方法文章

实施 体外 药物耐药性检测：充分挖掘揭示临床相关耐药机制的潜力

DOI：

10.3791/52879

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2015年12月9日

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1H3 Biomedicine, 2Massachusetts General Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

靶向治疗药物耐药现象普遍存在，因此在临床出现耐药前后识别其潜在机制，对于指导替代性的临床管理策略至关重要。本文介绍了一种联合建立耐药细胞系的实验方案 体外 结合测序技术以加速这些机制的发现。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管靶向治疗在初期是有效的，但耐药性不可避免地会出现。已有多种方法被用于揭示这些耐药机制，以促进后续治疗，例如对耐药临床样本进行遗传学分析。尽管这些方法已带来一些具有临床意义的发现，但获取相关患者样本的困难，以及从这些样本中获得的基因组数据解析的复杂性，严重阻碍了治愈之路。为此，本文介绍一种可加速发现的工具，有望指导一线疗法及替代性临床管理策略的改进。通过将临床前的体外（in vitro）或体内（in vivo）药物筛选与下一代测序技术相结合，可识别出可能作为耐药功能驱动因素的基因组结构变异和/或基因表达改变。该方法有助于耐药相关改变的自然发生，从而提高这些机制在患者中被观察到的可能性。在本方案中，我们提供了使用贴壁细胞系最大限度发现驱动耐药的单核苷酸变异的指导原则。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过高稳健性的测序技术及改进的数据分析工具，对肿瘤基因组进行深入的分子表征，已促成在特定癌症类型中发现关键的遗传改变1,2。针对这些遗传病变（如HER2、BCR-ABL、EGFR和ALK）开发的靶向治疗显著改善了患者的生活质量1,2。然而，尽管该策略具有高度特异性，大多数单一疗法的临床应答仍不理想，因为最终会出现耐药性。近年来，在理解靶向治疗耐药的分子基础方面已取得显著进展。引人注目的是，越来越多的证据表明，一种重要的耐药机制涉及靶点或信号通路的持续活性。以前列腺癌为例，针对雄激素受体（AR）的恩杂鲁胺治疗会导致AR自身激活突变的富集，从而在抑制剂存在的情况下仍维持AR信号输出3-5。这一认识推动了两项积极的研究方向：1）开发第三代拮抗剂，以持续抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌中野生型和突变型AR的功能3；2）识别AR信号通路中潜在的下游作用节点，作为治疗干预的靶点。类似地，对其他类型抑制剂（如靶向EGFR、BRAF和ABL的抑制剂）的耐药性也常导致原始成瘾性激酶通路的重新激活突变1。

鉴于大多数患者不可避免地会产生耐药性，开发能够快速揭示这些耐药机制的方法，将有助于研发有效的后续治疗策略。目前广泛使用的一种方法是，通过分析临床耐药肿瘤相对于未经治疗或治疗敏感肿瘤的基因组特征，以识别可能适用于药物研发的遗传变异富集或缺失情况。尽管该方法前景广阔，但仍存在两大主要缺陷，阻碍了快速发现进程。首先，及时获取用于基因组分析的肿瘤组织样本可能成为从治疗迈向治愈过程中的重大障碍。其次，在耐药情况下，由于肿瘤可能表现出显著的瘤内异质性6,7，对众多遗传变异进行解析可能极具挑战性。

鉴于这些挑战，人们越来越依赖于在临床前阶段发现耐药机制。这种方法可能有助于在临床试验之前识别出主要的耐药机制1，从而为携带这些机制的患者（无论是在治疗前还是在耐药发生后）提供替代性的临床管理策略。

一种被广泛使用的临床前发现工具是应用无偏倚的功能性RNAi筛选。例如，Whittaker及其同事采用全基因组规模的RNAi筛选，发现NF1缺失可通过持续激活MAPK通路介导对RAF和MEK抑制剂的耐药性8。这些发现具有临床相关性，因为在对RAF抑制天然耐药的BRAF突变肿瘤细胞以及对维莫非尼（vemurafenib）耐药的黑色素瘤组织中，均观察到NF1功能缺失性突变8。然而，尽管该方法已取得成功，许多具有临床意义的靶点仍常常未能被识别，这可能是由于该方法本身存在功能缺失的偏向性所致。

