在生物液体介质中制备可扩展的高长径比金属纳米复合材料

摘要

本文介绍一种在生物条件下及液相介质中合成新型高长径比生物复合材料的实验方案。该生物复合材料的直径和长度分别可达到纳米级和微米级。铜纳米颗粒（CNPs）以及与胱氨酸联合使用的硫酸铜是合成该材料的关键组分。

摘要

本实验方案旨在描述两种具有高长径比结构的新型生物复合材料的合成方法。这些生物复合材料由铜和半胱氨酸组成，其中金属组分来源于铜纳米颗粒（CNPs）或硫酸铜。合成过程在液体中进行，并在生理条件（37 °C）下反应24小时后自组装形成复合物。一旦形成，这些复合物在液态介质和干燥状态下均表现出高度稳定性。复合物的长度尺度从纳米到微米级不等，直径范围从几微米至25 nm。场发射扫描电子显微镜结合能谱分析（EDX）结果显示，来源于纳米颗粒的线性结构中含有硫元素，而起始的CNP材料中则不含硫，从而证实半胱氨酸是最终纳米复合物中硫的来源。在线性纳米和微米复合物的合成过程中，反应容器中会形成多种不同长度的结构。实验表明，合成完成后对液体混合物进行超声处理，可通过延长超声时间来减小结构的平均长度，从而有效调控产物的平均尺寸。由于所形成的结构高度稳定、不发生团聚，且在液相中生成，因此也可采用离心法对合成的复合物进行浓缩和分离。

引言

铜是一种高反应活性的金属，在生物体系中，它对某些酶的功能至关重要^1,2，但在较高浓度下具有强烈毒性，包括以纳米颗粒形式存在时亦如此^3,4。随着铜纳米颗粒（CNP）及其他铜基纳米材料的应用日益广泛，由于纳米结构具有更大的比表面积，铜的毒性问题变得愈发重要。因此，即使少量的铜，若以纳米颗粒形式存在，也可能因其能够穿透细胞并分解为活性形式而引发局部毒性。某些生物物种能够与金属离子形成络合物并螯合这些离子，甚至可将金属整合入生物结构中，例如在海洋贻贝中已有相关描述⁵。在研究纳米材料潜在毒性效应的过程中⁴，研究人员发现，在常规细胞培养条件（37 °C 和 5% CO₂）下随着时间推移，可形成具有高长径比（线性）结构的稳定铜生物复合物。

通过排除法，最初在完全细胞培养基中发现的这些线性生物复合材料，被简化为一个定义明确的方案，仅需必要的组分即可实现生物复合材料的自组装。研究发现，利用两种起始金属组分即可实现两类高度线性生物复合材料的自组装：1）CNPs 和 2）硫酸铜，其共同的生物组分为胱氨酸。尽管此前已有报道更为复杂的含铜结构，如所谓的“海胆状”和“纳米花状”结构，具有纳米和微米尺度的特征，但这些结构是在非生物条件下制备的，例如在100 °C或更高温度下^6-8。据我们所知，在生物条件下于液相中可规模化合成独立的线性含铜纳米结构此前尚未见报道。

方案

1. 实验设计

1. 确定合成所需的铜纳米复合材料体积。根据此体积选择适量的小容量烧瓶（25 cm²）或下文所述的较大烧瓶，用于材料制备。
2. 本合成过程需使用37 °C、含5% CO₂且湿度至少为40%的培养箱。确保该培养箱可用，并在合成期间（约24小时）不会被频繁开启干扰。
   警告：频繁开关培养箱必然导致温度波动，可能影响纳米复合材料结构的正常合成。

2. 材料准备

1. 在实验开始前，将固体材料直接加入溶剂中，现配现用。不建议长时间将胱氨酸和铜起始原料的储备液保存在液体状态，否则可能导致实验结果不稳定。从供应商处取出后，用Parafilm封住容器口部，保持起始材料干燥。
   注意：以下方案以在25 cm²细胞培养瓶中进行反应为例，使用7 µl胱氨酸、6,643 µl无菌水和350 µl CNPs。
2. 通过称取至少2 mg CNPs，配制2 mg/ml的铜纳米颗粒溶液。此步骤中需佩戴一次性手套，避免CNPs与皮肤接触。将纳米颗粒置于一个空的无菌16 ml玻璃小瓶中。
   1. 向含有CNPs的小瓶中加入适量体积的无菌去离子水，配制成2 mg/ml的溶液，并涡旋震荡20秒，以在合成开始前使纳米颗粒充分分散（建议总体积至少为1 ml）。加水时不要超过小瓶容量的一半，以免影响涡旋混合效果。CNP....

