本文描述了一种具有临床相关性的ex vivo模拟白内障手术模型的建立方法，该模型可用于研究上皮组织在其原生微环境中对损伤的反应机制。
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本文内容
摘要
摘要
上皮组织执行伤口修复机制的主要障碍在于缺乏足够的模型来追踪和操控伤口反应 离体 在高度模拟上皮组织损伤的环境中 体内。这一问题通过构建具有临床相关性的上皮组织得以解决 离体 基于白内障手术的损伤-修复模型。在此培养模型中，可以在晶状体上皮细胞的天然微环境中实时观察其对损伤的反应，并可在修复过程中方便地操控参与伤口修复的分子介质。制备该培养体系时，首先将晶状体从眼球中取出，并在晶状体前部做一个小切口，随后从中移除内部的晶状体纤维细胞团块。该操作在晶状体后囊膜上形成一个环形伤口，后囊膜是包裹晶状体的较厚的基底膜。纤维细胞被移除所形成的伤口区域，紧邻一层完整的单层晶状体上皮细胞，这些上皮细胞在手术过程中仍与晶状体囊膜保持连接。作为发育过程中纤维细胞来源的上皮细胞，在纤维细胞被移除造成损伤后，会启动修复反应，由富含波形蛋白的修复细胞群体引领，带动上皮细胞集体迁移跨越伤口区域，这些修复细胞的间充质前体细胞为晶状体自身所固有。1。这些特性是正常上皮伤口愈合反应的典型特征。在此模型中，随着 体内，伤口修复依赖于内源性环境所提供的信号，而这种信号环境在此处具有独特性并得以维持 离体 培养系统，为发现上皮损伤后修复调控机制提供了理想机会。
引言
具有临床相关性的模拟白内障手术 离体 此处描述的上皮伤口愈合模型旨在为研究上皮组织在损伤后修复过程中所涉及的调控机制提供一种工具。在构建该模型时所追求的关键特征包括：1）提供能够紧密模拟体内环境的条件 体内 在培养环境中对损伤产生反应、2）易于调控修复的调节元件，以及3）能够实时完整成像修复过程。因此，挑战在于建立一种可在细胞天然微环境中研究和操控上皮伤口修复的培养模型。该伤口修复模型的建立为识别来自基质蛋白、细胞因子和趋化因子的内源性信号分子提供了新的可能性，这些信号分子参与调控修复过程。此外，该模型非常适用于研究上皮如何以集体迁移的方式移动，实现伤口区域的再上皮化 2,3，以及确定伤口边缘发挥引导受损上皮集体迁移功能的间充质前导细胞的谱系 4该模型还提供了一个平台，可用于鉴定能够促进有效伤口愈合并防止异常伤口修复的治疗方法。5.
已有多种可用于体外培养和体内研究的伤口修复模型 体内，这些模型提供了目前关于伤口修复过程的大部分知识。在动物损伤模型中，例如角膜 6-12 和皮肤13-17，可以在涉及所有可能参与修复过程的介质（包括血管系统和神经系统的作用）的背景下，研究组织对损伤的反应。然而，对实验条件的操控存在一定的局限性 体内，目前尚无法对修复反应进行成像研究 体内，随着时间....
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方案
以下方案符合托马斯·杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会指南以及视力研究中动物使用ARVO声明。
1. Ex Vivo 伤口培养的透镜装置与准备
- 在无菌超净工作台中放置三个100 mm的培养皿。将其中两个培养皿加入半量的Tris/葡萄糖缓冲液（TD缓冲液；140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2PO4，5 mM D-葡萄糖，8.25 mM Tris碱，用HCl调节pH至7.4）于室温下处理，第三个孔保持空白。将培养基（199培养基添加1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）预热至37oC.
注意：标准的伤口愈合培养基为无血清，以模拟体内情况 体内然而，伤口修复培养物可在包含血清或其他因子的限定培养基条件下成功培养。 - 从孵育器（保持在37.7°C并轻轻摇动）中取出受精的15日龄白来航鸡胚蛋
- 将选定的卵置于超净工作台中，用洗瓶中的70%乙醇清洁卵壳外部。以下所有操作均须在超净工作台内无菌条件下进行，使用无菌溶液和无菌器械。
- 将鸡蛋打碎，倒入空的100 mm培养皿中。使用标准镊子和精细剪刀切除鸡胚头部。将鸡胚头部置于含有TD缓冲液的培养皿中，并妥善处理鸡胚其余部分。可选择将鸡胚头部在TD缓冲液中短暂保存，时间不超过15分钟。
- 将鸡胚....
