-Basic	也可考虑 Northern Lipids, Inc. 提供的替代产品。
胶带	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1英寸)
超声波清洗机	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	无加热功能，频率：35 kHz，超声峰值输出：160 W，高频功率：40 W。（数据表）
氮化硅原子力显微镜悬臂梁	Bruker AFM Probes	DNP-10	每个悬臂梁有四个探针尖端，标称尖端半径为 20 nm（最大可能为 60 nm）。根据规格说明，我们使用共振频率为 18 kHz、标称弹性系数为 0.06 N/m 的 D 号探针。
原子力显微镜 (AFM)	JPK	JPK Nanowizard II 安装于 Zeiss Axiovert 200