施加诱导表达系统研究与细胞内信号细菌毒力因子的干扰

Summary

此处描述的方法用于在确定的步骤诱导凋亡信号级联反应，以解剖抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法还可用于促凋亡或毒性蛋白的诱导表达，或用于剖析对其他信号通路的干扰。

Abstract

这里提出的技术允许一个来分析在该步骤目标蛋白质，或者小分子，与信号传导途径的组分相互作用。该方法是基于，一方面，在一个特定的蛋白质的诱导表达引发的信令事件在所选择的信号级联限定和预定的步骤。相伴表达，另一方面，目的基因的则允许调查者评估，如果表达靶蛋白的活性被位于上游或发起信令事件的下游，根据所获得的信号通路的读出。这里，凋亡级联被选为一个定义信号传导途径来证明协议的功能。致病细菌，如贝氏柯克斯体 ，易位效应蛋白，与在宿主细胞宿主细胞死亡诱导干扰，以确保细菌存活的细胞，并促进其传播的生物体。 C.该贝氏柯克斯效应蛋白CAEB诱导细胞凋亡与UV光或具有星形孢菌素后有效抑制宿主细胞死亡。来缩小在该步骤CAEB干扰凋亡信号的传播，选择蛋白与充分表征的促凋亡活性在多西环素可诱导的方式瞬时表达。如果CAEB充当这些蛋白质的上游，将细胞凋亡进行畅通无阻。如果CAEB行为下游，细胞死亡会被抑制。选择的试验蛋白质分别为Bax蛋白，其作用在线粒体水平，和caspase 3，这是主要的刽子手蛋白酶。 CAEB干扰诱导Bax表达的细胞死亡，而不是由胱天蛋白酶3的表达。 CAEB，由此，交互这两种蛋白质之间的凋亡级联。

Introduction

许多革兰氏阴性细菌病原体的毒力取决于专门的分泌系统劫持真核宿主细胞。细菌利用这些分泌系统注入细菌毒性蛋白（效应物）到宿主细胞来调节各种细胞和生化活性。效应蛋白的研究不仅提供了卓越的洞察宿主/病原体相互作用的基本方面，但也到真核细胞¹的基础生物学。宿主细胞凋亡的调节已被证明是一种重要的毒力机制的许多细胞内病原体，和一些效应蛋白调节细胞凋亡已经确定^2-9。然而，他们的活动的精确的分子机制仍然是难以捉摸的，在许多情况下。

细胞凋亡，程序性细胞死亡的一种形式，在免疫应答中起重要作用，以感染^10。导致细胞凋亡的两个主要途径有已经确定:针对线粒体（内在凋亡）或信号的直接转导通过细胞死亡受体在质膜（外源性凋亡）。本征或线粒体介导的细胞死亡途径由细胞内信号所触发的，并涉及Bax和Bak的，所述的Bcl-2家族的两个促凋亡成员的活化。这家由控制细胞死亡^11-14亲和抗凋亡调节蛋白。细胞凋亡的激活导致低聚的Bax和Bak的后跟线粒体外膜的随后通透性，导致细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素c释放引发的凋亡小¹⁵激活效应半胱氨酸蛋白酶3和7通过激活caspase 9的。这导致选择底物，除其他外，导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面¹⁶的暴露的蛋白水解，并释放一个专用的DNase该片段沟道romatin ^17,18。

