方法文章

神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

DOI：

10.3791/52919

⸱

2015年5月12日

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Integrative Biology (CIBIO), University of Trento, 2CNR Neuroscience Institute, Pisa, Italy

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

磷酸化细胞外调节激酶（pERK）的诱导是反映学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。本文中，我们描述了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的模式。具体而言，我们采用pERK免疫染色法，在Engrailed-2基因敲除（En2-/-）小鼠（一种自闭症谱系障碍（ASD）模型）中，研究其在莫里斯水迷宫（MWM，一种经典的海马依赖性学习任务）后的神经元激活情况。与野生型（WT）对照组相比，En2-/-小鼠在MWM中表现出显著的空间学习缺陷。MWM实验后，与WT动物相比，En2-/-小鼠特定海马亚区中pERK阳性神经元的数量出现显著差异。因此，本方案能够稳健地检测ASD小鼠模型中与海马依赖性学习障碍相关的pERK阳性神经元的变化。更广泛而言，该方案可用于研究各类具有认知缺陷特征的遗传性或药理学小鼠模型中海马神经元激活的模式。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经发育障碍包括一组广泛且异质性的疾病，例如唐氏综合征、脆性X综合征（FXS）、雷特综合征、神经纤维瘤病、结节性硬化症以及自闭症谱系障碍（ASD），这些疾病的中枢神经系统（CNS）在产前早期即出现发育和成熟异常1。这类脑发育功能障碍可对运动功能、语言、学习和记忆过程造成深远且终身的影响。近年来，大量遗传和环境因素已被证实与神经发育障碍的发病机制相关2,3。尽管这些疾病临床表型背后的分子机制仍不明确，但上述发现已促使多种此类疾病的转基因小鼠模型被成功构建。在多个小鼠模型中已观察到学习与记忆缺陷，例如 Tsc1+/-、Tsc2+/-、Nf1+/- 和 En2-/- 小鼠2,4-7。神经发育障碍研究领域的一个重要挑战是明确导致学习与记忆功能障碍的细胞与分子过程。学习或记忆过程中激活的特定信号通路可诱导特定基因的转录，最终导致从头蛋白质合成。即刻早期基因（IEGs）的激活以及依赖蛋白质的突触修饰可在神经元活动和行为训练后迅速在脑内神经元中被诱导产生8,9。

神经纤维蛋白参与的信号通路缺陷已与神经发育障碍中的学习功能受损相关。神经纤维蛋白由NF1基因编码，该基因的突变可导致1型神经纤维瘤病，这是一种复杂的遗传综合征，其特征包括神经系统肿瘤、行为与运动发育迟缓以及认知障碍10。在仅于抑制性神经元中特异性敲除Nf1基因的杂合小鼠中，长期增强作用（LTP）的早期阶段存在缺陷，同时在MWM实验中表现出空间学习能力受损5,11,12。有趣的是，在该小鼠模型中，Nf1基因的缺失导致学习过程中抑制性中间神经元内的Ras信号通路过度激活，进而引起ERK磷酸化增加，最终导致这些神经元GABA释放异常增强5。

基于这些发现，行为任务后神经元活动的可视化为重建与神经发育障碍相关的特定神经环路提供了一种方法。本文所述的免疫组织化学方案旨在评估并定量分析具有认知缺陷的自闭症谱系障碍（ASD）小鼠模型在莫里斯水迷宫（MWM）实验后海马区ERK的磷酸化水平。MWM被广泛用于研究啮齿类动物依赖海马的空间学习与记忆能力13,14。我们选择ERK磷酸化作为任务依赖性海马学习的分子读出指标，因为已有研究表明ERK在学习与记忆形成中具有关键作用15。此外，ERK信号通路对发育中视觉皮层的经验依赖性可塑性至关重要16。最后，中枢神经系统中缺失两种ERK亚型之一（ERK2）的小鼠在认知、情绪和社会行为方面表现出显著异常17，提示ERK信号可能在诸如ASD等神经发育障碍的发病机制中发挥关键作用。

