我们描述了一种免疫组织化学实验方案,用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中,经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。
方法文章
我们描述了一种免疫组织化学实验方案,用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中,经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。
磷酸化细胞外调节激酶(pERK)的诱导是反映学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。本文中,我们描述了一种pERK免疫组织化学实验方案,用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中,经历空间学习任务后海马神经元激活的模式。具体而言,我们采用pERK免疫染色法,在Engrailed-2基因敲除(En2-/-)小鼠(一种自闭症谱系障碍(ASD)模型)中,研究其在莫里斯水迷宫(MWM,一种经典的海马依赖性学习任务)后的神经元激活情况。与野生型(WT)对照组相比,En2-/-小鼠在MWM中表现出显著的空间学习缺陷。MWM实验后,与WT动物相比,En2-/-小鼠特定海马亚区中pERK阳性神经元的数量出现显著差异。因此,本方案能够稳健地检测ASD小鼠模型中与海马依赖性学习障碍相关的pERK阳性神经元的变化。更广泛而言,该方案可用于研究各类具有认知缺陷特征的遗传性或药理学小鼠模型中海马神经元激活的模式。
神经发育障碍包括一组广泛且异质性的疾病,例如唐氏综合征、脆性X综合征(FXS)、雷特综合征、神经纤维瘤病、结节性硬化症以及自闭症谱系障碍(ASD),这些疾病的中枢神经系统(CNS)在产前早期即出现发育和成熟异常1。这类脑发育功能障碍可对运动功能、语言、学习和记忆过程造成深远且终身的影响。近年来,大量遗传和环境因素已被证实与神经发育障碍的发病机制相关2,3。尽管这些疾病临床表型背后的分子机制仍不明确,但上述发现已促使多种此类疾病的转基因小鼠模型被成功构建。在多个小鼠模型中已观察到学习与记忆缺陷,例如 Tsc1+/-、Tsc2+/-、Nf1+/- 和 En2-/- 小鼠2,4-7。神经发育障碍研究领域的一个重要挑战是明确导致学习与记忆功能障碍的细胞与分子过程。学习或记忆过程中激活的特定信号通路可诱导特定基因的转录,最终导致从头蛋白质合成。即刻早期基因(IEGs)的激活以及依赖蛋白质的突触修饰可在神经元活动和行为训练后迅速在脑内神经元中被诱导产生8,9。
神经纤维蛋白参与的信号通路缺陷已与神经发育障碍中的学习功能受损相关。神经纤维蛋白由NF1基因编码,该基因的突变可导致1型神经纤维瘤病,这是一种复杂的遗传综合征,其特征包括神经系统肿瘤、行为与运动发育迟缓以及认知障碍10。在仅于抑制性神经元中特异性敲除Nf1基因的杂合小鼠中,长期增强作用(LTP)的早期阶段存在缺陷,同时在MWM实验中表现出空间学习能力受损5,11,12。有趣的是,在该小鼠模型中,Nf1基因的缺失导致学习过程中抑制性中间神经元内的Ras信号通路过度激活,进而引起ERK磷酸化增加,最终导致这些神经元GABA释放异常增强5。
基于这些发现,行为任务后神经元活动的可视化为重建与神经发育障碍相关的特定神经环路提供了一种方法。本文所述的免疫组织化学方案旨在评估并定量分析具有认知缺陷的自闭症谱系障碍(ASD)小鼠模型在莫里斯水迷宫(MWM)实验后海马区ERK的磷酸化水平。MWM被广泛用于研究啮齿类动物依赖海马的空间学习与记忆能力13,14。我们选择ERK磷酸化作为任务依赖性海马学习的分子读出指标,因为已有研究表明ERK在学习与记忆形成中具有关键作用15。此外,ERK信号通路对发育中视觉皮层的经验依赖性可塑性至关重要16。最后,中枢神经系统中缺失两种ERK亚型之一(ERK2)的小鼠在认知、情绪和社会行为方面表现出显著异常17,提示ERK信号可能在诸如ASD等神经发育障碍的发病机制中发挥关键作用。
我们采用Engrailed 2基因敲除(En2-/-)小鼠作为神经发育障碍的模型。En2-/-小鼠表现出解剖学和行为学上的“自闭症谱系障碍(ASD)样”特征,包括前脑中间神经元的丢失18、ASD相关基因表达降低19、社交能力下降以及认知灵活性受损6,7,20。在En2-/-小鼠中,空间学习与记忆缺陷(如在莫里斯水迷宫(MWM)中检测到的缺陷)尤为显著6,7,可能与ASD患者中观察到的认知功能障碍相关21。此外,我们已证明,在En2-/-成年小鼠齿状回中,MWM中空间学习受损与神经纤维瘤蛋白表达减少以及pERK水平升高相关7。本文中,我们提供了在此ASD小鼠模型中,MWM实验后对pERK进行免疫组织化学表征的详细实验方案。
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所有实验均符合欧洲共同体指令 2010/63/EU,并经意大利卫生部批准。
1. 动物护理、饲养与处理
2. 莫里斯水迷宫(MWM)
3. 灌注动物组织切片的制备
4. 免疫组织化学
5. 细胞计数
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本方案旨在通过免疫组织化学方法,在神经发育障碍小鼠模型中可视化莫里斯水迷宫实验(MWM)后海马神经元活动特异性标志物的表达。本文展示的所有实验数据均来自我们近期的研究工作7。实验使用由杂合子交配获得的野生型(WT)和 En2-/-成年同窝仔鼠(雌雄均有),年龄相匹配(3–5 个月龄;体重 = 25–35 g)。共使用 22 只小鼠(每种基因型 11 只)进行莫里斯水迷宫实验。其中 8 只小鼠(每种基因型 4 只)在莫里斯水迷宫探针试验结束后被处死,用于免疫组织化学实验。
En2-/- 小鼠空间学习缺陷的评估
为了特异性地检测 En2 中是否存在空间学习缺陷-/- 小鼠,我们采用了莫里斯水迷宫(MWM)测试,一种经典的依赖海马体的空间学习任务13,14在训练试验的第1天,En2之间在游泳潜伏期和游泳速度上均未检测到差异-/- 以及野生型小鼠,表明两种基因型在视觉和...
