应用可诱导表达系统研究细菌毒力因子对细胞内信号通路的干扰

摘要

本文所述方法用于在特定步骤诱导凋亡信号级联反应，以解析抗凋亡细菌效应蛋白的活性。该方法也可用于诱导表达促凋亡或毒性蛋白，或用于研究对其他信号通路的干扰作用。

摘要

本文介绍的技术可用于分析目标蛋白或小分子在信号通路的哪个步骤与通路组分发生相互作用。该方法一方面基于在选定信号级联中特定且预设的步骤诱导表达某一特定蛋白，以启动信号事件；另一方面同时表达目的基因，使研究者可根据信号通路的检测结果，判断所表达目标蛋白的活性位于该信号事件的上游或下游。在此，选择凋亡级联作为明确的信号通路，以演示本实验方案的功能性。致病菌如Coxiella burnetii可将效应蛋白转运至宿主细胞内，干扰宿主细胞的死亡诱导过程，从而确保细菌在细胞内的存活并促进其在机体内的扩散。C. burnetii的效应蛋白CaeB能有效抑制由紫外光或星形孢菌素诱导的宿主细胞凋亡。为了确定CaeB干扰凋亡信号传递的具体步骤，本研究选择性地瞬时表达若干已知具有明确促凋亡活性的蛋白，并采用多西环素诱导表达系统进行调控。若CaeB作用于这些蛋白的上游，则凋亡过程将不受阻碍；若CaeB作用于其下游，则细胞死亡将被抑制。所选的测试蛋白包括在线粒体水平发挥作用的Bax，以及作为主要凋亡执行蛋白酶的caspase 3。实验结果显示，CaeB可抑制由Bax表达引发的细胞死亡，但不能抑制由caspase 3表达引发的细胞死亡。因此，CaeB在凋亡级联中作用于这两个蛋白之间的环节。

引言

许多革兰氏阴性细菌病原体的毒力依赖于特化的分泌系统，以劫持真核宿主细胞。细菌利用这些分泌系统将细菌毒力蛋白（效应蛋白）注入宿主细胞内，从而调控多种细胞和生化活动。对效应蛋白的研究不仅极大地增进了人们对宿主/病原体相互作用基本机制的理解，也深化了对真核细胞基本生物学的认识¹。研究表明，调控宿主细胞凋亡是许多胞内病原体的重要毒力机制，目前已鉴定出多个调控凋亡的效应蛋白^2-9。然而，在许多情况下，这些蛋白精确的分子作用机制仍不清楚。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，在机体对感染的免疫应答中发挥重要作用¹⁰。目前已鉴定出两条主要的细胞凋亡通路：一条靶向线粒体（即内在凋亡通路），另一条通过细胞膜上的死亡受体直接传导信号（即外在凋亡通路）。内在或线粒体介导的细胞死亡通路由细胞内信号触发，涉及Bax和Bak的激活，二者是Bcl-2家族中的促凋亡成员。该家族由促凋亡和抗凋亡的调控蛋白组成，共同调控细胞死亡过程^11-14。凋亡激活后，Bax和Bak发生寡聚化，进而导致线粒体外膜通透化，促使细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素C的释放会激活凋亡小体中的caspase 9，从而启动效应caspase 3和7的活化¹⁵。这导致特定底物蛋白的水解，结果之一是细胞表面暴露出磷脂酰丝氨酸¹⁶，并释放一种特异性的DNA酶，使染色质发生断裂^17,18。

