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使用静脉葡萄糖耐量试验表征非人灵长类动物的代谢状态

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DOI：

10.3791/52895

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2016年11月13日

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular and Metabolism Group, Crown Bioscience

本文内容

摘要

本实验方案的目的是介绍一种标准方法，用于对非人灵长类动物进行静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT），以评估其血糖控制能力，并判断其从健康到代谢紊乱状态的代谢状况。

摘要

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）在葡萄糖稳态特征描述中起着关键作用。结合摄食和禁食状态下的血清生化谱，包括血糖水平、HbA1c、胰岛素水平、饮食临床史、身体成分及体重状况，可对正常与异常的血糖调控进行评估。IVGTT的解读依赖于测定葡萄糖和胰岛素水平在右旋葡萄糖刺激后随时间的变化。需要考虑的关键指标包括：相对于T0（葡萄糖输注结束时）所达到的葡萄糖和胰岛素峰值水平、由前20分钟（T1至T20）快速葡萄糖清除斜率计算得出的葡萄糖清除率K、血糖恢复至基线水平所需的时间，以及曲线下面积（AUC）。这些IVGTT指标会随着葡萄糖稳态从健康状态向疾病代谢状态转变而呈现特征性变化5。本文将描述非人灵长类动物（恒河猴和食蟹猴）的特征，这些动物是人类2型糖尿病（T2D）最相关的动物模型，同时介绍这些动物从瘦健健康状态到肥胖代谢紊乱状态及T2D状态的IVGTT和临床特征8, 10, 11。

引言

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）是一种便捷的功能性检测方法，常规用于测定人类在不同代谢状态下β细胞的功能5, 7。在2型糖尿病（T2D）的动物模型中，该方法被广泛认可为一种用于表征动物从健康状态向代谢紊乱性高血糖状态进展的工具8, 9。最接近人类T2D的动物模型是非人灵长类动物（NHPs），其中以猕猴（rhesus）和食蟹猴（cynomolgus macaques）为典型代表。这些动物会自然发生T2D，其发病风险因素如年龄和肥胖与人类相似10。此外，随着代谢紊乱疾病的进展，其疾病进程和胰腺病理变化也与人类相似，均出现淀粉样物质沉积11。

本文报道了我们在非人灵长类动物（NHP）群体代谢状态表征工作中，实施静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）的标准方法。与其他更为耗时且昂贵的技术相比，该方法操作简便2。IVGTT可用于对大量动物群体进行快速、频繁的表征。结合糖化血红蛋白（HbA1C）水平、动物的饮食及摄食史，以及其瘦体质量百分比和体脂百分比，IVGTT通常足以评估动物的代谢状态及其向显性糖尿病发展的进程6, 8。

HbA1C 反映了红细胞寿命期间的平均血糖水平，可作为过去六周至三个月内血糖水平的可靠指标。在静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）的空腹基线血样中测得该值时，能够反映两次实验操作间隔期间的血糖控制状况。如果动物自上次 IVGTT 后已从代谢紊乱发展为糖尿病状态，则 HbA1C 值显著高于此前数值表明这一转变在上次 IVGTT 后不久即已开始；而 HbA1C 值接近此前水平则提示其近期才发生转变。通常情况下，在恒河猴中，HbA1C 值超过 6% 被视为异常，提示血糖控制不良10, 23。

血糖水平的解读应结合动物整体的行为表现和一般健康状况进行。糖尿病猕猴与人类相似，会出现多食、多饮和多尿的症状。群养动物会给这些指标的测量以及代谢紊乱和糖尿病猴个体化护理带来显著挑战。我们建议将动物单独饲养，以便提供更个性化的护理，并更方便地监测猴只健康状况的行为学标志8。此外，糖尿病猕猴还会出现体重下降，血脂水平升高（胆固醇升高、高甘油三酯血症）以及血清化学检测中矿物质代谢紊乱。检测血清化学中肝肾功能的指标非常重要，因为这些器官的损伤常常是进展性代谢障碍/糖尿病的并发症，并可能共同导致血糖、血脂和矿物质代谢失衡9, 11, 18, 24。

采用该方法时，猴子在整个生命周期内通过多次、频繁表征所产生的历史数据具有特别重要的价值。当需要进行其他操作（如葡萄糖钳夹或梯度葡萄糖输注（GGI））以全面评估动物健康状况时，通常是在初次表征阶段，而此时其历史数据尚不可获得。然而，一旦建立了基线，通常每三个月进行一次重复的静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）就足以追踪动物的进展情况。当动物根据其代谢状态在一年内参与多个研究时，这一点尤为重要。尽管动物的健康状况可能在数年内保持相对稳定，但当其代谢状态恶化时，胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良可能会迅速显著加剧。在相隔三个月的实验程序之间，HbA1C值可用于对动物健康状况的下降或改善趋势进行一定程度的插值推断。因此，该方法非常适合用于在动物自然生命周期内开展的多个纵向研究中的动物表征工作。