相比之下，一种偏倚较小的临床前耐药机制研究工具是通过将细胞长期暴露于目标化合物，并结合基于下一代测序（NGS）的基因组或转录组分析，从而建立耐药细胞系。该方法已被多个研究团队成功应用，用于鉴定可导致耐药性的自发性、反复出现的单核苷酸变异或表达水平改变5,9,10。例如，AR基因中的F876L突变最近在体外耐药克隆in vitro3-5以及体内异种移植肿瘤in vivo5中被发现，早于该突变在临床样本中的鉴定4。最近，Bhang及其同事（2015）11在两个具有临床相关性的模型中使用ClonTracer技术表明，在长期药物暴露过程中出现的大多数耐药克隆属于预先存在的亚群，提示大多数具有功能意义的突变很可能在选择压力之前就已存在，并在筛选过程中被富集11。

与之前讨论的肿瘤基因组分析相比，该方法由于采用“均一的”耐药克隆进行分析，异质性较低，从而更有利于对潜在驱动因素进行精确的遗传学解析。此外，令人振奋的是，该方法除了可用于揭示耐药机制外，还可用于鉴定生物活性小分子的细胞作用机制及其靶点，尤其适用于那些作用机制和靶点尚不明确的化合物10。鉴于该方法具有明显优势且用途广泛，本文提供了一项详细的操作方案，以成功实施此类临床前筛选，最大限度地推动具有临床意义的发现。

方案

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1. 评估感兴趣化合物的GI50

  1. 为感兴趣的细胞系生成生长曲线，以评估合适的接种密度。绘制接种后不同时间点（第2、4、6和8天）相对于第0天的细胞数量。该数据可提供目标细胞系的相对生长速率，应据此确定初始接种密度，确保细胞在96孔板中于7天内不达到汇合状态。
  2. 确定生长曲线后，在不透明、透明底的96孔板中加入100 µl细胞培养基，接种适量数量的细胞以评估GI50根据所使用的细胞系及步骤1.1中确定的条件接种细胞，通常接种3×10⁵个细胞3 倍增时间约为24小时的快速生长细胞系的细胞， 例如，HCT116。
    1. 制备检测用培养板（第-1天）。在检测用培养板中，将细胞以所需密度接种于蓝色阴影所示孔内，每孔加入100 µl培养基图1白色标记的孔中仅含有培养基。
    2. 制备对照组平板（第-1天）。在另一块96孔板中，加入100 µl培养基，接种与步骤1.2.1相同密度的细胞。该“第0天”读数将有助于分析待测化合物的细胞静止/细胞毒性特征。图2).
  3. 第二天（第0天），读取对照板。将发光细胞活力检测试剂（根据制造商说明将CellTiter-Glo底物与缓冲液混合）平衡至室温，轻轻倒置混匀，以获得均一溶液。向每孔100 µl细胞/培养基混合液中加入80 µl试剂，振荡30分钟。 以诱导细胞裂解。
    1. 使用发光仪记录发光信号，设置曝光时间为0.1–1.0秒，检测波长为560 nm。
  4. 在第0天将待测化合物（目标化合物）加入检测板中。用DMSO对化合物进行1:4系列稀释，配制成最终浓度200倍的溶液，共10个浓度（9个含化合物的稀释浓度和1个仅含DMSO的对照），置于化合物板中。初始实验建议最低剂量为0.03 µM（200倍浓缩液），最高剂量为2,000 µM（最终体积为200 µl）。
  5. 将系列稀释的化合物加入培养基中，配制终浓度为10倍的化合物-培养基混合液（终体积100 µl，中间板）。将化合物板在-20 °C保存，用于检测第3天的实验。以三复孔为一组，向细胞中加入10 µl化合物-培养基混合液，使最高剂量为10 µM（例如，B、C 和 D 行，第 0 天）（图1）。将检测板在 37 °C 下孵育 3 天。使用后丢弃中间板。
  6. 第3天，使用1.4步骤中制备的化合物板，配制400 µl的1×化合物-培养基混合液。将检测板倒置以去除培养基，并在经高压灭菌的纸巾上轻拍2-3次以除去残留培养基。向蓝色阴影孔中加入化合物/培养基混合液（100 µl/孔），并向周边孔中加入100 µl培养基以防止蒸发。图1)。将检测板在37 °C下再次孵育额外3天。
  7. 第6天，按照步骤1.3所述进行发光检测，以评估活细胞的相对数量。
  8. 利用第0天的读数评估化合物的静态/毒性特征。毒性试剂会诱导细胞凋亡，而细胞抑制剂则诱导细胞周期阻滞。如果化合物具有毒性（第6天读数低于第0天读数），建议选择GI50，以及胃肠道50 用于抗性检测的5个浓度。然而，如果该化合物诱导产生静止期（等于或高于d0读数），则考虑GI100 和胃肠道100x5 用于抗性检测（图2).

