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方法文章

通过强直刺激诱导海马CA1区γ振荡

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DOI：

10.3791/52877

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2015年8月14日

 ,  , 
1The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne

本文内容

摘要

振荡是神经网络的基本特性，可受疾病和药物的调节。研究脑片中的振荡有助于在受控条件下对分离的网络进行表征。本文提供了制备急性脑片以诱发CA1区γ振荡的实验方案。

摘要

神经元网络振荡是健康和疾病状态下脑活动的重要特征，可被多种临床用药调节。本文提供了一种用于研究CA1区γ振荡（20 - 80 Hz）的模型构建方案。这些γ振荡至少可持续30分钟 ，其产生依赖于兴奋性和抑制性突触活动，以及起搏电流的激活。通过强直刺激诱导的振荡具有多个可重复且易于量化的特征，包括放电次数、振荡持续时间、潜伏期和频率，可反映神经网络的状态。电刺激诱导振荡的优势在于其稳定性、可重复性以及可间歇性采集数据，从而能够对网络功能进行可靠表征。该CA1区γ振荡模型可用于研究细胞机制，并系统探讨疾病状态或药物干预下神经元网络活动的改变。通过使用遗传修饰或干预性动物模型的脑片，可方便地将疾病状态药理学纳入研究，从而筛选出特异性靶向疾病机制的药物。

引言

脑网络振荡发生在不同的频段内，这些频段与行为状态相关。在啮齿类动物中，海马θ振荡（5 - 10 Hz）在探索行为期间被观察到1,2，而γ振荡（20 - 80 Hz）则与多种认知过程相关，包括感知和注意力3,4。同步的γ网络活动也与癫痫和精神分裂症等疾病病理相关5,6。例如，γ振荡被认为对应于皮层癫痫灶区域5,7,8，并可作为药物敏感性或耐药性的标志物，这两者是癫痫研究中的重要研究方向9。

海马脑片是一种被广泛用于研究神经网络活动的模型10-12。已有多种实验方案被开发用于在脑片中诱导γ振荡，通常涉及使用低镁离子（Mg2+）、4-氨基吡啶（4AP）、荷包牡丹碱（bicuculline）和红藻氨酸（kainic acid）等药物进行药理学调控12-17。药理学诱导的振荡存在缺陷，例如振荡在给药后随机发生，且难以稳定、可靠地产生。电刺激诱导的γ振荡克服了上述诸多问题，同时还具有与刺激事件在时间上精确同步的优势，便于进行分段式的记录与分析。本文介绍了一种通过在海马脑片的放射层（stratum oriens）施加强直性刺激以诱导CA1区γ振荡的实验方案。

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方案

所有小鼠实验均经弗洛里研究所动物伦理委员会批准。

1. 脑切片制备

  1. 准备切割液，其成分为（mM）：125 Choline-Cl、2.5 KCl、0.4 CaCl2、6 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、20 D-葡萄糖，用碳合气（95% O2–5% CO2）饱和；以及人工脑脊液（aCSF）记录液，其成分为（mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、2 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 D-葡萄糖，用碳合气饱和。将切割液置于冰上保持低温。
  2. 将约400 ml切割液冷冻后，与100 ml未冷冻的切割液混合，制成冰浆。通过细径导管或烧结玻璃通入碳合气（95% O2–5% CO2），流速约为0.5 L/min，产生持续而轻柔的气泡流。
  3. 准备一个250 ml烧杯，内置抬高的尼龙网架，用于放置脑切片。加入aCSF至液面高出网架约2 cm，并通入碳合气，确保气泡不会直接冲击切片存放区域。尼龙网内不得残留气泡，如有则需清除。此装置作为存放室，保持在室温（20–25 °C）。
  4. 摆放解剖器械，包括大剪刀、小剪刀、大小不同的微型刮勺，以及大小镊子，并将它们置于冰上冷却。将振动切片机的组织切割块放在铝箔片上并置于冰上。另准备两片6 cm滤纸、一片单刃剃刀刀片，以及一个装有切割液冰浆的25 ml烧杯。
  5. 另取一个容器装满冰，在冰上铺一张滤纸，并将一个12 cm培养皿置于其上。向培养皿中加入切割液冰浆，并通入碳合气。此容器用于进行脑组织解剖操作。
  6. 准备振动切片机。从包装中取出新的双刃剃刀刀片（每次使用新刀片），先喷洒80%乙醇，再用去离子水冲洗。在塑料移液管（3 ml）开始变细的位置剪断，用于转移脑切片。将27 G针头在基部弯曲约45°，并连接至1 ml注射器上，用于在切片过程中操作切片。

