建立临床相关离体调查上皮创伤修复的微环境本地人模拟白内障手术模型

Summary

这里描述的是建立临床相关的离体模拟白内障手术模型，该模型可用于研究上皮组织在其天然微环境中的损伤反应机制。

Abstract

了解上皮组织如何执行伤口修复的主要障碍是模型的可用性有限，在这些模型中，可以在与体内上皮组织损伤非常相似的环境中跟踪和纵离体伤口反应。通过创建基于白内障手术的临床相关的上皮离体损伤修复模型，解决了这个问题。在这种培养模型中，晶状体上皮对伤口的反应可以在细胞的天然微环境中实时跟踪，并且在修复过程中很容易纵伤口修复的分子介质。为了准备培养物，从眼睛中取出晶状体，并在晶状体的前部做一个小切口，从中去除晶状体纤维细胞的内部团块。该手术会在晶状体后囊（围绕晶状体的厚基底膜）上形成一个圆形伤口。纤维细胞附着的这个伤口区域位于连续的单层晶状体上皮细胞附近，该细胞在手术过程中仍然与晶状体囊相连。受伤的上皮细胞是发育过程中衍生纤维细胞的细胞类型，通过集体穿过伤口区域来响应纤维细胞去除的损伤，由一群富含波形蛋白的修复细胞领导，其间充质祖细胞是晶状体的内源性¹。这些特性是正常上皮伤口愈合反应的典型特征。在该模型中，与体内一样，伤口修复依赖于内源性环境提供的信号，该信号在该离体培养系统中独特维持，为发现受伤后调节上皮修复的机制提供了理想的机会。

Introduction

临床相关，模拟白内障手术，这里所描述的体外上皮伤口愈合模型的开发是为了提供调查，在响应于损伤调节修复上皮组织的机制的一种工具。在创建该模型旨在为关键特征包括1）提供条件精密地复制在体内响应于伤人在培养设置，2）缓和调制修复的调控元件，以及3）能力图像的修复过程中，其整体，在实际时间。我们面临的挑战，因此，是在细胞的天然微环境创造一种文化模式，即有可能学习和操作，上皮创面修复。这种创伤修复模型的有效性开辟了新的可能性，标识来自调节修复过程基质蛋白，细胞因子和趋化因子的内源性信号提示。另外，该模型是理想的研究如何一Ñ ​​上皮能够移动作为集体片重新epithelialize伤口区域^2,3，和用于确定在伤口边缘起作用的引导受伤上皮⁴的集体迁移间充质领袖细胞的谱系。这种模式还提供了一个用以标识疗法，可以有效的促进伤口愈合，防止异常创面修复⁵的平台。

目前已经有许多可用的创伤修复模式，无论是在文化和体内 ，它提供了当今大多数所谓对伤口修复过程。在动物损伤模型，如角膜^6-12和皮肤^13-17，有研究的组织的响应伤人的所有修复介质是可以参与的过程中，包括来自所述的上下文中，机会血管和神经系统。但是，也有限制操纵experi体内的精神的条件下，它是目前无法进行体内修复反应的成像研究，随时间连续。....

Protocol

下面的协议符合托马斯·杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会的指导方针，并与ARVO声明为动物的视觉研究使用。

1.安装镜头，并准备于离体培养伤口

1. 将3座100 25mm培养皿在无菌的层流罩。填充两个的中途用Tris /葡萄糖缓冲培养皿（TD缓冲器; 140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，0.7毫的Na ₂ PO _4，5mM的D-葡萄糖，8.25毫摩尔Tris碱，pH值至7.4，用HCl）在RT ，留下第三空。预暖培养基（媒体199补充有1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素）至^37℃。
   注意:标准伤口愈合的培养基是无血清，如发生在体内 ;然而，在伤口修复培养可以成功地在确定的培养基条件包括血清或其他因素生长。
2. 沃取出胚胎ðAY从孵化器15白来航鸡鸡蛋（37.7℃，温和的摇摆举行）
3. 放置在层流罩和清洁外壳用70％的乙醇从洗瓶选择蛋。进行在层流罩下面在无菌条件下所有的程序，用无菌溶液和仪器。
4. 裂纹蛋和地点的内容为空百毫米培养皿。使用标准镊子和剪刀精胚斩首。将鸡胚头中含有的TD缓冲培养皿并适当处理的胚胎的其余部分。任选保持于TD缓冲鸡胚磁头的短时间内，不超过15分钟。
5. 将鸡胚头部上的培养皿盖。采用高精度镊子，随着从眼及其连接玻璃体以下顺序取下镜片。捏眼睛后部与镊子创建一个小的开口在眼睛....

