标本定位标签（SpOT）的用途是作为定位工具，以辅助在多组织石蜡包埋块中进行单个组织的识别。这些方案展示了如何使用常见且低成本的组织学材料轻松构建该标签，并证明其在石蜡包埋块及切片中可作为可靠的可视标记物。
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摘要
摘要
多组织石蜡包埋块可实现高通量分析，提高实验效率，增强实验一致性，并减少时间和成本。组织芯片构成了多组织石蜡包埋块的主体，但越来越多的研究人员开始使用非阵列式包埋块，其中包含来自多个个体的较大组织样本，这类包埋块可在无需大量投入规划和设备的情况下，提供与组织芯片相似的诸多优势。任何多组织分析的关键环节在于用于识别每一份独立组织的定位方法。尽管已有若干方法可用于维持多组织包埋块中各组织的正确方位和识别，但大多数方法并不适用于非阵列式包埋块，可能占用阵列中的宝贵空间，和/或在常规组织学实验室中难以制备。标本定位标签（Specimen Orientation Tag, SpOT）是一种简单、低成本的定位工具，在石蜡包埋块及所有组织切片中均清晰可见，可为阵列式和非阵列式布局中的标本提供可靠的识别。SpOT 在非阵列式包埋块的应用中优于现有定位方法，因其无需对组织本身进行任何直接改造，且允许组织片段排列方式具有更高的灵活性。
引言
将多个个体的组织样本包埋于同一个石蜡块中，可实现不同处理组及个体间的并列比较，消除切片间的变异，并降低样本切片与染色的成本和工作量。这类多组织石蜡块通常以组织微阵列（TMA）形式制备，或采用非阵列布局将多个个体的组织包埋于同一石蜡块中。在任何多组织分析中，维持样本身份的准确性至关重要。自TMA技术问世以来，研究人员一直利用其提高分析效率、减少切片间差异、节约珍贵的组织资源，并降低实验的时间与成本1。TMA的正确取向可通过多种方法实现，包括使用空白区域、在组织芯之间设置行或列间隔2-4、不对称排列组织芯组3,5（例如，对照组 vs. 处理组）、设置“信标”组织芯6，以及在TMA矩阵外部设置特定的取向标识组织芯3。尽管这些方法在TMA中效果良好，但多数方法会占用宝贵的TMA组织芯空间，且随着时间推移组织芯逐渐耗尽，带有空隙或间隔作为标识的TMA可能变得难以辨认。此外，这些方法不适用于非阵列格式的多组织石蜡块，因为它们依赖于高度有序的微阵列组织芯排列中的异常模式作为识别标志。大多数非阵列式多组织石蜡块需容纳形态不一的组织，且本质上不具备规则的阵列网格结构，因此无法使此类异常特征明显呈现为定位标志。
尽管使用组织芯片（TMA）具有多种优势，但其最主要的缺点之一是芯样尺寸较小，对于高度异质性的组织而言，往往不具备充分的代表性1。非阵列式多组织块保留了TMA的诸多优点，但包含更大的组织样本，或来自动物实验的完整器官。使用单个芯样的组织微阵列在不同目标蛋白上的检测结果与整张组织切片的一致性存在差异，许多情况下需要多个芯样以提高一致性7-11。由于某些生物标志物表型具有复杂性和异质性，即使使用大量芯样（>10）的TMA仍可能不足，需采用微阵列以外的方法进行分析8。此外，TMA的构建过程耗时较长，技术要求高，且需要初期投入购买组织芯片仪或获得使用权限。相比之下，非阵列式多组织块可在任何基础实验室中制备，所需时间和工作量显著减少，对于需要比芯片更多组织量的研究，或为降低成本、简化分析流程的情况，是一种有效的替代方案。
非阵列式多组织块同样需要可靠的定位标记来追踪样本身份，然而这类标记的开发却十分有限。现有文献中描述的组织定位方法主要集中于单个组织样本包埋时的正确生理学方向，例如使用墨水对组织进行纹身标记12、在处理前将组织预先包埋于琼脂-明胶中13，或通过切口14或缝线15对特定组织进行标记。尽管这些方法具备一定功能，但由于存在局限性，它们并不适合作为多组织块中的标记。缝线在切片过程中会很快被切过，可能无法在每一张切片中都可见；使用琼脂-明胶的预包埋技术虽可在处理和包埋过程中保持组织的正确方向，但无法在石蜡块及切片中提供视觉提示以区分多个样本；组织上的切口或染料可能干扰分析，或遮蔽重要的形态学细节。另一种方法是通过将组织样本以非对称方式包埋来维持非阵列式多组织块中的组织身份识别，但该方法需要至少3个或更多的组织样本，且可能无法实现组织在分析时的最佳排列方式。
标本定向标签（SpOT）作为一种简便且低成本的方法，可清晰识别多组织石蜡块中的不同组织，相较于现有的定向方法具有诸多优势。SpOT 是一种微小而色彩鲜艳的核心结构，由羟乙基琼脂糖包埋处理凝胶和组织标记染料组成，并浸润有石蜡（图2C）。在多组织石蜡包埋块中，SpOT 核心被端对端地包埋于某一单个组织旁，在石蜡块及其所有切片中均呈现为一个明亮的色点（图1A-D），从而明确指示出包埋块及切片的正确方向，便于组织的快速识别。
