神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

摘要

我们描述了一种免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。

摘要

磷酸化细胞外调节激酶（pERK）的诱导是反映学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。本文中，我们描述了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的模式。具体而言，我们采用pERK免疫染色法，在Engrailed-2基因敲除（En2^-/-）小鼠（一种自闭症谱系障碍（ASD）模型）中，研究其在莫里斯水迷宫（MWM，一种经典的海马依赖性学习任务）后的神经元激活情况。与野生型（WT）对照组相比，En2^-/-小鼠在MWM中表现出显著的空间学习缺陷。MWM实验后，与WT动物相比，En2^-/-小鼠特定海马亚区中pERK阳性神经元的数量出现显著差异。因此，本方案能够稳健地检测ASD小鼠模型中与海马依赖性学习障碍相关的pERK阳性神经元的变化。更广泛而言，该方案可用于研究各类具有认知缺陷特征的遗传性或药理学小鼠模型中海马神经元激活的模式。

引言

神经发育障碍包括一组广泛且异质性的疾病，例如唐氏综合征、脆性X综合征（FXS）、雷特综合征、神经纤维瘤病、结节性硬化症以及自闭症谱系障碍（ASD），这些疾病的中枢神经系统（CNS）在产前早期即出现发育和成熟异常¹。这类脑发育功能障碍可对运动功能、语言、学习和记忆过程造成深远且终身的影响。近年来，大量遗传和环境因素已被证实与神经发育障碍的发病机制相关^2,3。尽管这些疾病临床表型背后的分子机制仍不明确，但上述发现已促使多种此类疾病的转基因小鼠模型被成功构建。在多个小鼠模型中已观察到学习与记忆缺陷，例如 Tsc1^+/-、Tsc2^+/-、Nf1^+/- 和 En2^-/- 小鼠^2,4-7。神经发育障碍研究领域的一个重要挑战是明确导致学习与记忆功能障碍的细胞与分子过程。学习或记忆过程中激活的特定信号通路可诱导特定基因的转录，最终导致从头蛋白质合成。即刻早期基因（IEGs）的激活以及依赖蛋白质的突触修饰可在神经元活动和行为训练后迅速在脑内神经元中被诱导产生^8,9。

神经纤维蛋白参与的信号通路缺陷已与神经发育障碍中的学习功能受损相关。神经纤维蛋白由NF1基因编码....

方案

所有实验均符合欧洲共同体指令 2010/63/EU，并经意大利卫生部批准。

1. 动物护理、饲养与处理

1. 按照各机构动物护理指南的规定，使用小鼠进行所有实验操作。
2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄取食物和水 随意摄取.
3. 将小鼠以每笼2-4只的方式群养于标准尺寸的聚碳酸酯鼠笼中，垫料为木屑，每周更换一次。
4. 使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为在不同神经发育障碍小鼠模型中，疾病易感性可能随年龄和性别而变化。
5. 选择适当数量的动物以达到统计学显著性（行为学研究每种基因型至少10只小鼠，免疫组织化学实验每种基因型至少4只小鼠）。

2. 莫里斯水迷宫（MWM）

1. 使用圆形水箱（直径 100 cm，高度 50 cm）。
   1. 在水箱周围的房间隔板上放置一些视觉线索。
   2. 将一个直径为 10 cm 的平台固定放置于水箱中四个假想象限之一的中心位置。在整个训练阶段的所有试验中，隐藏平台应始终保持在同一象限。
   3. 用自来水注满水池，使平台高出水面 1 cm。水温应平衡至接近 22 °C；此步骤可能需要数小时。可加入热水以缩短水温平衡所需时间。
   4. 加入约 1.5–2 L 白色无毒油漆，使水呈不透明....