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方案

所有动物实验均经位于北卡罗来纳州研究园区（NCRC）的大卫·H·默多克研究所动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准编号为14-017，项目名称为“糖尿病及糖尿病前期/胰岛素抵抗非人灵长类动物模型的表征及改善胰岛素敏感性和代谢功能治疗药物的有效性研究”。

1. 动物选择与研究准备

  1. 根据每月的食物摄入量和体重记录，选择饮食和体重稳定的动物。
    注意：近期食欲下降的动物，应在食物摄入量稳定之前避免进行表征。
    1. 对于成年动物（> 5 - 6 年），若其连续月份之间的体重差异超过10%，在未对动物进行检查并排除除代谢状态改变以外的其他原因之前，不应选择该动物。
  2. 针对葡萄糖、胰岛素和C肽分析物，准备含有蛋白酶抑制剂（抑肽酶和DPP4抑制剂）的K2EDTA样本采集管。
    注意：DPP4抑制剂与抑肽酶混合液可提供广谱的蛋白酶抑制作用，若需检测其他分析物（如胰高血糖素、GLP-1）时尤为适用。即使不检测额外分析物，血液采集管也应以相同方式制备，以保持样本采集的一致性。对于未使用本方法验证过的检测项目，应根据试剂制造商的建议单独采集样本。
    1. 通过将100 mg冻干抑肽酶与10 ml DPP4抑制剂混合，制备蛋白酶抑制剂混合液。每采集1 ml血液，向每支采血管中加入10 µl抑肽酶与DPP4抑制剂的混合液。
    2. 为预防可能的采血过量，向每支采血管中额外加入10 µl蛋白酶抑制剂混合液。将处理后的采血管储存于-20 °C直至使用。操作过程中将采血管置于湿冰上，并在4 °C下离心。
    3. 使用血清分离管在基线时采集血液样本，用于常规血清生化分析。全血细胞计数（CBC）使用不含蛋白酶抑制剂的标准K2EDTA管。血液样本离心后，使用冻存管对血浆和血清进行分装。
    4. 正确标记采血管和冻存管，标注动物编号、日期、操作名称、采样时间点及样本体积。在冻存管上标注血浆中所含分析物，以便进行相应的检测。
  3. 通过将0.15 ml浓度为每毫升1,000 USP单位的肝素注入250 ml生理盐水袋中，配制肝素化生理盐水冲洗液，获得每毫升含0.06 mg肝素的溶液。抽取40 - 60 ml该溶液至盐水锁中，用于样本间冲洗。另分别抽取1 ml和5 ml至独立注射器中，用于葡萄糖输注前后对输注端口进行冲洗。

2. 动物镇静与准备

  1. 在实验操作前不少于14小时且不超过18小时，从动物笼中移除食物。
    注意：动物在实验前必须禁食，以避免餐后血糖值波动。同时，禁食也是为了防止动物在麻醉期间发生胃内容物反流和误吸。
  2. 在整个IVGTT实验过程中，通过肌肉注射给予氯胺酮（10 mg/kg）作为全身麻醉剂以镇静动物。在实验期间，每隔20至30分钟或根据需要追加给予氯胺酮（5 - 10 mg/kg）。
    1. 称量镇静后的动物体重。将动物置于加热的实验台上，保持侧卧位。
    2. 每15至20分钟监测一次临床参数，以确保动物处于稳定的麻醉状态。使用脉搏血氧仪测量心率（100 - 200 次/分钟）和SPO2（> 92%）。使用秒表测量呼吸频率（20 - 50 次/分钟），通过目视或手动计数15秒内的呼吸次数，再乘以4。通过直肠测量体温（> 97 °F）。监测牙龈和嘴唇周围黏膜的颜色（湿润、粉红色）。
  3. 准备两个插管部位。使用毛发剪刀修剪导管插入区域的毛发，并使用氯己定和70%酒精交替擦拭对整个区域进行消毒。
    1. 将一根导管插入左侧或右侧头静脉或隐静脉区域，并通过三通阀连接至肝素生理盐水冲洗液（0.06 mg肝素/ml）。此部位用于采血。
    2. 在另一条腿或手臂的头静脉或隐静脉区域插入第二根导管并连接一个接口。此部位用于葡萄糖输注。在葡萄糖输注前，使用少量（1 ml）肝素化生理盐水冲洗以保持导管通畅。

