振荡是神经网络的基本特性，可受疾病和药物的调节。研究脑片中的振荡有助于在受控条件下对分离的网络进行表征。本文提供了制备急性脑片以诱发CA1区γ振荡的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
神经元网络振荡是健康和疾病状态下脑活动的重要特征，可被多种临床用药调节。本文提供了一种用于研究CA1区γ振荡（20 - 80 Hz）的模型构建方案。这些γ振荡至少可持续30分钟 ，其产生依赖于兴奋性和抑制性突触活动，以及起搏电流的激活。通过强直刺激诱导的振荡具有多个可重复且易于量化的特征，包括放电次数、振荡持续时间、潜伏期和频率，可反映神经网络的状态。电刺激诱导振荡的优势在于其稳定性、可重复性以及可间歇性采集数据，从而能够对网络功能进行可靠表征。该CA1区γ振荡模型可用于研究细胞机制，并系统探讨疾病状态或药物干预下神经元网络活动的改变。通过使用遗传修饰或干预性动物模型的脑片，可方便地将疾病状态药理学纳入研究，从而筛选出特异性靶向疾病机制的药物。
引言
脑网络振荡发生在不同的频段内，这些频段与行为状态相关。在啮齿类动物中，海马θ振荡（5 - 10 Hz）在探索行为期间被观察到1,2，而γ振荡（20 - 80 Hz）则与多种认知过程相关，包括感知和注意力3,4。同步的γ网络活动也与癫痫和精神分裂症等疾病病理相关5,6。例如，γ振荡被认为对应于皮层癫痫灶区域5,7,8，并可作为药物敏感性或耐药性的标志物，这两者是癫痫研究中的重要研究方向9。
海马脑片是一种被广泛用于研究神经网络活动的模型10-12。已有多种实验方案被开发用于在脑片中诱导γ振荡，通常涉及使用低镁离子（Mg2+）、4-氨基吡啶（4AP）、荷包牡丹碱（bicuculline）和红藻氨酸（kainic acid）等药物进行药理学调控12-17。药理学诱导的振荡存在缺陷，例如振荡在给药后随机发生，且难以稳定、可靠地产生。电刺激诱导的γ振荡克服了上述诸多问题，同时还具有与刺激事件在时间上精确同步的优势，便于进行分段式的记录与分析。本文介绍了一种通过在海马脑片的放射层（stratum oriens）施加强直性刺激以诱导CA1区γ振荡的实验方案。
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方案
所有小鼠实验均经弗洛里研究所动物伦理委员会批准。
1. 脑切片制备
- 准备切割液，其成分为（mM）：125 Choline-Cl、2.5 KCl、0.4 CaCl2、6 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、20 D-葡萄糖，用碳合气（95% O2–5% CO2）饱和；以及人工脑脊液（aCSF）记录液，其成分为（mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、2 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 D-葡萄糖，用碳合气饱和。将切割液置于冰上保持低温。
- 将约400 ml切割液冷冻后，与100 ml未冷冻的切割液混合，制成冰浆。通过细径导管或烧结玻璃通入碳合气（95% O2–5% CO2），流速约为0.5 L/min，产生持续而轻柔的气泡流。
- 准备一个250 ml烧杯，内置抬高的尼龙网架，用于放置脑切片。加入aCSF至液面高出网架约2 cm，并通入碳合气，确保气泡不会直接冲击切片存放区域。尼龙网内不得残留气泡，如有则需清除。此装置作为存放室，保持在室....
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结果
对辐射层施加强直刺激可诱导出稳定且可重复的γ振荡（35.4 ± 2.2 Hz），见图3B。为了证明这些振荡是在局部CA1神经网络内产生的，使用弯曲的32 G针在CA2区域切断脑片，以阻断来自CA3的输入。切开后的脑片与未切开的脑片相比，其振荡特性无显著差异（p = 0.85；切开组：6.16 ± 1.1个峰，n = 6；未切开组：5.89 ± 0.8个峰，n = 6），表明振荡为局部产生。
该方法的一个重要优势是记录的稳定性。当以5分钟间隔施加强直刺激时，对于任何给定的脑片，振荡活动至少可稳定维持30分钟（15分钟与30分钟时的放电次数比较，p = 0.26）。不同脑片之间的振荡总放电次数及其他参数存在变异性。在药物研究中，可通过配对实验设计，使基线特性差异成为次要因素。对于同一脑片内的比较，变异性可能构成问题，但可通过足够的统计效能来克服。
接下来，研究了产生这些四突触刺激诱导的CA1区γ振荡所必需的离子通道和受体。分别使用20 µM的6-氰基-7-硝基-2,3-二氧喹喔啉（CNQX）阻断α.......
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讨论
本文介绍了一种在急性脑切片中稳定诱导CA1区γ振荡的有效方法。该模型中产生的振荡源于局部神经环路，有助于更精确地控制和理解神经网络振荡的神经生理学基础12。在此模型中，AMPA受体、GABAA受体、Ih电流以及T型Ca2+通道均是产生γ振荡所必需的。尽管此处描述的CA1局部振荡可被稳定诱导，但其成功依赖于确保脑切片的良好状态。其中关键步骤是快速将脑组织从颅骨中取出，操作时需避免损伤脑组织，并立即浸入冰冻溶液中。理想情况下，从断头到完成脑组织取出的时间应不超过30至60秒 ，以维持切片的健康状态21。
通过使用强直刺激，可在标准生理记录溶液中诱导产生局部CA1区γ振荡，而无需依赖药理学试剂。这种方法在表征疾病模型中的病理状态时具有优势，因为添加药理学试剂可能会干扰结果的解释。例如，在一种人类遗传性癫痫小鼠模型中，利用该模型可增强局部CA1区活动性及其对抗癫痫药物的敏感性22。该模型用于研究神经网络活动并不仅限于癫痫，还可轻松应用于阿尔茨海默病、.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
APA 向 RJH 提供资助，NHMRC 项目基金 400121 支持 SP，NMHRC 奖学金 1005050 支持 SP。CAR 承认 ARC（FT0990628）和 DOWD 奖学金计划的支持。弗洛里神经科学与心理健康研究所获得维多利亚州政府基础设施资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-(N-乙基-N-苯基氨基)-1,2-二甲基-6-(甲氨基)嘧啶鎓氯化物（ZD7288） | Sigma-Aldrich | Z3777 | |
| 荷包牡丹碱 | Sigma-Aldrich | 14340 | |
| 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX） | Sigma-Aldrich | C127 | |
| 镍 | Sigma-Aldrich | 266965 | |
| 卡马西平 | Sigma-Aldrich | C4024 | |
| (2R)-氨基-5-磷酸戊酸（APV） | Tocris Bioscience | 0105 | |
| 瑞替加滨 | ChemPacific | 150812-12-7 | |
| 氯化胆碱 | Sigma-Aldrich | C1879-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-250G | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma-Aldrich | 223506-500G | |
| MgCl2 • 6H2O | Sigma-Aldrich | M2670-500G | |
| 电极玻璃管 | Harvard Apparatus | GC150F-10 | |
| 同心双极刺激金属电极 | FHC | CBBPF75 | |
| 数字隔离器 | Getting Instruments | Model BJN8-9V1 | |
| Model 1800 放大器 | A-M systems | Model 1800 amplifier | |
| 数据采集卡 | National Instruments | NI USB-6211 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200s |
参考文献
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity ....
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