结果

本方案旨在通过免疫组织化学方法，在神经发育障碍小鼠模型中可视化莫里斯水迷宫实验（MWM）后海马神经元活动特异性标志物的表达。本文展示的所有实验数据均来自我们近期的研究工作⁷。实验使用由杂合子交配获得的野生型（WT）和 En2^-/-成年同窝仔鼠（雌雄均有），年龄相匹配（3–5 个月龄；体重 = 25–35 g）。共使用 22 只小鼠（每种基因型 11 只）进行莫里斯水迷宫实验。其中 8 只小鼠（每种基因型 4 只）在莫里斯水迷宫探针试验结束后被处死，用于免疫组织化学实验。

En2^-/- 小鼠空间学习缺陷的评估

为了特异性地检测 En2 中是否存在空间学习缺陷^-/- 小鼠，我们采用了莫里斯水迷宫（MWM）测试，一种经典的依赖海马体的空间学习任务^13,14在训练试验的第1天，En2之间在游泳潜伏期和游泳速度上均未检测到差异^-/- 以及野生型小鼠，表明两种基因型在视觉和.......

讨论

本文提供了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于检测神经发育障碍小鼠模型En2^-/-在莫里斯水迷宫（MWM）实验后神经元的激活情况。与野生型（WT）小鼠相比，En2^-/-突变体在CA3亚区中pERK水平降低。与CA3亚区的结果不同，与野生型小鼠相比，En2^-/-小鼠的门区（hilus）和颗粒细胞层（GCL）中pERK阳性神经元数量总体增加。这种ERK磷酸化水平相反趋势的可能解释在于，MWM后pERK的诱导机制具有亚区特异性。

该实验方案包含多个关键步骤，例如MWM数据的评估、脑组织固定、抗体的选择与校准、洗涤步骤、信号检测以及细胞计数过程。所有这些关键步骤都必须仔细操作，以确保获得高质量且可重复的结果。例如，若脑组织未充分固定（步骤3.2和3.3），在染色过程中切片容易撕裂。此外，在洗涤过程中切片任何阶段均不得干燥，以避免染色信号减弱。最后，如果使用与本文所述不同（见材料列表）的pERK抗体，则必须对抗体浓度和孵育时间进行优化，以确定最可靠且合适的实验条件。此外，为确保免疫组织化学实验结果的准确性和无偏倚性，MWM测.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		该软件平台并非必需 – 市场上还有许多其他的行为分析软件。
蛋彩画颜料	Giotto - Fila集团子公司		白色液体，无毒，用于制备Morris水迷宫中的不透明水。
振动切片机	Leica	VT1200	其他公司的等效型号也可使用。
24孔板	Sigma	CLS3524
100% 乙醇	Fisher Scientific	A406-20	用于载片封片前脱水过程中的乙醇梯度制备。
二甲苯	VWR	66004-950	有毒——需在通风橱中使用。根据使用情况每月更换二甲苯。
叠氮化钠	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH₂O2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
过氧化氢	Sigma	H1009-100ML
正常山羊血清	Abcam	G9023-10ML
ABC试剂盒Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	加入5 ml PBS，再加入2滴试剂A，混匀，然后加入2滴试剂B，再次混匀。
DAB过氧化物酶底物	Vector Laboratories	SK-4100	加入 5 ml ddH₂O2O：加入2滴缓冲液储备液并混匀；4滴DAB并混匀；2滴H2O2 并混匀。
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pERK 抗体	细胞信号转导技术	4370	稀释比例 1:500
生物素标记的山羊抗兔IgG抗体	Vector Laboratories	BA-1000	稀释比例 1:250
SuperFrost 载玻片	卡尔·罗斯	1879
盖玻片	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	载玻片封片剂。可使用等效的封片剂。
显微镜	Zeiss	Axio Imager.M2	可使用同等显微镜。
Adobe Photoshop	Adobe 系统公司，美国加利福尼亚州圣何塞		用于图像拼接。
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院		免费软件可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 下载
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		可用于统计分析的等效软件。
Prism 6	GraphPad Software, Inc.（美国加利福尼亚州拉霍亚）		可用于统计分析的等效软件。