方案

1. 表达目的蛋白的稳定细胞系的构建

1. 通过向市售的含 GlutaMAX-I、丙酮酸钠和 4.5 g/L D-葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中添加热灭活胎牛血清（FCS）和 1% 青霉素/链霉素来制备培养基。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下用上述培养基培养 HEK293 细胞。每三天传代一次。吸除旧培养基，将细胞重悬于 15 ml 新鲜培养基中。取 1 ml 细胞悬液加入新的 75 cm² 细胞培养瓶中，再补充 14 ml 培养基。
3. 使用血细胞计数板分析细胞数量。
4. 以每孔 2 × 10⁵ 个细胞的密度将 HEK293 细胞接种于 6 孔板中，孵育 24 小时。
5. 转染操作按照转染试剂生产商提供的方案进行。使用转染试剂将 pEGFP-C2 或 pEGFP-C2-CaeB 质粒转染至细胞中。使用前将转染试剂和所需培养基升温至室温（RT）。转染试剂与 DNA 的用量比例为 3:1。
   1. 具体操作：将 1.5 µl 转染试剂直接加入 50 µl 无血清 DMEM 培养基中。为形成复合物，向该混合液中加入 0.5 µg 编码 GFP 或 GFP-CaeB 的 DNA，室温孵育 15 分钟。
   2. 将反应混合物逐滴加入细胞中进行转染，在 37 °C、5% CO₂

结果

首先，建立了稳定表达目的蛋白（CaeB）的 HEK293 细胞系，该蛋白以 GFP 融合蛋白形式存在。作为对照，还构建了稳定表达 GFP 的 HEK293 细胞系。通过免疫印迹分析验证了 GFP 和 GFP-CaeB 的表达。代表性免疫印迹结果（图 4A）显示，GFP 和 GFP-CaeB 均实现了稳定且清晰可检测的表达。然而，该实验无法确定是否所有细胞均表达 GFP 或 GFP-CaeB。因此，还通过流式细胞术对稳定转染的 HEK293 细胞系进行了分析。如图 4B所示，两个细胞系中均有超过 90% 的细胞表达了 GFP。因此，这些稳定细胞系可用于进一步分析 CaeB 的功能。下一步，通过使用抗剪切 PARP 抗体的免疫印迹分析检测 CaeB 的抗凋亡活性。细胞核内 PARP 的蛋白水解剪切会使其 DNA 修复活性失活，是细胞凋亡终末阶段的典型标志。在 HEK293-GFP 或 HEK293-GFP-CaeB 细胞中均未检测到 PARP 剪切，表明 GFP 或 GFP-CaeB 的表达对细胞均无毒性。然而，当细胞经强效内源性凋亡诱导剂星形孢菌素（staurospori.......

讨论

许多致病菌含有分泌系统，可将细菌效应蛋白分泌或转运至宿主细胞内。这些效应蛋白能够调控宿主细胞内的各种过程和信号通路，从而使细菌在其特定的胞内生态位中存活并复制。深入了解效应蛋白的生化活性及其分子机制，有助于更好地理解致病性，并可能为开发新的治疗手段以对抗疾病提供帮助。此外，由于效应蛋白常通过模拟宿主细胞内的正常活动来发挥功能，因此也可作为研究真核细胞生物学的工具¹。然而，研究单一效应蛋白的生化活性在实践中面临多种困难：1）效应蛋白之间存在功能冗余；2）效应蛋白的激活具有时间依赖性；3）效应蛋白可能需与其他效应蛋白协同作用，或受其功能干扰。因此，通常通过过表达研究来分析效应蛋白的活性。遗憾的是，瞬时过表达效应蛋白的方法也存在若干局限性。例如，只能采用单细胞分析实验，且当效应蛋白的活性依赖于其他效应蛋白时，其功能无法被准确评估。为克服上述第一个局限，可使用稳定表达细胞系。然而，若效应蛋白的表达对细胞具有毒性，则该方法不适用。在此情况下，可采用与本文所述相似的系统建立稳定且可诱导的细胞系，用于瞬时表达促凋亡蛋白（见下文）。然而，我们的结果（图5）表明，CaeB的表达可保护细胞免于发生凋亡.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
遗传霉素（Geneticin）	Roth	CP11.3
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）	Polyscienes	23966
多西环素（Doxycycline）	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD 半干式转印系统	Bio-Rad	170-3940
PageRuler 预染蛋白分子量标准	Thermo Scientific	26616
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010
抗-GFP	life technologies	A6455
抗-cleaved PARP	BD Bioscience	611038
抗-肌动蛋白（anti-actin）	Sigma Aldrich	A2066
鼠 IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
兔 IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46428