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方案
1. SpOT 的构建
- 在15 ml锥形管或2 ml微量离心管中，将50 mg牛血清白蛋白（BSA）加入1 ml组织标记染料中，涡旋振荡1分钟，或直至完全溶解。
注意：本实验方案中请使用生化级BSA。尽管其他级别和纯度的BSA尚未经过测试，但预计其级别和纯度对SpOT实验的成功影响不大。 - 将9 ml羟乙基琼脂糖处理凝胶置于15 ml锥形管中，在微波炉中以30%功率每次加热10秒，直至凝胶完全融化。
- 将融化的处理凝胶与染料-BSA溶液合并至同一15 ml锥形管中，用移液器充分混匀，随后涡旋振荡混合液。
- 将锥形管放入冰箱中数小时，或直至凝固成块。
- 使用长而细的金属刮刀或探针，轻轻将着色的凝胶块从锥形管中取出。
- 使用手术刀或剃刀刀片将凝胶块横向切成5 mm厚的片状。去除两端的弧形部分，并作为废弃物处理（图2A）。
- 将凝胶片平放于组织学包埋盒中，浸入70%乙醇中固定1小时。在24小时内每2–4小时更换一次70%乙醇，至少更换3次。
- 手动将凝胶片依次通过乙醇梯度脱水（每步1小时：70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇（更换3次）），然后用透明剂透明处理3次（每次1小时）（例如，本实验方案中使用脂肪族碳氢化合物（二甲苯替代品），但二甲苯也可接受），最后用熔融石蜡浸蜡处理3次（每次1小时），可手动操作或使用组织处理机进行。
注意：在完成100%乙醇完全脱水前，染料可能从凝胶片中渗出，从而影响自动组织处理机中的其他组织样本及液体试剂。因此，强烈建议采用手动处理方式，但自动化处理同样有效。 - 采用标准石蜡包埋方法将多个处理后的凝胶片进行包埋（图2B）。待蜡块冷却硬化后，恢复至室温。
- 使用所需尺寸的皮肤穿孔针头，从包埋的凝胶块中取出SpOT核心，直至耗尽整个蜡块（图2C）。单个蜡块最多可提供约20个2 mm2的核心。将核心储存在阴凉处。本实验方案中使用的皮肤穿孔针头见图示：1.5 mm（图1D和2D）或2 mm（图1B、1C和2C）。
2. 使用 SpOTs 定向非阵列块
- 绘制组织定位图，以标明所有待共同包埋的各个组织块的预期位置和身份，以及 SpOT 的位置。
注：组织定位图是一张示意图，包含所有组织块的物理位置，并以标识符进行标注，同时标明 SpOT 的位置。该图可电子绘制，也可手绘。应根据使用最终产品的技术人员和研究人员的偏好选择最合适的绘制方式。此图将作为研究人员的参考指南，以便在显微镜分析期间轻松识别样本。本方案中使用的图是手绘的，展示了组织包埋块和玻璃载玻片，其中每个组织块和 SpOT 的位置均按实际包埋块和载玻片中的位置绘制并标注。 - 正常处理组织块，确保在整个大体检查和处理步骤中始终保持正确的标识。本方案中，将组织依次在以下试剂中各处理 1 小时：70% 乙醇、80% 乙醇、95% 乙醇、100% 乙醇（更换 3 次）、脂肪族碳氢化合物（二甲苯替代物）（更换 3 次）以及 60 °C 的熔融浸蜡石蜡（更换 3 次）。
注：所有组织应按照标准组织学实验室程序进行处理。具体步骤可能因实验室操作、组织大小和类型而异，但这不会影响 SpOT 作为定位工具的使用效果。 - 根据组织定位图，在包埋台上将组织块按指定的正确位置排列。以组织定位图为参考，指导技术人员在每个包埋块中如何摆放 SpOT 和组织块。
注：在本方案中，包埋技术人员将手绘的定位图放置在包埋台旁，并在包埋台上以与图中完全相同的排列方式放置组织块。这确保了所有组织块在最终产品中仍可被准确识别。这对于多组织块的成功使用至关重要。 - 确保 SpOT 芯的高度高于所有将被包埋在块中的组织块。
- 根据组织定位图所示的正确位置，采用标准包埋方法，先包埋组织块，再将 SpOT 以末端（横切面）朝下方式包埋。必要时，用镊子扶住 SpOT，直至石蜡充分凝固，使 SpOT 不再倾倒（约 1–2 分钟）。
- 使用标准方法对含有 SpOT 的石蜡切片进行切片和染色。
- 将切片置于 40 °C 的水浴中展平，并贴附于带正电荷的玻璃载玻片上（未测试无电荷载玻片）。将载玻片置于 60 °C 的烘箱中干燥至少 20 分钟。
- 将载玻片放入自动染色机，依次通过以下试剂：二甲苯（二甲苯 1：5 分钟，二甲苯 2 和 3：各 2 分钟）、100% 乙醇（2 分钟）、95% 乙醇（1 分钟）、80% 乙醇（30 秒）、70% 乙醇（30 秒）、流动自来水（2 分钟）、苏木精（1.5 分钟）、流动自来水（3 分钟）、酸性乙醇（1 分钟）、流动自来水（2 分钟）、蓝化试剂（1 分钟）、流动水（2 分钟）、80% 乙醇（30 秒）、伊红（1 分钟）、流动水（10 秒）、80% 乙醇（1 分钟）、100% 乙醇（更换 3 次，每次 2 分钟）、二甲苯（更换 3 次，每次 30 秒）。
