miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

摘要

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。

摘要

光学分辨率的局限性以及在透射电子显微镜中识别特定蛋白质群体的挑战，一直是细胞生物学领域的障碍。许多现象无法通过 体外 简化系统中的分析需要额外的结构信息 原位，尤其是在1 nm至0.1 µm范围内，以实现充分理解。本文结合电子能谱成像技术（一种透射电子显微镜技术，可同时绘制蛋白质和核酸的分布图）与表达标签miniSOG，用于研究DNA双链断裂修复焦点的结构与空间组织。

引言

尽管近年来光学显微镜技术取得了显著进展¹，细胞生物学家仍然面临分辨率上的局限，这限制了对涉及大分子复合物协同相互作用的基本细胞过程中结构与功能关系的理解例如在染色质重塑、DNA修复、RNA转录和DNA复制等过程中，染色质结构的解析至关重要。尽管透射电子显微镜（TEM）能够提供所需的分辨率，但由于无法在标记特定蛋白质的同时确定所观察结构的生物化学组成，这些过程的结构解析一直面临挑战。由于细胞核内缺乏可用于区分核结构的内膜系统，核内结构的识别尤为困难。电子光谱成像（ESI）技术在一定程度上克服了这些局限，能够同时检测并区分基于DNA、RNA和蛋白质的核结构。^2-5.

电子能谱成像：

为了在电子显微镜中以高灵敏度和高分辨率绘制元素分布图，可以使用成像谱仪，该谱仪能够选择因与样品中元素的内壳层电子相互作用而发生非弹性散射的电子⁶。由于样品中原子电离时会损失特定于元素的能量，因此可通过连接在电子显微镜上的谱仪将这些电子分离并成像。因此，对与样品相互作用后的电子能谱进行分析，可揭示样品元素组成的定性和定量信息⁷。当电子穿过样品时未损失能量，它们将出现在电子能量损失谱的“零损失峰”中。这些电子的丰度与样品的质量、密度和厚度相关，其组成包括那些在穿过样品过程中未与样品发生碰撞或未损失能量的电子。该信....

方案

1. 生成 miniSOG 细胞系

1. 在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中，将U2OS（人骨肉瘤）细胞培养于含有2 ml 低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的35 mm培养皿中，该培养基添加有10%胎牛血清（FBS）。
2. 当细胞融合度达到80%时，按照转染试剂生产商提供的方案，通过脂质体转染法将纯度合格（A269/280比值为1.8–2.0）的质粒构建体导入细胞，该质粒含有编码miniSOG和mCherry标记的修复蛋白的序列¹⁹。miniSOG表达质粒可从Tsien实验室订购： http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. 转染后两天，通过荧光激活细胞分选法筛选表达带有miniSOG和mCherry标签的重组蛋白的细胞。选择荧光强度中等的细胞，以避免过度表达的细胞²⁰。
4. 将阳性细胞接种于10 cm培养皿中，使用10 ml DMEM培养基进行培养，该培养基补充有10% FBS和0.6 µg/ml 筛选剂G418（遗传霉素）。
5. 当培养皿上出现可见克隆后，使用倒置荧光显微镜筛选mCherry阳性克隆，并用永久性记号笔在培养皿底部围绕其画圈。使用低倍率空气物镜（

结果

ESI

比较细胞核的ESI图像（图1）与传统的透射电镜图像（例如，图7-1），可以发现可清晰分辨的解剖结构显著增多。染色质脊呈黄色，小鼠细胞中的染色中心也较易识别。核仁因其圆形结构和不同颜色而易于与染色质区分，因为预先组装的核糖体除了富含磷的RNA外，还含有大量富含氮的蛋白质。周边染色质以薄层形式位于细胞核边缘，核孔则表现为富含氮的结构，中断了周边染色质的连续性。通常，核纤层可被观察为位于周边染色质外侧的一层极薄的蓝色区域。在细胞质中，可见许多富含磷的小颗粒，根据其大小、丰度及位于细胞核外的位置，可将其鉴定为核糖体。染色质之间的间隙表现为富含蛋白质的区域，即间染色质区，其中包含核体以及富含微小黄色信号的区域，如核糖核蛋白颗粒和核糖核蛋白颗粒簇（图2）。后者被称为间染色质颗粒簇，其特征是富集了前体mRNA剪接所需的蛋白质。图1B、C和D展示了其他已知结构的形态，如有.......

讨论

ESI 可作为研究细胞核内不同染色质状态和核糖核蛋白的优秀工具，因为它能够特异性地定位富含磷的区域。它显著提高了透射电子显微镜所能获得的细节量，并且不依赖于非特异性的染色方法。ESI 的一个缺点是在相同加速电压下需要比常规透射电子显微镜更薄的切片。这一问题可通过连续切片或采用断层成像方法加以克服²⁸。

尽管通过观察磷和氮的分布可以获得大量信息，但能够同时绘制特定蛋白质的分布图也具有重要意义。本文介绍的方法表明，电喷雾电离（ESI）可与基于邻苯二胺位点特异性聚合的方法相结合。虽然该方法并未为ESI增加一种全新的颜色，但在绘制蛋白质分布图方面显然具有实用价值，尤其适用于与染色质相互作用的蛋白质。如果研究需要同时可视化多种蛋白质群体，仍可采用免疫胶体金标记方法，但需在光氧化反应之前进行预包埋染色⁹。与稳定细胞系相比，瞬时转染的缺点在于不同细胞间的表达水平可能存在显著差异，从而难以找到多个表达标签蛋白量相近的细胞。因此，建议构建稳定细胞系。然而，在瞬时转染后，仍可通过荧光成像评估蛋白表达的相对水平，并筛选出中等表达水平的细胞进行后续分析。

.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
带网格的 35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-2-14-CGRD	不适用于浸没式物镜
LR White：丙烯酸树脂	emsdiasum	14381
LR White 加速剂	emsdiasum	14385
3,3′-四盐酸联苯胺二胺 10 mg 片剂	Sigma	D5905
细条纹格栅 300 目	SPI	1161123
钨尖实验室标记笔	emsdiasum	41148
四氧化锇	emsdiasum	19100
碳镀膜仪 208 碳	Cressington
超薄切片机 Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		甚至可兼容更早版本
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		甚至可兼容更早版本
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG 载体	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
铯-137 辐射源 "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	开源软件		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf 管	Fisherbrand	05-408-146
金刚石刀片 超薄 35°	Diatome
修块刀片 ultratrim	Diatome
二甲胂酸钠三水合物	emsdiasum	12300	注意：有毒！
戊二醛 EM 级 8%	emsdiasum	16020	注意：有毒！
磷酸氢二钠	emsdiasum	21180
磷酸二氢钠	emsdiasum	21190
多聚甲醛	emsdiasum	19202
四氧化锇 4% 溶液	emsdiasum	19150
倒置荧光显微镜 Axiovert 200M	Zeiss
盐酸	Fisherbrand	A142-212
氢氧化钠溶液 10 M	Fluka	72068
氧气	Medigas
3-氨基-1,2,4-三氮唑	Sigma	A8056
氰化钾	Sigma	207810	注意：有毒！
乙醇	emsdiasum	15058	注意：有毒！
单刃碳钢剃刀刀片	emsdiasum	71960	注意：锋利！
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	Life Technologies	16000-044
G418	Life Technologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
透射电子显微镜 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 能量过滤器	Gatan