2. 建立药物抗性检测

  1. 若使用细胞抑制剂，将细胞以30-40%的汇合度接种于150 mm培养皿中2 用于抗性检测的组织培养皿（体积 = 30 ml）。若处理有毒试剂，接种时细胞融合度应为70-80%。
  2. 对于具有完整错配修复（MMR）机制的细胞系，将步骤2.1中的细胞在37 °C下与致癌物N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）共孵育过夜（O/N）。加入30 µl浓度为50 mg/ml的ENU储备液（终浓度为50 µg/ml），以增强基因组不稳定性。对于MMR功能缺陷的细胞系（表 2 和 3），则可能无需使用ENU或其他致癌剂处理。
    1. 对于其他细胞系，使用微卫星不稳定性，依据美国国家癌症研究所（NCI）标准确定错配修复缺陷12，或依据已发表的微卫星不稳定性检测或MMR基因的基因组/表观基因组分析结果13-15.
  3. 用步骤1.8中确定浓度的待测化合物处理细胞。对于在典型的三天存活率检测中引起细胞死亡的高毒性化合物10，从低剂量治疗开始（即，GI50）并逐步增加浓度（GI的倍数）50每2-3周添加一次化合物，直至观察到明显的抗性。每隔3天更换培养基和化合物。
  4. 一旦开始筛选，每3-4天更换一次培养基/化合物混合物，直至出现抗性克隆。根据定义，当经药物处理的细胞在药物作用下的生长/存活能力高于DMSO处理对照细胞的急性处理组时，即视为产生抗性。

3. 分离单细胞克隆

  1. 使用相差显微镜（40倍放大）检查培养皿中是否有存活的细胞簇。
  2. 用记号笔在培养皿底部标记出满意的克隆。选择大小适中的克隆（较大的克隆可能来源于多个细胞），并确保其与其他克隆充分分离。使用步骤3.3中所述的两种方法之一进行克隆挑选。
  3. 方法一：使用移液器（图3）
    1. 移除生长培养基，并用1x PBS冲洗，以去除任何漂浮的细胞。
    2. 利用底部的黑色标记作为引导，使用移液器吸头（连接移液器，建议使用p200）进行克隆挑选。
    3. 将克隆转移至含有200 μl新鲜培养基（含一半浓度的化合物，以利于细胞最佳恢复）的48孔板中。
    4. 在加入200 μl新鲜培养基/理想化合物浓度之前，让细胞恢复2-3天。
    5. 此后每3-4天更换一次培养基/化合物，并持续扩增克隆。
  4. 方法二：使用克隆环（图3）
    1. 按照步骤3.2所述方法标记克隆。
    2. 将3 mm克隆环置于含有5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA的10 cm组织培养皿中，浸泡2分钟。
    3. 吸除含有抗性克隆的培养皿中的培养基，并使用无菌一次性镊子将浸透胰蛋白酶的克隆环覆盖在克隆上。
    4. 在37 °C培养箱中孵育1-2分钟，具体时间取决于克隆从培养皿脱离的难易程度。
    5. 用无菌镊子取出克隆环，并将其转移至含有200 μl新鲜培养基和一半浓度化合物的48孔板中。
    6. 轻轻吹打数次，使细胞从克隆环上脱落，然后在37 °C过夜培养（克隆环保留在孔中）。
    7. 次日早晨，从48孔板中移除克隆环，并补充200 μl新鲜培养基/化合物（半量理想浓度）。
    8. 三天后，更换为含理想浓度化合物的培养基。
    9. 此后每3-4天更换一次培养基/化合物，并持续扩增克隆。