2. 切割脑片

  1. 使用2%异氟烷或当地批准的方法麻醉一只小鼠（P16 - P18）。诱导麻醉后，用一把大剪刀将动物断头，并将头部放入盛有通氧切割液浆的12 cm培养皿中。浆液必须完全浸没头部，以实现快速冷却。
  2. 用一只手固定头部前部，将皮肤和结缔组织向前剥离至鼻部。使用小剪刀剪开结缔组织，暴露下方颅骨。随后去除覆盖在颅骨背侧及颈部上方的肌肉。
  3. 首先用大镊子固定颅骨前部，然后用小剪刀在枕骨大孔两侧的骨头上做两个侧向切口，将脑组织从颅骨中取出（图1，切口标记为 A1 和 A2）。
    1. 在两眼之间（略位于前囟前方）做另一切口（图1，切口标记为 B），然后沿矢状缝向前小心切开，掀开颅骨片以暴露脑组织（图1，切口标记为 C）。
    2. 使用小刮匙将脑组织挖出并置于培养皿中。注意脑组织腹侧下方的脑神经，需将其切断，可使用更小的微型刮匙完成。用较大的刮匙将脑组织转移至装满切割液浆的25 ml烧杯中。
  4. 准备用于切片的脑半球。
    1. 将一片6 cm滤纸置于新的培养皿底部，加入新鲜的切割液浆并通氧。用较大的刮匙将脑组织腹侧朝下放置在滤纸上。取一把新的、清洁的单刃剃刀，切除小脑，然后沿中线切开，将脑组织分为两个半球。
  5. 准备振动切片机的组织块。
    1. 取预冷的振动切片机组织块，擦干表面，在中央滴一滴氰基丙烯酸酯胶水，并均匀涂抹至与脑组织大小相近的范围。用小刮匙将其中一个脑半球转移至大号微型刮匙上，使脑组织内侧面朝下。
    2. 将刮匙边缘接触第二张滤纸上脑组织的界面，尽可能去除多余液体。用小刮匙引导，将脑组织从大刮匙上滑入胶水中。
    3. 将切片块固定于振动切片机腔室中，向腔室内加入切割液浆并通氧，确保脑组织完全浸没。旋转切片块，使脑组织腹侧面向刀片。
  6. 切片脑组织。
    注意：每台振动切片机均具有独特性，请遵循制造商的操作说明。
    1. 设置切片厚度为450 µm，并确保刀片以约0.3 mm/s的速度移动并通过振动穿过脑组织。从腹侧至皮层表面完全切穿脑组织，从而获得可用于电生理记录的完整矢状面脑切片。切片将从外侧向内侧产生，通常每个半球可获得3 - 4片切片。
    2. 若切片基部翘起，可用弯曲的27 G针头轻轻将其压回。每切出一片，即用转移移液管将其移至保存室的平台上，切片在此条件下可保持活性长达8小时。

3. 细胞外电生理记录

  1. 将脑片固定在记录室中。
    1. 使用转移移液管将一片脑组织放入浸没式记录室，用以持续灌流 aCSF，流速为 1 - 2 ml/min，并加热至 32 °C。用于记录的 aCSF 与保存脑片时所用的 aCSF 不同，其 Mg2+ 浓度由 2 mM 提高至 4 mM。
    2. 用“琴弦固定器”（由间隔 2 - 3 mm 的尼龙丝拉紧在半圆形不锈钢架上构成）固定脑片。放置琴弦固定器时，使尼龙丝与 CA1 区平行。将灌流速度提高至 8 - 10 ml/min，温度保持在 32 °C。
  2. 在解剖显微镜下，将刺激电极和记录电极（充满 aCSF 记录液的玻璃电极）放置于 CA1 区辐射层（stratum radiatum）表面（图 2A）。先放置刺激电极，再放置记录电极。
  3. 使用幅度为 120 - 150 µA、持续时间为 0.1 msec 的测试脉冲刺激 Schaffer 侧支，观察所产生的场兴奋性突触后电位（fEPSP）波形，以评估脑片的健康状态（图 2B）。为获得具有较小纤维群峰电位（fiber volley）和较大振幅的 fEPSP 记录，刺激电极和记录电极可能需要深入脑片表面下约 50 - 100 µm。由 Schaffer 侧支诱发的 fEPSP 具有典型特征，是评估脑片健康状况的良好指标。健康的脑片通常表现出纤维群峰电位与 fEPSP 振幅之比小于 0.3。
  4. 重新定位电极。
    1. 在解剖显微镜下，将刺激电极移至辐射层（stratum oriens）中部，并将记录电极尽可能靠近刺激电极地移至锥体细胞层，如 图 3A 所示。可能需要将刺激电极和记录电极插入脑片约 50 - 100 µm，使对 120 - 150 µA 测试脉冲的 fEPSP 反应振幅约为 1 mV。
  5. 诱导 γ 振荡。
    1. 为诱导 γ 振荡，以 200 Hz 的频率给予 20 次、每次 0.1 msec 的脉冲串刺激组织。该强直性刺激每 5 分钟施加一次，可产生可重复的反应。
  6. 使用以下记录参数。
    1. 调节输出信号增益，使其匹配模数转换器的输入电压范围。确保预期最大信号偏移至少占用输入电压范围的 30%。设置增益时需谨慎，避免过高导致信号削波。场电位记录通常所需的带宽为 500 Hz，采用 0.1 Hz 的交流耦合以消除基线漂移。
    2. 采样频率应至少为低通滤波器截止频率的 4 - 5 倍，以避免信号混叠。
  7. 数据分析。
    1. 对数据进行 5 Hz 高通滤波，以消除任何基线偏移。使用导数阈值法识别尖峰，设定最小事件间隔为 10 msec，典型事件达峰时间及回归时间间隔为 7 ms，阈值约为 100 mV/msec，分离谷值为 100%。潜伏期定义为刺激伪迹结束后至首次识别到的尖峰出现的时间。该分析可用于表征每次扫描中每个振荡的尖峰数量、潜伏期、事件间间隔和持续时间，具体计算方法如下：
    2. 计算尖峰数量：确定每次扫描中每个振荡的总尖峰数。
    3. 计算振荡潜伏期：对每次振荡，用首次识别到的尖峰出现时间减去刺激伪迹结束时间。
    4. 计算平均事件间间隔（ISI）：确定多个检测到的尖峰之间的时间间隔并取平均值。
    5. 计算振荡持续时间：测量每次振荡中首个与末个检测到的尖峰之间的时间间隔。