结果

图1 展示了本研究中所述线性生物复合材料合成步骤的流程图示意图。以碳纳米颗粒（CNPs）或硫酸铜为起始材料，与无菌水混合制成 2 mg/ml 的溶液；该溶液经混合与超声处理以获得均匀混合物，随后按以下比例混合用于合成：949 份无菌水 : 50 份铜混合液 : 1 份胱氨酸储备溶液。实际体积可根据该比例相应增加或减少，以放大或缩小最终合成产物的产量。在如图所示条件下孵育至少 2 小时后，形成线性生物复合结构，随着时间推移，可通过普通白光显微镜或肉眼观察到液体溶液外观的变化。

图2 展示了在为期82小时的完整细胞培养基中首次发现这些线性结构的代表性结果。本实验室当时正在评估不同纳米材料（包括碳纳米颗粒）对正常细胞和癌细胞的潜在毒性，图中所示细胞即为 图2 是一种源自ATCC（CRL-2020）的快速生长的脑肿瘤细胞系。这些细胞所用完全培养基的一种关键添加成分是胱氨酸，而该成分恰好成为揭示培养物中为何形成这些线性结构的关键因素（见下文及讨论部分）。从最初均匀分散的CNPs迅速聚集成微结构（

讨论

在评估包括碳纳米颗粒（CNP）在内的纳米材料潜在毒性效应时，观察到在长期作用下，CNP从最初较为分散的颗粒分布逐渐转变为更大尺寸的聚集态（图2）。在某些情况下，这些在细胞培养皿中、生物条件下形成的高度聚集结构，会从中心聚集体延伸出高度线性的突起，类似于先前报道的含铜“海胆状”结构⁶。需要指出的是，在本研究展示的条件下，添加至细胞的CNP浓度为亚最大浓度，因此并未导致培养细胞全部死亡（见图2）。基于这些初步观察，后续实验通过逐步去除细胞培养条件中的各种组分（最终甚至去除细胞本身），以确定合成线性铜生物复合物所必需的关键成分。

我们发现，在适当的生物条件下，原始细胞培养物中添加的组分胱氨酸与碳纳米颗粒（CNPs）结合后，可导致纳米颗粒形态转变为一种高度线性的生物复合物，扫描电镜结合能谱分析（EDX）结果显示该复合物同时含有金属和生化组分（图5）。因此，硫元素在起始的CNP材料中并不存在，但在合成的生物复合物中呈现出显著的峰信号，表明铜和生化物质胱氨酸的组分对于线性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
迷你涡旋振荡器	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 培养箱型号 #2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	联系供应商	当前型号目录号 98000-360
Eppendorf 离心机（制冷型微量离心机）	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Prism R 型号
细胞培养离心机 Z323K 型	Labnet (http://labnetinternational.com/)	联系供应商	当前型号 Z206A，目录号 C0206-A
超声波破碎仪（超声波清洗器）	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
天平	Sartorius (http://dataweigh.com)		CP225D 型，类似型号 CPA225D
Olympus IX51 倒置光学显微镜	Olympus (http://olympusamerica.com	联系供应商
Olympus DP71 显微镜数码相机	Olympus (http://olympusamerica.com	联系供应商
外部电源装置 — Olympus 显微镜用白光光源	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X、20X 和 40X 显微镜物镜	Olympus (http://olympusamerica.com	联系供应商
扫描电子显微镜	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	S-4800 型
透射电子显微镜	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	Libra 120 型
台式单向气流洁净工作台	Envirco (http://envirco-hvac.com)	PNG62675 型	用于无菌细胞培养技术