使用静脉葡萄糖耐量试验表征非人灵长类动物的代谢状态

摘要

本实验方案的目的是介绍一种标准方法，用于对非人灵长类动物进行静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT），以评估其血糖控制能力，并判断其从健康到代谢紊乱状态的代谢状况。

摘要

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）在葡萄糖稳态特征描述中起着关键作用。结合摄食和禁食状态下的血清生化谱，包括血糖水平、HbA1c、胰岛素水平、饮食临床史、身体成分及体重状况，可对正常与异常的血糖调控进行评估。IVGTT的解读依赖于测定葡萄糖和胰岛素水平在右旋葡萄糖刺激后随时间的变化。需要考虑的关键指标包括：相对于T0（葡萄糖输注结束时）所达到的葡萄糖和胰岛素峰值水平、由前20分钟（T1至T20）快速葡萄糖清除斜率计算得出的葡萄糖清除率K、血糖恢复至基线水平所需的时间，以及曲线下面积（AUC）。这些IVGTT指标会随着葡萄糖稳态从健康状态向疾病代谢状态转变而呈现特征性变化⁵。本文将描述非人灵长类动物（恒河猴和食蟹猴）的特征，这些动物是人类2型糖尿病（T2D）最相关的动物模型，同时介绍这些动物从瘦健健康状态到肥胖代谢紊乱状态及T2D状态的IVGTT和临床特征^{8, 10, 11}。

引言

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）是一种便捷的功能性检测方法，常规用于测定人类在不同代谢状态下β细胞的功能^{5, 7}。在2型糖尿病（T2D）的动物模型中，该方法被广泛认可为一种用于表征动物从健康状态向代谢紊乱性高血糖状态进展的工具^{8, 9}。最接近人类T2D的动物模型是非人灵长类动物（NHPs），其中以猕猴（rhesus）和食蟹猴（cynomolgus macaques）为典型代表。这些动物会自然发生T2D，其发病风险因素如年龄和肥胖与人类相似¹⁰。此外，随着代谢紊乱疾病的进展，其疾病进程和胰腺病理变化也与人类相似，均出现淀粉样物质沉积¹¹。

本文报道了我们在非人灵长类动物（NHP）群体代谢状态表征工作中，实施静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）的标准方法。与其他更为耗时且昂贵的技术相比，该方法操作简便²。IVGTT可用于对大量动物群体进行快速、频繁的表征。结合糖化血红蛋白（HbA1C）水平、动物的饮食及摄食史，以及其瘦体质量百分比和体脂百分比，IVGTT通常足以评估动物的代谢状态及其向显性糖尿病发展的进程^{6, 8}。

HbA1C 反映了红细胞寿命期间的平均血糖水平，可作为过去六周至三个月内血糖水平的可靠指标。在静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）的空腹基线血样中测得该值时，能够反映两次实验操作间隔期间的血....

方案

所有动物实验均经位于北卡罗来纳州研究园区（NCRC）的大卫·H·默多克研究所动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准编号为14-017，项目名称为“糖尿病及糖尿病前期/胰岛素抵抗非人灵长类动物模型的表征及改善胰岛素敏感性和代谢功能治疗药物的有效性研究”。

1. 动物选择与研究准备

1. 根据每月的食物摄入量和体重记录，选择饮食和体重稳定的动物。
   注意：近期食欲下降的动物，应在食物摄入量稳定之前避免进行表征。
   1. 对于成年动物（> 5 - 6 年），若其连续月份之间的体重差异超过10%，在未对动物进行检查并排除除代谢状态改变以外的其他原因之前，不应选择该动物。
2. 针对葡萄糖、胰岛素和C肽分析物，准备含有蛋白酶抑制剂（抑肽酶和DPP4抑制剂）的K₂EDTA样本采集管。
   注意：DPP4抑制剂与抑肽酶混合液可提供广谱的蛋白酶抑制作用，若需检测其他分析物（如胰高血糖素、GLP-1）时尤为适用。即使不检测额外分析物，血液采集管也应以相同方式制备，以保持样本采集的一致性。对于未使用本方法验证过的检测项目，应根据试剂制造商的建议单独采集样本。
   1. 通过将100 mg冻干抑肽酶与10 ml DPP4抑制剂混合，制备蛋白酶抑制剂混合液。每采集1 ml血液，向每支采血管中加入10 µl抑肽酶与DPP4抑制剂的混合液。
   <....