4. 评估分离克隆的抗性程度

  1. 当扩增出10-20个菌落后，按照步骤1所述方法生成GI50曲线，以评估耐药程度。
  2. 在筛选过程中，务必包括经DMSO处理的对照群体。耐药谱很可能较广（部分菌株表现为部分耐药，而另一些则表现为完全耐药）。应从每一类中收集少量克隆，因为这两组之间的耐药机制可能不同。

5. 下一代测序

  1. 将200万个细胞（对照组和耐药克隆）分别在15 ml锥形管中离心（500 × g，5分钟），用于基因组DNA和RNA的收集（因此共需2 × 200万个细胞）。
  2. 用1× PBS洗涤两次，将细胞沉淀在-80 °C冷冻保存，直至进行提取。
  3. 根据制造商说明书，使用商业提取试剂盒分离RNA或基因组DNA。
  4. 按照供应商的方案提交样本进行高通量测序10。

6. 样本的生物信息学分析（全外显子组测序）

  1. 根据最佳实践的DNA测序分析流程对序列数据进行预处理16.
    1. 使用 BWA 将所有测序读段比对至参考人类基因组 GRCh3717将未压缩的 SAM 格式比对结果转换为压缩的 BAM 格式，使用 Samtools18使用 Samtools 按坐标对序列比对结果进行排序。使用 Picard 添加读段组信息。（有关 BWA、Samtools 和 Picard 的具体命令，请参见补充文本 1 第 1-4 行）
    2. 使用 Picard 工具集中的 MarkDuplicates 命令标记所有重复序列读段19使用 Samtools 对此文件进行索引。（补充文本 1，第 5–6 行）
    3. 为最大限度减少所有测序读段中的错配碱基，使用插入缺失重比对工具（indel realigner）在含有小片段插入或缺失的区域对读段进行局部重比对20（补充文本1，第7-8行）
    4. 为进一步提高变异检测的准确性，使用碱基质量评分重校准工具对碱基质量评分进行经验性重校准。该碱基质量校准工具不仅应校正初始质量评分，还应考虑多个特征的协变因素，包括测序读段组（read group）、仪器循环周期（machine cycle）、碱基位置以及二核苷酸上下文（前一个与当前碱基）。使用 Picard PrintReads 生成重校准后的 BAM 文件。（有关此步骤的具体命令，请参见补充文本 1 第 9–10 行）
    5. 对每个测序样本重复步骤 6.1.1 至 6.1.4（补充文本 1，第 1–10 行）。
  2. 使用配对变异检测工具19,21-23鉴定每个克隆中的单核苷酸变异（SNV）。针对每个测序的克隆，以亲本克隆作为匹配的“正常”样本进行配对变异检测。（补充文本1，第11行）
  3. 筛选重复出现的高质量变异位点，并使用变异注释工具进行注释前准备24. 忽略在所有耐药克隆中不共有的变异。（参见补充文本2中的R脚本）
  4. 使用注释工具对变异进行注释25, 26许多变异注释工具都配有相应的网页应用程序，可将数据上传至远程服务器进行处理。
  5. 使用功能影响预测工具27-29 优先考虑预测具有高功能影响的变异位点。与变异注释类似，目前已有多种可通过网页界面访问的工具用于预测功能影响。