为了确定在凋亡级联的个体效应蛋白干扰内，可诱导的表达系统被雇用^19。管制系统，转基因的条件式已在分析过程中发生，发展和维持疾病^20-23的细胞内的蛋白质的功能或它的对组织，器官和生物体发展的重要性，以及一个宝贵的工具。典型地，可诱导的控制系统，如四环素系统²⁴在这里使用的，形成人工转录单位（参见图1）。一种成分是一种叫做tTA的（四环素依赖性转录激活剂）人工工程转录因子，通过融合的细菌转录阻遏四面体²⁵到介导转录激活或沉默^24,26的哺乳动物蛋白结构域形成。第二组分是一种混合启动子，称为TRE（四环素响应元件），它由一个真核最小启动子的，含有至少一个TATA盒和转录起始位点，结合到同源DNA结合位点为四面体，TETO ^24,25的多个重复。第三成分是四面体，四环素或其衍生物，如无水四环素或强力霉素²⁵之一的天然配体。在配体加入到培养基中，四面体失去其亲和力TETO并从TRE解离。其结果，靶基因的转录被废除。转基因表达可以，因此，被严格控制在两个细胞培养物以时间和剂量依赖的方式和在动物^20,23,24。与tTA的，转基因的表达发生组成型，除了在四环素存在下进行。这可以是在细胞毒性或致癌蛋白的研究一个缺点，因为四环素首先必须从体系中除去，转基因expressio前n，将会和可监控单元上的靶蛋白的影响。这可能是耗时的并且不总是完全，特别是在转基因动物^27。为了解决此限制，一个四面体突变体具有逆响应于多西环素的存在被用来产生新的转录因子，rtTA（反向^TTA）28。它仅结合于TRE和，伴随，激活在强力霉素存在下转录。的系统， 即残余泄漏，在不存在TRE结合转录因子的转基因表达，始发或者（i）从位置效应在基因组整合位点，（ⅱ）从TRE本身^29，或（iii）来自非特异性tTA的/ rtTA ²⁸的结合，是通过引入一个附加的转录消音处理，称为TTS（四环素依赖的转录的消音器^）30到系统。它形成了一个双重调节网络一起rtTA（ 见图1）。在没有强力霉素，TTS结合TRE积极关闭任何剩余的转录。在强力霉素存在时，TTS解离TRE和rtTA具约束力同时诱导靶基因的表达。严紧的这个附加层往往是必要的，表达高活性细胞毒性蛋白质^31-34。

使用这种严格控制的双调节器系统，细胞凋亡级联可以在限定的步骤，使给定的效应蛋白是否能够与细胞凋亡诱导干扰分析来启动。这种方法不仅可用于研究细菌效应蛋白的抗凋亡活性，但也可用于促凋亡或有毒的蛋白质的诱导表达，或用于解剖与其他信号传导途径的干扰。

Protocol

1.产生的稳定细胞系的利益表达的蛋白

1. 通过加入热灭活的FCS和1％青霉素/链霉素准备媒体市售Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM），补充有含有GlutaMAX-I，丙酮酸，和4.5g / L的D-葡萄糖。
2. 在5％CO ₂培养HEK293细胞中的媒体，在37℃。子培养细胞每三天。删除媒体和悬浮细胞15毫升新鲜培养基。吸管1毫升到一个新的75cm ²的细胞培养瓶中，并添加14毫升介质。
3. 通过使用血球分析细胞数量。
4. 种子HEK293细胞在6孔板中以每孔2×10 ⁵个细胞的密度，并培育24小时。
5. 转染使用由转染试剂的制造商提供的协议。转染使用转染试剂的细胞与载体pEGFP-C2或质粒pEGFP-C2-CAEB。在使用之前，预热染REAG耳鼻喉科和需要RT媒体。使用3:1的比例转染试剂与DNA。
   1. 详细地说，吸移管1.5微升转染试剂直接加入50微升无血清DMEM培养基。为复合物形成，吸取0.5的DNA编码GFP或GFP-CAEB到转染试剂含有混合物的微克孵育15分钟，在室温。
   2. 通过在逐滴方式加入，将反应混合物转染细胞并在5％CO ₂孵育在37℃下24小时。
6. 加入1毫克/毫升，在5％CO ₂的遗传霉素进行选择的GFP阳性克隆在37℃。
7. 6天后，分离单个细胞通过流式细胞术在一个96孔板窝藏介质和HEK293上清液在1排序:1的比例。产生从该均在4966×g下离心15分钟培养汇合HEK293细胞的HEK293上清液。
8. 在接下来的一天，更换培养基含有1.5培养基0毫克/ ml遗传霉素。更改每周一次的媒体。如果细胞形成汇合单层，将它们转移到一个24孔板中。 5在介质含有1.5毫克/ ml遗传:每周以1:1的比例分培养细胞两次。最后，分析GFP阳性细胞的免疫印迹分析的百分比和流式细胞术。