- 用中性树胶封片，加盖玻璃盖玻片。
注：在本方案中，组织技术人员使用切片机将石蜡包埋块切成 5 µm 厚的切片。本方案使用了自动染色机，但手动染色也可获得同等效果。
3. 组织微阵列中的 SpOT（手动组织微阵列试剂盒）
- 按照 2.1 节所述方法创建组织定位图，并确定 SpOT 的预定位置。
- 在包埋仪上将熔化的石蜡倒入 TMA 模具中。当模具开始冷却时，根据组织定位图所示的预定位置，将 SpOT 垂直嵌入 TMA 模具的边缘区域。必要时，用镊子夹住 SpOT 保持直立，直至石蜡充分固化，确保 SpOT 不再倾倒（约 1–2 分钟）。
- 根据制造商的说明，并结合 SpOT 在阵列边缘的位置（图 2D），组装 TMA 芯片，并按照标准切片和染色流程进行操作。
注：有关本方案中所用切片和染色方法的详细信息，请参见步骤 2.6。
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结果
SpOT 在石蜡包埋块中呈现为一个圆形、颜色鲜艳的圆点（图1A 和 2D），在所有石蜡切片中均可见，并且在经过 H&E 或免疫组化染色过程后仍保留在玻片上（图1B–1D 和 2D）。这一明显的视觉标记有助于组织技术员和研究人员识别每一块独立的组织样本，并简化沟通：技术员可利用该视觉标记向在显微镜下观察玻片并收集数据的研究人员说明组织样本的排列方式。提供给研究人员的玻片应附带组织方位示意图，并详细解释，以确保显微分析过程中无任何混淆。图2A 显示了固化后的有色琼脂糖凝胶块切片的结果。图2B 显示了将切好的琼脂糖凝胶块包埋于石蜡块中的结果。图2C 显示了使用皮肤打孔器制备 SpOT 核心的结果。
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讨论
成功制备和使用 SpOTs 需要严格遵循若干技术步骤。羟乙基琼脂糖的融化应缓慢进行，并使用低温加热。若在高温下快速融化，可能导致琼脂糖部分降解，从而影响最终效果。在将含染料的凝胶块切割成小块以进行后续处理时，应确保每块厚度大于 4.5 mm 且不超过 7 mm。两端的圆弧部分因厚度不均（非均匀的 5 mm）应作为废料去除。厚度小于 5 mm 的小块将导致生成较短的 SpOTs，在邻近组织材料尚未耗尽前即可能因切片而被完全消耗。为确保 SpOTs 能贯穿整个包埋块，小块厚度需至少为 4.5–5 mm。然而，为确保石蜡充分渗透，小块厚度不应超过 7 mm。在对染料小块进行脱水以实现石蜡渗透时，染料会在较低浓度乙醇中轻微渗出。这种渗出不会影响最终产物，SpOTs 仍将被强烈染色并清晰可见。但该渗出可能影响其他组织，因此在染料小块达到 100% 乙醇之前，组织切片不应与染料小块在同一溶液中处理。
将SpOTs放入阵列块时，需确保在添加SpOT之前已完成所有其他组织的放置。由于SpOT已浸透石蜡，若在受体块的熔融石蜡中放置时间过长，可能导致SpOT核心开始融化。因此，应先排列好所有组织块，随...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Brent Harris 博士对本文稿提供的关键性审阅意见。本研究在 Lombardi 综合癌症中心组织病理学实验室完成 & 组织共享资源，部分由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助项目P30-CA051008支持。本内容仅由作者负责，不一定代表国家癌症研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 组织包埋处理凝胶（Histogel Specimen Processing Gel） | Thermo Scientific | HG-4000-012 | http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html |
| 组织标记染料 | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TMD-5 | 任何组织标记染料均可能足够使用。 |
| Arraymold 2 mm 套件 A（60 芯） | Arraymold | 20015A | 任何手动组织芯片仪均可实现类似功能。 |
参考文献
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