3. 静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）操作步骤

注意：IVGTT 过程包括 8 个采血取样时间点（表 1）。

  1. 采集基线样本，使用手持式血糖仪测量空腹血糖水平。同时采集血清样本用于常规生化分析，以及全血样本用于血常规（CBC）检测，以评估动物的整体健康状况。采集血浆样本，使用经制造商验证适用于猕猴的试剂盒，检测基线样本中的葡萄糖和胰岛素水平8, 9。
    注意：在采集任何血液样本前，应从导管中预先抽出0.5 ml的血液，以清除导管死腔中残留的血液或肝素。
  2. 获得基线样本后，通过葡萄糖输注端口在30秒内输注50%葡萄糖（250 mg/kg）。
    注意：可使用更高剂量的模型（500 mg/kg），但为了进行纵向比较，剂量应在各次实验中保持一致。
    1. 输注结束后，用5 ml肝素化生理盐水冲洗输注端口，确保其中无残留葡萄糖。输注结束的时间点定义为T0。操作人员应更换手套，以防输注过程中残留的葡萄糖污染后续血液样本。
  3. 葡萄糖输注后的第一个采样时间点为输注结束后的T3 min，随后依次为T5 min、T7 min、T10 min、T15 min、T20 min，最后一个采样时间点为T30 min。从每个时间点采集血浆样本，与基线样本一起用于检测葡萄糖和胰岛素水平（见步骤3.1）。
    1. 在T3 min时间点，再次使用手持式血糖仪检测血糖水平。
      注意：基线和T3 min时的血糖仪读数仅用于确认葡萄糖输注是否成功。T3 min时的血糖水平应比空腹基线血浆葡萄糖水平高出约100 mg/dl。

4. 动物恢复与样本处理

  1. 在T30 min时间点后移除套管，并对导管插入部位施加压力以止血。监测动物直至其恢复意识并能够坐起。待动物完全恢复后提供饲料。
  2. 立即将每份全血样本置于预冷的含K2EDTA的试管中，并置于冰上。采集后10分钟内于4 °C条件下以3,000 rpm离心。将血浆分装至冻存管中，冷冻后于-80 °C保存直至分析。
    1. 将用于常规血清生化分析的血清管中的血液在室温下静置，时间不少于20分钟且不超过30分钟，随后在室温下以3,000 rpm离心。血清样本在采集后48小时内进行检测前需冷冻保存。
      注意：用于全血细胞计数（CBC）分析的全血样本在采集后24小时内检测前应冷藏保存。

5. 数据处理

  1. 在建立血浆胰岛素和葡萄糖曲线后，根据高于基线的葡萄糖数值自然对数曲线的斜率，确定葡萄糖清除率 K16, 17。
    注：健康的非人灵长类动物（NHP）的葡萄糖清除率 K通常远高于1，常大于2或更高，因为健康动物的葡萄糖水平通常在30分钟内恢复至基线水平。随着胰岛素分泌减少，葡萄糖清除率K将显著下降，降至1以下。
  2. 将整个曲线下面积AUC计算为各时间点之间线段所构成梯形面积之和，直至T30时间点16, 17。
    注：传统上，该程序前10分钟的AUC被视为葡萄糖刺激的急性胰岛素反应（AIR），而程序最后20分钟的AUC则被视为晚期胰岛素反应（LIR）。当动物代谢功能逐渐紊乱时，胰岛素AUC会升高，反映出对日益加重的胰岛素不敏感性的代偿。然而，当动物进展至显性糖尿病阶段时，AUC将下降，通常首先表现为急性胰岛素反应阶段的降低，即AIR所反映的部分。

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结果

所示结果 图1 展示了成年健康和糖尿病食蟹猴在30分钟静脉注射葡萄糖耐量试验（IVGTT）期间典型的葡萄糖和胰岛素曲线。健康猴与晚期糖尿病猴的数据被并列呈现，以对比代谢特征处于两个极端的动物之间存在的显著差异。作者已成功地在恒河猴中应用了该IVGTT方案，并获得了类似结果。

健康猕猴（恒河猴和食蟹猴）在空腹状态下的基础血糖值可低至50至60 mg/dl 8。如图所示，健康非人灵长类动物在T3时间点测得的初始血糖升高幅度可能仍低于糖尿病动物的典型基础血糖值，后者通常超过200 mg/dl。在随后的30分钟内，健康动物的血糖水平通常会恢复至基础值，而代谢异常和糖尿病动物则无法实现这一恢复过程（图1；实线）。健康动物伴随的胰岛素曲线呈现两个峰值（图1；蓝色虚线），分别对应血糖浓度最初的快速下降阶段（第一时相），这一过程在很大程度上由胰岛...