结果

所示结果 图1 展示了成年健康和糖尿病食蟹猴在30分钟静脉注射葡萄糖耐量试验（IVGTT）期间典型的葡萄糖和胰岛素曲线。健康猴与晚期糖尿病猴的数据被并列呈现，以对比代谢特征处于两个极端的动物之间存在的显著差异。作者已成功地在恒河猴中应用了该IVGTT方案，并获得了类似结果。

健康猕猴（恒河猴和食蟹猴）在空腹状态下的基础血糖值可低至50至60 mg/dl ⁸。如图所示，健康非人灵长类动物在T3时间点测得的初始血糖升高幅度可能仍低于糖尿病动物的典型基础血糖值，后者通常超过200 mg/dl。在随后的30分钟内，健康动物的血糖水平通常会恢复至基础值，而代谢异常和糖尿病动物则无法实现这一恢复过程（图1；实线）。健康动物伴随的胰岛素曲线呈现两个峰值（图1；蓝色虚线），分别对应血糖浓度最初的快速下降阶段（第一时相），这一过程在很大程度上由胰岛.......

讨论

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）通过基于体重的单次右旋葡萄糖输注来评估葡萄糖刺激的胰岛素释放能力^{5, 12, 13}。通过该检测可获得空腹血糖和胰岛素水平，并可评估动物释放胰岛素以及将升高的血糖水平恢复至基线的能力。这为使用者提供了信息，可用于将动物表征为血糖和胰岛素水平正常的健康对照、血糖正常但伴有高胰岛素血症的代谢紊乱动物，或高血糖且胰岛素抵抗的糖尿病动物。

在输注葡萄糖后，尤其是早期时间点的血液样本，必须及时且一致地采集和处理。这将减少个体内部和个体之间的变异，并降低数据时间顺序出错的可能性。T3时间点的准确性至关重要，因为血浆葡萄糖浓度从基线到输注葡萄糖后3分钟内的变化幅度是用于评估动物代谢状态的终点指标之一。在输注葡萄糖后的前7至10分钟内，葡萄糖清除率会出现下降，若未能按时采血，这一变化可能被遗漏。葡萄糖和胰岛素曲线在该时间段内的曲线下面积被用作终点指标，突显了这些早期时间点的重要性。如果T3之后的采血时间延迟，操作仍可继续，但应记录实际采血时间，以尽可能保留曲线的真实形态。尤其重要的是，任何超过一分钟的偏差都必须被记录并报告。在最初的十分钟之后，葡.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Allegra X-15R 离心机			血浆：4 °C，3,000 rpm，离心 10 分钟
Sorvall ST16R 离心机			血清：22 °C，3,000 rpm，离心 10 分钟
Thermo Scientific -86 °C 超低温冰箱，Forma 88000 系列		型号：88500A
50% 葡萄糖（D50）	Webster	07-8008986	静脉输注葡萄糖溶液
3 ml 鲁尔锁注射器	Midwest Veterinary Suppy		连续采血
5 ml 鲁尔锁注射器	Midwest Veterinary Suppy		肝素化生理盐水冲洗
10 ml 鲁尔锁注射器	Midwest Veterinary Suppy		静脉输注 D50
2 x 2 纱布垫	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	干燥使用，或配合 70% 酒精及 2% 氯己定溶液使用
4 ml 血清分离管	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4	用于超生化检测的采血管
K2EDTA，2 ml	VWR	95057-239	采血管
抑肽酶，100 mg	Sigma	A1153-100MG	采血管蛋白酶抑制剂添加剂
22 G x 1" 导管	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	静脉导管
带帽注射塞	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	50% 葡萄糖输注端口
多孔胶带，1/2" x 10 码	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	固定导管和肝素锁
2% 氯己定溶液	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	导管部位准备
70% 乙醇	VWR	71001-654	导管部位准备
止血带	Webster	07-8003432
三通阀	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4	肝素锁
37" 延长管	Webster	07-8454200	肝素锁
Exel 50-60 cc LL 注射器	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	肝素化生理盐水冲洗
250 ml 袋装 0.9% 生理盐水	Webster	07-8365593	冲洗
1,000 U 肝素，10 ml	Webster	07-883-4916
氯胺酮（Ketaset）100 mg/ml	Fort Dodge	（AV 订购）
Precision Xtra 血糖试纸，50 片/盒	Abbott（American Diabetes Wholesale）	9381599728K7	检测基线及 T3 时点血糖水平
Masimo Rad 57	DRE	6052057V	脉搏血氧仪
Pavia 直肠温度计	Patterson	07-8391335
Precision Xtra 血糖仪	Abbott	9381599728K7	手持式血糖仪