结果

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为了最大限度地发现介导耐药性的关键功能驱动因素，应选择单细胞克隆进行扩增、表型检测和测序。如图4A所示，HCT116细胞经细胞毒性化合物#1长期处理后，自发出现了在药物处理期间仍持续生长的耐药克隆（黑色虚线圆圈）。这些克隆采用图3中所示的方法#1进行挑取，并进一步扩增用于表型分析。如图4B所示，耐药克隆1-3均对化合物#1及其结构类似物化合物#2表现出显著耐药性（更高的存活率/生长能力），而所有克隆对无关的细胞毒性化合物Velcade仍保持敏感。在确认表型耐药性后，提取基因组DNA并进行全外显子组测序分析。应用生物信息学工具筛选出满足以下两个条件的结构变异：1）在多个样本中重复出现；2）具有潜在的功能影响（图5A）。满足上述两个标准的结构变异通过独立的测序技术进行验证。如图5B所示，通过全外显子组测序鉴定出的一个杂合错义突变，经Sanger测序方法得到确认（上图：野生型序列；下图：突变型序列）。在序列验证完成后，对最初用于耐药性实验的亲本细胞系进行基因工程改造，使其表达该突变cDNA，以功能性验证该突变的作用。如图6所示，过表达野生型cDNA未能赋予细胞耐药性，而强制表达突变型cDNA则显著导致对化合物#1的表型耐药，从而证实该结构变异在驱动耐药性中的功能性作用。本实验所使用的所有试剂均列于表1中。

剂量-反应检测示意图；化合物1:4倍比稀释；药物筛选设置。
图1. 检测板与对照板的布局。蓝色区域，化合物处理孔。 白色区域，仅含培养基。化合物以1:4倍比稀释，并设三个重复孔（B-D或E-G）。每块板可处理2种化合物。

显示相对于DMSO的细胞活性的抑细胞增殖与杀细胞药物浓度-反应曲线。
图2. 典型的细胞活性曲线。红色虚线表示第0天的读数。 x轴表示化合物剂量从左到右递增，y轴表示相对于DMSO对照孔的细胞活性。GI100= 达到100%生长抑制所需的剂量；GI50= 使细胞活性降低至DMSO对照组50%所需的剂量。

微生物学中的移液方法，示意图显示使用微量移液器和培养皿的两种方法。
图 3. 挑选抗性克隆进行扩增的两种方法。 方法 1——使用移液器挑取形态清晰的克隆并转移至48孔板。方法 2——使用浸泡过胰蛋白酶的克隆环挑取克隆，并转移至48孔板。

Cell viability assay; resistant clones; concentration-response graph; drug efficacy analysis.
图4. HCT116 克隆对化合物#1 获得性耐药性的验证 体外. (A经连续三周筛选后，出现了对化合物#1耐药的HCT116克隆。B对照组和耐药克隆在经不同化合物处理72小时后的存活率。化合物#2是化合物#1的类似物。Velcade用作对照细胞毒剂。数据表示为三次生物学重复实验的平均值±标准差。

SNV分析流程图；测序图显示野生型与突变型DNA的比较。
图5. 在化合物#1耐药的HCT116克隆中鉴定出基因A的一个独特且反复出现的突变（单核苷酸变异，SNVs）。（A）通过MutationAssessor预测具有高功能影响的、在所有耐药克隆中均存在的SNV的鉴定流程。（B）通过Sanger测序验证基因A中的突变。

Cell viability vs. compound concentration graph, parent vs. WT vs. mutant for drug effects analysis.
图6. 重新表达突变基因A使细胞对化合物#1产生抗性 体外. 在用化合物#1处理72小时后，检测了经基因改造的HCT116细胞系的存活率。HCT116-WT或突变细胞系分别稳定表达基因A的野生型或突变型cDNA。数据表示为三次生物学重复实验的平均值±标准差。

样本名称氨基酸主要组织杂合性
C-33-Ap.E768fs*44宫颈杂合
C-33-Ap.S860*宫颈杂合
CML-T1p.?造血和淋巴组织纯合
CP66-MELp.C822F皮肤杂合
CTV-1p.0?造血和淋巴组织纯合
EFO-27p.Q130fs*2卵巢杂合
EFO-27p.?卵巢杂合
HCC2218p.E467K乳腺杂合
J-RT3-T3-5p.R711*造血和淋巴组织纯合
LNCaPp.?前列腺纯合
LoVop.?大肠纯合
MOLT-13p.R711*造血和淋巴组织纯合
NALM-6p.?造血和淋巴组织纯合
NCI-H630p.R680*大肠杂合
SKUT-1p.L787fs*11子宫内膜纯合
SKUT-1Bp.L787fs*11子宫内膜纯合
SUP-T1p.?造血和淋巴组织纯合