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讨论

静脉葡萄糖耐量试验（IVGTT）通过基于体重的单次右旋葡萄糖输注来评估葡萄糖刺激的胰岛素释放能力5, 12, 13。通过该检测可获得空腹血糖和胰岛素水平，并可评估动物释放胰岛素以及将升高的血糖水平恢复至基线的能力。这为使用者提供了信息，可用于将动物表征为血糖和胰岛素水平正常的健康对照、血糖正常但伴有高胰岛素血症的代谢紊乱动物，或高血糖且胰岛素抵抗的糖尿病动物。

在输注葡萄糖后，尤其是早期时间点的血液样本，必须及时且一致地采集和处理。这将减少个体内部和个体之间的变异，并降低数据时间顺序出错的可能性。T3时间点的准确性至关重要，因为血浆葡萄糖浓度从基线到输注葡萄糖后3分钟内的变化幅度是用于评估动物代谢状态的终点指标之一。在输注葡萄糖后的前7至10分钟内，葡萄糖清除率会出现下降，若未能按时采血，这一变化可能被遗漏。葡萄糖和胰岛素曲线在该时间段内的曲线下面积被用作终点指标，突显了这些早期时间点的重要性。如果T3之后的采血时间延迟，操作仍可继续，但应记录实际采血时间，以尽可能保留曲线的真实形态。尤其重要的是，任何超过一分钟的偏差都必须被记录并报告。在最初的十分钟之后，葡...

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披露

作者隶属于一家在代谢疾病领域活跃的合同研究组织（Crown Bioscience）。

致谢

作者谨此感谢DHMRI CLAS动物护理团队的大力支持，以及设施主管Daniel Peralta先生和驻场兽医Glicerio Ignacio博士（DVM MRCVS）的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Allegra X-15R 离心机血浆：4 °C，3,000 rpm，离心 10 分钟
Sorvall ST16R 离心机血清：22 °C，3,000 rpm，离心 10 分钟
Thermo Scientific -86 °C 超低温冰箱，Forma 88000 系列型号：88500A
50% 葡萄糖（D50）Webster07-8008986静脉输注葡萄糖溶液
3 ml 鲁尔锁注射器Midwest Veterinary Suppy连续采血
5 ml 鲁尔锁注射器Midwest Veterinary Suppy肝素化生理盐水冲洗
10 ml 鲁尔锁注射器Midwest Veterinary Suppy静脉输注 D50
2 x 2 纱布垫Midwest Veterinary Suppy366.23000.4干燥使用，或配合 70% 酒精及 2% 氯己定溶液使用
4 ml 血清分离管 Midwest Veterinary Supply366.45000.4用于超生化检测的采血管
K2EDTA，2 mlVWR95057-239采血管
抑肽酶，100 mgSigmaA1153-100MG采血管蛋白酶抑制剂添加剂
22 G x 1" 导管Midwest Veterinary Suppy193.75250.2静脉导管 
带帽注射塞Midwest Veterinary Suppy001.11500.250% 葡萄糖输注端口
多孔胶带，1/2" x 10 码Midwest Veterinary Suppy001.85000.2固定导管和肝素锁
2% 氯己定溶液Midwest Veterinary Suppy193.08855.3导管部位准备
70% 乙醇VWR71001-654导管部位准备
止血带Webster07-8003432
三通阀Midwest Veterinary Supply366.28510.4肝素锁
37" 延长管Webster07-8454200肝素锁
Exel 50-60 cc LL 注射器Midwest Veterinary Suppy001.12250.2肝素化生理盐水冲洗
250 ml 袋装 0.9% 生理盐水Webster07-8365593冲洗
1,000 U 肝素，10 mlWebster07-883-4916
氯胺酮（Ketaset）100 mg/mlFort Dodge（AV 订购）
Precision Xtra 血糖试纸，50 片/盒Abbott（American Diabetes Wholesale）9381599728K7检测基线及 T3 时点血糖水平
Masimo Rad 57DRE6052057V脉搏血氧仪
Pavia 直肠温度计Patterson07-8391335
Precision Xtra 血糖仪Abbott9381599728K7手持式血糖仪

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