Results

离体模型创建研究伤口愈合过程中的细胞的天然微环境

调查涉及细胞的微环境原生内调节上皮伤口愈合机制，创建了一个临床相关的体外模拟白内障手术模式。这个模型是从晶状体组织提供了许多优点，由于其内在特性创建:1）透镜是一个自包含的器官由粗基底膜称为晶状体囊包围; 2）它是无血管，3）没有神经支配和4）免费相关基质。因此，检查了修复过程仅限于细胞是先天的透镜适当。为了创建这个模型中，透镜从胚胎（E）的第15天的小鸡胚胎（ 图1A）除去。一个小切口，在晶状体前囊和其相关联的晶状体上皮细胞，通过该透镜纤维细胞块被移除通过水力洗脱，创建一个生理相关伤人（ 图1A）的经典白内障的过程。的晶状体上皮，这是目前作为沿前细胞和晶状体囊的赤道方面围绕纤维细胞块，连同其内源性的波形蛋白富含间充质修复细胞祖细胞¹群的连续单层，在留在透镜提取纤维细胞（ 图1A）。在除去纤维细胞团，五切口的在晶状体囊的前方面和上皮扁平细胞面朝上，面向平台。此过程使受伤的上皮.......

Discussion

这里描述了一种制备伤口修复培养模型的技术，该技术涉及在从眼睛中取出鸡胚胎晶状体后对其进行 离体 白内障手术。晶状体上皮对这种临床相关的伤口做出反应，其修复过程与 体内发生的修复过程非常相似，并且与其他上皮组织中的伤口修复具有共同特征^2,4。虽然该方案简单明了，但使用胚胎晶状体进行模拟白内障手术需要培养处理小组织的技能，这些技能可以通过练习获得，因为胚胎晶状体的直径只有约 2 毫米。白内障手术程序在解剖显微镜下进行，关键的技术步骤包括在前囊上做一个小切口，通过水洗脱去除纤维细胞团，并在前上皮上进行额外的切口，从而可以将白内障手术后的 离体 晶状体组织压平在它固定在培养研究的基质上。显微外科白内障手术程序产生高度可重复的伤口区域，暴露组织内源性基底膜的圆形区域，受伤的上皮在闭合伤口时迁移到该区域。该模型已用于研究调节上皮伤口修复的机制，包括上皮细胞如何能够集体移动到伤口区域 ³⁰ 以及伤口边缘间充质谱系的内源性富含波形素的修复细胞群的前导细胞功能^1,23。

这种 <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氯化钠 （NaCl）	Fisher Scientific	S271-3	中以 140 mM 使用
Potassium Potassium （KCl）Fisher	Scientific	P217-500	在 TD 缓冲液中以 5 mM 使用
磷酸钠 （Na2HPO4）	Sigma	S0876	中以 0.7 mM 使用
希尔科学	D16-500		在 TD 缓冲液中以 0.5 mM 的浓度使用
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	在 TD 缓冲液中以 8.25 mM 的浓度使用
酸	Fisher Scientific	A144-500	用于 pH TD 缓冲液至 7.4
培养基 199	GIBCO	11150-059
L-谷氨酰胺	Corning/CellGro	25-005-CI	在培养基中以 1% 使用199
青霉素/链霉素	Corning/CellGro	30-002-CI	在 Media199
100 mm 培养皿	舍尔科学	FB0875711Z
Stericup 过滤装置	Millipore	SCGPU01RE	用于过滤灭菌培养基
Dumont #5 镊子（需要 2 个）	Fine Science Tools	11251-20
35 mm 细胞培养皿	Corning	430165
27 G 1 ml SlipTip 带精密滑针	BD	309623
精细剪刀	精细科学工具	14058-11
标准镊子	精细科学工具	91100-12
其他所需物品：通用解剖仪器，  受精白来角鸡蛋，检查鸡蛋孵化器（加湿，37.7°;C）、层流罩、双目立体影像解剖显微镜