表1. MSH2基因突变的细胞系。列出了细胞系（样本名称）、氨基酸替换、来源谱系及纯合性/杂合性状态。

样本名称氨基酸主要组织杂合性
CCRF-CEMp.R100*造血及淋巴组织杂合
CCRF-CEMp.?造血及淋巴组织杂合
CW-2p.Y130fs*6大肠纯合
DU-145p.?前列腺纯合
GR-STp.?造血及淋巴组织纯合
HCT-116p.S252*大肠纯合
IGROV-1p.S505fs*3卵巢纯合
MN-60p.?造血及淋巴组织纯合
NCI-SNU-1p.R226*胃纯合
P30-OHKp.?造血及淋巴组织纯合
PR-Melp.?皮肤纯合
REHp.?造血及淋巴组织纯合
SK-OV-3p.0?卵巢纯合
SNU-1544p.S2L大肠杂合
SNU-1746p.E523K大肠纯合
SNU-324p.C233R胰腺杂合
SNU-324p.V384D胰腺杂合
SNU-478p.V384D胰腺杂合

表2. MLH1突变细胞系。列出了细胞系（样本名称）、氨基酸替换、来源谱系及纯合性/杂合性状态。

讨论

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细胞系的选择：遗传状态与基因组不稳定的表征

毫无疑问，成功揭示具有临床相关性耐药机制的最关键因素是初始细胞系的选择。应考虑两个因素。首先，应尽量选择具有疾病特征性遗传特征的相同谱系/亚型的细胞系（例如，黑色素瘤中的 BRAFV600E）。对多种适应症的细胞系30-32以及原发性/转移性肿瘤公开可获取的转录组和突变数据进行分析33,34，将有助于细胞系的选择。尽管选择具有临床相关遗传改变的细胞系是最理想的情况，但在某些情况下，由于可用细胞系的缺乏，或受限于筛选过程的难度和耗时等因素，可能无法实现或不可行。

关于上述问题，细胞系选择过程中需要考虑的第二个因素是使用目标细胞系进行耐药筛选的难易程度或可行性。例如，增殖速度和固有的突变率等因素会显著影响耐药突变发现的速度。为此，可选用具有较快生长动力学特性且DNA错配修复（MMR）机制缺陷的细胞系，以期加速自发耐药的出现35。根据COSMIC数据库，已有多个候选细胞系存在两种常见突变的MMR基因（MSH2 或 MLH1）之一的功能缺失（表2 和 表3）。或者，若缺乏具有MMR缺陷的目标细胞系，也可采用物理诱变剂或DNA反应性化学诱变剂（如烷化剂 N-乙基-N-亚硝基脲（ENU））进行急性处理，以增强基因组不稳定性。尽管上述两种方法均可显著缩短获得耐药克隆及后续测序所需的时间，但仍需对候选基因进行严格的的功能验证，因为可能会产生更多非功能性、伴随性的突变。可通过对接近功能相关性的单核苷酸变异（SNV）进行优先排序，以提高识别成功率。首先，选择在独立克隆中反复出现的突变，可增加这些突变为耐药驱动突变的可能性。若未发现重复突变，则聚焦于符合药物作用机制的SNV（例如药物靶点或已知的药物靶点下游效应分子）可能更具意义。最终，确认候选SNV是否赋予耐药性的金标准，始终是通过在药物敏感的亲本细胞中异位表达cDNA来实验性评估其耐药功能。

DNA 与 RNA 测序

获得耐药克隆后，可根据需要对DNA和/或RNA进行测序。DNA测序（包括外显子组测序或全基因组测序）可用于鉴定生殖系和体细胞变异，例如单核苷酸多态性（SNPs）、插入缺失（indels）以及拷贝数变异。其中，成本较低的外显子组测序主要针对已知的编码区域生成测序读段，而全基因组测序则可获得整个基因组的测序数据，有助于发现非编码区元件（如增强子或miRNA）中的突变36。然而，由于DNA测序无法检测基因表达水平，因此难以预测哪些突变可能是具有功能性的驱动突变。在这方面，尽管RNA测序成本较高，但具备明显优势。由于突变检测仅在表达的RNA分子上进行，因此所关注的突变更有可能是功能性驱动突变。除了有助于更聚焦地筛选后续功能验证所需的突变外，RNA测序还能额外识别基因表达变化、可变剪接以及新的嵌合RNA分子（包括可能作为强效耐药驱动因素的基因融合事件）。