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本文提供了一种pERK免疫组织化学实验方案,用于检测神经发育障碍小鼠模型En2-/-在莫里斯水迷宫(MWM)实验后神经元的激活情况。与野生型(WT)小鼠相比,En2-/-突变体在CA3亚区中pERK水平降低。与CA3亚区的结果不同,与野生型小鼠相比,En2-/-小鼠的门区(hilus)和颗粒细胞层(GCL)中pERK阳性神经元数量总体增加。这种ERK磷酸化水平相反趋势的可能解释在于,MWM后pERK的诱导机制具有亚区特异性。
该实验方案包含多个关键步骤,例如MWM数据的评估、脑组织固定、抗体的选择与校准、洗涤步骤、信号检测以及细胞计数过程。所有这些关键步骤都必须仔细操作,以确保获得高质量且可重复的结果。例如,若脑组织未充分固定(步骤3.2和3.3),在染色过程中切片容易撕裂。此外,在洗涤过程中切片任何阶段均不得干燥,以避免染色信号减弱。最后,如果使用与本文所述不同(见材料列表)的pERK抗体,则必须对抗体浓度和孵育时间进行优化,以确定最可靠且合适的实验条件。此外,为确保免疫组织化学实验结果的准确性和无偏倚性,MWM测...
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作者无任何利益冲突需要披露
我们感谢特伦托大学CIBIO研究所和国家研究委员会神经科学研究所行政人员提供的协助。Giovanni Provenzano 的研究由维罗内西基金会(意大利米兰)提供的博士后奖学金资助。本工作由意大利大学与研究部(PRIN 2008 项目编号 #200894SYW2_002 和 PRIN 2010-2011 项目编号 #2010N8PBAA_002,授予 Y.B.)、特伦托大学(CIBIO 启动基金,授予 Y.B.)以及特莱顿基金会(项目编号 #GGP13034,授予 Y.B.)提供经费支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | 该软件平台并非必需 – 市场上还有许多其他的行为分析软件。 | |
| 蛋彩画颜料 | Giotto - Fila集团子公司 | 白色液体,无毒,用于制备Morris水迷宫中的不透明水。 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200 | 其他公司的等效型号也可使用。 |
| 24孔板 | Sigma | CLS3524 | |
| 100% 乙醇 | Fisher Scientific | A406-20 | 用于载片封片前脱水过程中的乙醇梯度制备。 |
| 二甲苯 | VWR | 66004-950 | 有毒——需在通风橱中使用。根据使用情况每月更换二甲苯。 |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH₂O2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| 过氧化氢 | Sigma | H1009-100ML | |
| 正常山羊血清 | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC试剂盒Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | 加入5 ml PBS,再加入2滴试剂A,混匀,然后加入2滴试剂B,再次混匀。 |
| DAB过氧化物酶底物 | Vector Laboratories | SK-4100 | 加入 5 ml ddH₂O2O:加入2滴缓冲液储备液并混匀;4滴DAB并混匀;2滴H2O2 并混匀。 |
| [页眉] | |||
| pERK 抗体 | 细胞信号转导技术 | 4370 | 稀释比例 1:500 |
| 生物素标记的山羊抗兔IgG抗体 | Vector Laboratories | BA-1000 | 稀释比例 1:250 |
| SuperFrost 载玻片 | 卡尔·罗斯 | 1879 | |
| 盖玻片 | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | 载玻片封片剂。可使用等效的封片剂。 |
| 显微镜 | Zeiss | Axio Imager.M2 | 可使用同等显微镜。 |
| Adobe Photoshop | Adobe 系统公司,美国加利福尼亚州圣何塞 | 用于图像拼接。 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | 免费软件可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 下载 | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | 可用于统计分析的等效软件。 | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc.(美国加利福尼亚州拉霍亚) | 可用于统计分析的等效软件。 | |
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