通过免疫分析稳定细胞系2.分析

1. 除去上清液，用温PBS洗涤一次附着的细胞。将细胞重悬于100微升的2×Laemmli样品缓冲液中，加热5分钟，在95℃，并储存在-20℃。
2. 加载在12％SDS-PAGE凝胶，每个样品约4×10 ⁴个细胞。此外，负载6微升市售蛋白质梯作为分子量标记物。 180伏的恒定电压下运行的凝胶电泳系统凝胶45-60分钟，用1×Laemmli的运行缓冲液。
3. 吸干蛋白到PVDF膜上（0孔径。为45μm），在16伏特用于使用一台转印迹SD半干转移细胞60分钟的恒定电压。
4. 块膜在10ml的5％脱脂奶粉的PBS / 0.05％吐温20（MPT）中1小时，在室温。
5. 稀释4微升抗GFP抗体在4毫升MPT和孵化膜O / N在4℃。
6. 执行三个10分钟的洗涤步骤，用10毫升的PBS / 0.05％吐温20。
7. 孵育膜用0.8微升辣根过氧化物酶缀合的第二抗体在4毫升的MPT的。
8. 1小时后在室温下孵育，洗膜三次，用PBS / 0.05％吐温20（如在2.6中描述），并根据制造商的方案检测辣根过氧化物酶活性用市售的试剂盒。适用标准装备片开发可视化蛋白质带。

3.分析使用流式细胞仪的细胞。

1. 重悬在PBS细胞。使用HEK293细胞作为阴性对照调整前进SC东北黑钙土（FSC）和侧向散射（SSC），以使细胞在规模。在排除细胞双峰，聚集和细胞碎片活细胞绘制一个门。
2. 调整光电倍增管（PMT）的增益，以使未染色细胞是在最左边的直方图的FL1通道（488纳米氩离子激光）的。
3. 为了分析的HEK293-GFP和HEK293-GFP-CAEB细胞的荧光强度打开FL1通道的直方图，并采集门控人口10,000个事件。
4. 分析使用商业FACS分析软件中的数据。

4.转染的稳定细胞系的诱导表达系统的

1. 种子HEK293细胞稳定表达GFP或GFP-CAEB在12孔板中以1×10 ⁵个细胞/孔的密度。
2. 19小时后播种，共转染的细胞，调节质粒和反应质粒编码两种或Bax蛋白活化的caspase 3。
   1. 共转染的稳定的HEK293细胞用100ng pWHE125-P调节器质粒（ 图2）和100ng的响应质粒pWHE655-hBax或pWHE655-revCasp3（ 图3）和0.4微升的聚乙烯亚胺。
   2. 制备的DNA和聚乙烯亚胺染试剂每75微升的Opti-MEM培养基中，孵育在室温，精确至5分钟。为复合物形成，孵育两种混合物一起进行15分钟，在室温。
3. 添加聚乙烯亚胺/ DNA溶液滴至细胞并在5％CO ₂孵育在37℃。

5.诱导细胞凋亡

1. 5小时转染后，通过加入1μg/ ml的多西环素的培养基中诱导的促凋亡蛋白的表达。在5％CO ₂孵育细胞18小时，在37℃。

宿主细胞凋亡的免疫分析6.分析

1. 检查之前H细胞在光学显微镜下arvesting检查细胞死亡诱导。细胞凋亡是可检测由死的细胞周围的凋亡小体的存在。
2. 除去上清液，用温PBS洗涤一次附着的细胞。将细胞重悬于100微升的2×Laemmli样品缓冲液中，加热5分钟，在95℃，并储存在-20℃。
3. 加载在12％SDS-PAGE凝胶，每个样品约4×10 ⁴个细胞。此外，负载6微升市售蛋白质梯作为分子量标记物。 180伏的恒定电压下运行的凝胶电泳系统凝胶45-60分钟，用1×Laemmli的运行缓冲液。
4. 吸干蛋白到PVDF膜（0.45微米孔径大小）以16伏特用于使用一台转印迹SD半干转移细胞60分钟的恒定电压。
5. 块膜在10ml的5％脱脂奶粉的PBS / 0.05％吐温20（MPT）中1小时，在室温。
6. 稀释4μ升反切割聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抗体在4毫升MPT和孵化O / N在4℃。
7. 执行三个10分钟的洗涤步骤，用10毫升的PBS / 0.05％吐温20。
8. 孵育膜用0.8微升辣根过氧化物酶缀合的第二稀释在4ml MPT抗体。
9. 1小时后在室温下孵育，洗膜三次，用PBS / 0.05％吐温20（如在6.7中描述），并检测辣根过氧化物酶的活性具有根据制造商的协议商业试剂盒。适用标准装备片开发可视化蛋白质带。
10. 30分钟，在室温下孵育除去结合的抗体用7ml Western印迹溶出缓冲区。
11. 洗涤三次后，用PBS / 0.05％吐温20（如在6.7中描述），探针与4微升抗肌动蛋白抗体的4ml MPT O / N在4℃下的膜。
12. 经过三次洗涤步骤，MPT（如6.7所述），孵化膜与0.8微升豪rseradish过氧化物酶缀合的二抗稀释于4ml的MPT的。
13. 1小时后在室温下孵育，洗膜三次，用PBS / 0.05％吐温20（如在6.7中描述和检测辣根过氧化物酶的活性通过根据制造商的协议商业试剂盒。应用的标准设备胶片显影可视化蛋白条带。
    注意:在板振荡器上在指定的时间和温度进行所有的孵育步骤。