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结果

对辐射层施加强直刺激可诱导出稳定且可重复的γ振荡（35.4 ± 2.2 Hz），见图3B。为了证明这些振荡是在局部CA1神经网络内产生的，使用弯曲的32 G针在CA2区域切断脑片，以阻断来自CA3的输入。切开后的脑片与未切开的脑片相比，其振荡特性无显著差异（p = 0.85；切开组：6.16 ± 1.1个峰，n = 6；未切开组：5.89 ± 0.8个峰，n = 6），表明振荡为局部产生。

该方法的一个重要优势是记录的稳定性。当以5分钟间隔施加强直刺激时，对于任何给定的脑片，振荡活动至少可稳定维持30分钟（15分钟与30分钟时的放电次数比较，p = 0.26）。不同脑片之间的振荡总放电次数及其他参数存在变异性。在药物研究中，可通过配对实验设计，使基线特性差异成为次要因素。对于同一脑片内的比较，变异性可能构成问题，但可通过足够的统计效能来克服。

接下来，研究了产生这些四突触刺激诱导的CA1区γ振荡所必需的离子通道和受体。分别使用20 µM的6-氰基-7-硝基-2,3-二氧喹喔啉（CNQX）阻断α...

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讨论

本文介绍了一种在急性脑切片中稳定诱导CA1区γ振荡的有效方法。该模型中产生的振荡源于局部神经环路，有助于更精确地控制和理解神经网络振荡的神经生理学基础12。在此模型中，AMPA受体、GABAA受体、Ih电流以及T型Ca2+通道均是产生γ振荡所必需的。尽管此处描述的CA1局部振荡可被稳定诱导，但其成功依赖于确保脑切片的良好状态。其中关键步骤是快速将脑组织从颅骨中取出，操作时需避免损伤脑组织，并立即浸入冰冻溶液中。理想情况下，从断头到完成脑组织取出的时间应不超过30至60秒 ，以维持切片的健康状态21。

通过使用强直刺激，可在标准生理记录溶液中诱导产生局部CA1区γ振荡，而无需依赖药理学试剂。这种方法在表征疾病模型中的病理状态时具有优势，因为添加药理学试剂可能会干扰结果的解释。例如，在一种人类遗传性癫痫小鼠模型中，利用该模型可增强局部CA1区活动性及其对抗癫痫药物的敏感性22。该模型用于研究神经网络活动并不仅限于癫痫，还可轻松应用于阿尔茨海默病、...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

APA 向 RJH 提供资助，NHMRC 项目基金 400121 支持 SP，NMHRC 奖学金 1005050 支持 SP。CAR 承认 ARC（FT0990628）和 DOWD 奖学金计划的支持。弗洛里神经科学与心理健康研究所获得维多利亚州政府基础设施资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-(N-乙基-N-苯基氨基)-1,2-二甲基-6-(甲氨基)嘧啶鎓氯化物（ZD7288）Sigma-AldrichZ3777
荷包牡丹碱Sigma-Aldrich14340
6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）Sigma-AldrichC127
镍Sigma-Aldrich266965
卡马西平Sigma-AldrichC4024
(2R)-氨基-5-磷酸戊酸（APV）Tocris Bioscience0105
瑞替加滨ChemPacific150812-12-7
氯化胆碱Sigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
葡萄糖Sigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 • 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
电极玻璃管Harvard Apparatus GC150F-10
同心双极刺激金属电极 FHCCBBPF75
数字隔离器Getting InstrumentsModel BJN8-9V1 
Model 1800 放大器A-M systemsModel 1800 amplifier
数据采集卡National InstrumentsNI USB-6211
振动切片机LeicaVT1200s

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