生物信息学分析流程

示例命令仅用于说明，但更详细的文档和教程可从布罗德研究所获取16 在开始NGS分析之前，应仔细阅读上述内容。以下命令适用于已预先安装所有工具和参考数据的系统中的UNIX shell环境。这些命令还假设包含两个样本的双端测序读段的FASTQ文件，文件命名为 "亲代" 和 "耐药的，" 已从供应商处收到并放置在 "数据" 目录。在大多数情况下，应通过添加命令行参数对这些命令进行调整或优化，以适用于特定应用例如，加入 "- t 8" bwa 命令支持在 8 个 CPU 核心上进行多线程操作。即使每个 BAM 文件仅包含一个样本，也通常需要向 BAM 文件中添加读段组（read group），以满足某些工具对文件格式的要求。读段组参数 RGID、RGSM、RGPL、RGPU 和 RGLB 可以是任意字符串，用于描述样本名称、测序平台和文库策略。

体外 与 体内实验

尽管已鉴定出多种耐药机制 体外 所选机制已被证实具有临床相关性，但仍有可能这些机制并非临床耐药的相关或主要机制。其中一个原因可能是肿瘤微环境在驱动治疗耐药性方面具有重要作用，而迄今为止所讨论的实验方案或设置中并未包含这一成分。事实上，已有若干研究表明，某些能够杀伤肿瘤细胞的抗癌药物，在肿瘤细胞与间质细胞共培养时会失去效力，提示间质细胞赋予了肿瘤细胞内在的耐药机制。37,38为了鉴定此类基质诱导的获得性耐药机制，可以考虑进行 体外 共培养或 体内 肿瘤耐药性检测。由于前一种检测方法较为复杂，许多研究者转而构建耐药性肿瘤异种移植模型，以探讨间质在驱动耐药性中的潜在作用。此类研究已揭示出一些相同的结果5 且独特的39 耐药机制相对于 体外 筛选过程暗示间质可能确实在后者中发挥作用。然而，必须注意产生此类耐药性肿瘤所需的时间长度，以及后续基因组分析的复杂性——这种复杂性源于肿瘤内部的分子和细胞异质性。

靶点鉴定

除了揭示药物耐药机制外，这种基于高通量测序（NGS）的基因组分析方法还可用于鉴定化学探针的细胞靶点。历史上，已有多种无偏倚的方法被用于鉴定具有生物活性的小分子化合物的作用机制及其细胞靶点，包括亲和纯化联合定量蛋白质组学、酵母基因组学方法、RNA干扰筛选以及计算推断方法40。作为利用基于NGS的基因组或转录组分析来阐明药物耐药机制的延伸，鉴定出赋予耐药性的独特且反复出现的单核苷酸变异（SNVs）或表达改变，可为化合物的功能性细胞靶点提供线索。这一策略基于如下假设：所观察到的部分耐药机制可能涉及编码小分子直接作用蛋白的基因中反复出现的突变。近年来，已有数项研究证实了该方法的有效性，特别是将其与其他方法（如大规模肿瘤细胞系敏感性谱型分析）相结合，成功揭示了小分子探针的细胞靶点9,10。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文的出版费用由 H3 Biomedicine 支付。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢H3 Biomedicine的同事们在手稿准备过程中提供的反馈意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48孔板Fisher Scientific07-200-86 扩增克隆
96孔板Fisher Scientific07-200-588生成GI50曲线
CellTiter-GloPromegaG7572细胞活力检测
克隆环（3 mm）SigmaZ374431挑取克隆
无菌镊子UnomedicalDF8088S挑取克隆
RNeasy Plus RNA提取试剂盒Qiagen74134RNA分离
血液和组织DNeasy提取试剂盒Qiagen69581基因组DNA分离
GATKThe Broad Institute插入缺失重比对工具
MuTectThe Broad Institute成对变异检测工具
OncotatorThe Broad Institute变异注释工具
MutationAccessorThe Broad Institute功能影响预测工具

参考文献

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