Results

首先，将HEK293细胞系稳定表达的兴趣（CAEB）的蛋白质作为GFP融合蛋白分别建立。作为对照，将HEK293细胞系稳定表达GFP的也产生。 GFP和GFP-CAEB的表达通过免疫印迹分析证实。代表性免疫印迹（ 图4A）显示GFP和GFP-CAEB的稳定和清晰地可检测的表达。然而，这种分析不能确定所有的细胞是否表达GFP或GFP-CAEB。因此，稳定地转染的HEK293细胞系还通过流式细胞仪分析。 如图4B所示 ，将细胞在两种细胞系中的90％以上的表达绿色荧光蛋白。因此，这些稳定的细胞系可用于进一步分析CAEB的功能。在接下来的步骤中，CAEB的抗凋亡活性通过免疫印迹分析使用抗切割的PARP抗体检测。核的PARP蛋白裂解灭活DNA修复活性并且是TERMI的典型标志物细胞凋亡的最终阶段。在HEK293-GFP或HEK293-GFP-CAEB细胞中未检测PARP的裂解，这表明GFP既不GFP-CAEB的表达，也不是对细胞有毒。然而，当细胞用星形孢菌素处理过的，内在凋亡的有效诱导，PARP切割检测（ 图5）。重要的是，将HEK293-GFP...

Discussion

许多病原细菌怀有分泌系统分泌或易位细菌效应蛋白进入宿主细胞。这些效应蛋白具有调节在宿主细胞中的过程和途径，从而使细菌存活并在其各自的细胞内利基复制的能力。了解生化活动和效应蛋白的分子机制将有助于建立一个更好地了解致病性，并可能有助于开发新的治疗手段，以抗击疾病。另外，作为效应蛋白经常通过模仿宿主细胞活动发挥它们的功能，它们也可以被用来进一步了解真核细胞¹的生物学。然而，研究单个效应蛋白的生化活性已被证明是复杂的，原因如下:效应蛋白中1）的功能冗余，效应蛋白的接合2）的时间调节，以及3）短跑运动员器蛋白在环境中工作与其他效应蛋白，其功能的干扰。因此，效应蛋白质的活性，通常研究了过表达的研究。不幸的是，该效应蛋白的瞬时表达的使用也有几个缺点。因此，只有单细胞分析测定可以使用，并且如果效应蛋白的活性依赖于另一个效应蛋白的活性的效应蛋白的活性不能被分析。为了克服至少第一缺点，稳定的细胞系都可以使用。在情况下，效应器蛋白的表达是​​有毒的细胞，这是不适合的。在这种情况下，稳定的和可诱导的细胞系可以使用类似的系统被建立为我们在这里描述为细胞凋亡诱导蛋白（见下文）的瞬时表达。然而，我们的结果（ 图5）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	生命技术	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
笔/链球菌	生命技术	15140-122
OptiMEM	生命技术	51985
X-tremeGENE 9	罗氏	6365752001
遗传素	Roth	CP11.3
聚乙烯亚胺	Polyscienes	23966
多西环素	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD 半干式转印池	Bio-Rad	170-3940
PageRuler 预染蛋白质分子量标准	Thermo Scientific	26616
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
抗 GFP	life technologies	A6455
抗裂解 PARP	BD Bioscience	611038
抗肌动蛋白	Sigma Aldrich	A2066
小鼠 IgG （H+L）-HRPO	Dianova	111-035-062
兔 IgG （H+L）-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL 蛋白质印迹底物	Thermo Scientific	32106
Restore Plus 蛋白质印迹剥离缓冲液	Thermo Scientific	46428