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结果
离体 在细胞天然微环境中研究伤口愈合过程的模型
为了研究在细胞天然微环境中调控上皮组织伤口愈合的机制，建立了一种具有临床相关性的ex vivo模拟白内障手术模型。该模型由晶状体组织构建而成，因其固有特性而具有诸多优势：1）晶状体是一个自成一体的器官，周围包裹着一层称为晶状体囊的厚基底膜；2）无血管；3）无神经支配；4）无相关间质组织。因此，所观察的修复过程仅限于晶状体本身固有的细胞。为建立该模型，从胚胎第15天（E）的鸡胚中取出晶状体（图1A）。在前部晶状体囊及其附着的晶状体上皮细胞上做一个小切口，通过水力乳化法去除晶状体纤维细胞团块——这是一种经典的白内障手术操作，可产生生理相关的损伤（图1A）。晶状体上皮细胞在晶状体囊的前部和赤道部呈连续单层分布，包围着纤维细胞团块，同时其内源性的富含波形蛋白的间充质修复细胞前体1在纤维细胞提取过程中仍保留在晶状体内（图1A）。在去除纤维细胞团块后，于晶状体囊前部做五个切口，并将晶状体上.......
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讨论
此处介绍一种用于制备伤口修复培养模型的技术，该技术涉及进行一项操作 离体 从鸡胚眼球中取出晶状体后进行白内障手术。晶状体上皮对这种具有临床相关性的损伤作出反应，启动一种修复过程，该过程与体内发生的修复过程高度相似 体内，并与其他上皮组织的伤口修复具有共同特征2,4尽管该方案简单易行，但在使用胚胎晶状体进行模拟白内障手术时，需要掌握处理微小组织的操作技巧，这些技能可通过练习逐步获得，因为胚胎晶状体的直径仅约2 mm。白内障手术操作在解剖显微镜下进行，关键技术步骤包括在晶状体前囊上制作一个小切口，通过水剥离法去除纤维细胞团块，以及在前部上皮细胞层进行额外切割，以便将其展平 离体 白内障手术后，将固定在基质上的晶状体组织用于体外培养研究。显微外科白内障手术可产生高度可重复的损伤区域，暴露出组织内源性基底膜的圆形区域，受损的上皮细胞在伤口闭合过程中会迁移至该区域。该模型已被用于研究上皮组织伤口修复的调控机制，包括上皮细胞如何集体迁移进入伤口区域。 30 伤口边缘一群富含内源性波形蛋白的间充质谱系修复细胞的领头细胞功能1,23........
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院向 A.S.M. 提供的基金资助（项目编号：EY021784）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | 在 TD 缓冲液中使用浓度为 140 mM |
| 氯化钾 (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | 在 TD 缓冲液中使用浓度为 5 mM |
| 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | 在 TD 缓冲液中使用浓度为 0.7 mM |
| D-葡萄糖（右旋糖） | Fisher Scientific | D16-500 | 在 TD 缓冲液中使用浓度为 0.5 mM |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-1 | 在 TD 缓冲液中使用浓度为 8.25 mM |
| 盐酸 | Fisher Scientific | A144-500 | 用于将 TD 缓冲液 pH 调至 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-谷氨酰胺 | Corning/CellGro | 25-005-CI | 在 Media199 中使用浓度为 1% |
| 青霉素/链霉素 | Corning/CellGro | 30-002-CI | 在 Media199 中使用浓度为 1% |
| 100 mm 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup 滤器装置 | Millipore | SCGPU01RE | 用于过滤除菌培养基 |
| Dumont #5 镊子（需 2 把） | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm 细胞培养皿 | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip 带精密针头 | BD | 309623 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 标准镊子 | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| 其他所需物品：常规解剖器械， 白来航鸡受精蛋，检查用蛋孵箱（加湿，37.7°C），超净工作台，双目立体解剖显微镜 |
参考文献
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D.
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