我们采用Engrailed 2基因敲除（En2-/-）小鼠作为神经发育障碍的模型。En2-/-小鼠表现出解剖学和行为学上的“自闭症谱系障碍（ASD）样”特征，包括前脑中间神经元的丢失18、ASD相关基因表达降低19、社交能力下降以及认知灵活性受损6,7,20。在En2-/-小鼠中，空间学习与记忆缺陷（如在莫里斯水迷宫（MWM）中检测到的缺陷）尤为显著6,7，可能与ASD患者中观察到的认知功能障碍相关21。此外，我们已证明，在En2-/-成年小鼠齿状回中，MWM中空间学习受损与神经纤维瘤蛋白表达减少以及pERK水平升高相关7。本文中，我们提供了在此ASD小鼠模型中，MWM实验后对pERK进行免疫组织化学表征的详细实验方案。

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方案

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所有实验均符合欧洲共同体指令 2010/63/EU，并经意大利卫生部批准。

1. 动物护理、饲养与处理

  1. 按照各机构动物护理指南的规定，使用小鼠进行所有实验操作。
  2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄取食物和水 随意摄取.
  3. 将小鼠以每笼2-4只的方式群养于标准尺寸的聚碳酸酯鼠笼中，垫料为木屑，每周更换一次。
  4. 使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为在不同神经发育障碍小鼠模型中，疾病易感性可能随年龄和性别而变化。
  5. 选择适当数量的动物以达到统计学显著性（行为学研究每种基因型至少10只小鼠，免疫组织化学实验每种基因型至少4只小鼠）。

2. 莫里斯水迷宫（MWM）

  1. 使用圆形水箱（直径 100 cm，高度 50 cm）。
    1. 在水箱周围的房间隔板上放置一些视觉线索。
    2. 将一个直径为 10 cm 的平台固定放置于水箱中四个假想象限之一的中心位置。在整个训练阶段的所有试验中，隐藏平台应始终保持在同一象限。
    3. 用自来水注满水池，使平台高出水面 1 cm。水温应平衡至接近 22 °C；此步骤可能需要数小时。可加入热水以缩短水温平衡所需时间。
    4. 加入约 1.5–2 L 白色无毒油漆，使水呈不透明状。
  2. 轨迹采集程序
    1. 使用标准 CCD 摄像头和视频采集卡设置 MWM 轨迹追踪系统。选择一种视频追踪系统，用于监测和分析路径长度、逃逸潜伏期以及在每个象限停留时间等多种变量。
    2. 将实验区域划分为四个象限，并调整检测设置，以确保动物与背景之间在实时追踪时具有最佳对比度。
    3. 设定平台所在区域。
    4. 将单次试验最长时间设为 60 秒。
  3. MWM 测试
    1. 在行为测试开始前，让小鼠在无法看到水池或空间线索的区域适应 20–25 分钟。
    2. 对每只小鼠进行为期 9 天的训练（每天连续进行两次试验，间隔 20–30 分钟）。
    3. 打开计算机和摄像头，启动视频追踪系统软件。
    4. 抓住小鼠尾巴将其放入水中，使其头部朝向水池边缘，起始位置从四个起点（北、南、东、西）之一开始。对每只小鼠而言，每次试验的起始位置应不同，并在试验间进行伪随机化。
    5. 让小鼠游泳并寻找平台，最长持续 60 秒。一旦动物到达平台，允许其在平台上停留 20 秒。
    6. 若小鼠未能在规定时间内找到平台，则轻轻抓住其尾巴，将其引导至平台，并让其在平台上停留 20 秒。每只小鼠完成全部两次试验后，用毛巾将其擦干并放回笼中。
    7. 在训练期的每一天，重复相同的操作程序（步骤 2.3.4–2.3.6）。
    8. 在第 9 天最后一次训练试验结束后，进行探测试验。
    9. 将平台从水池中移除。
    10. 让小鼠游泳并寻找平台位置，最长持续 60 秒。
    11. 定期检查水温，确保其保持一致（22 °C），并清洁水池。

3. 灌注动物组织切片的制备

  1. 在MWM实验结束时处死小鼠。根据当地和国际指南，每种基因型需取四只小鼠，在安乐死前进行麻醉。
  2. 对动物进行经心脏灌注（用剪刀剪开右心耳以利放血，并将蝴蝶导管插入左心室进行灌注），先用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注4-5分钟，随后用含4%多聚甲醛的PBS灌注10-15分钟22。
  3. 取出脑组织并在4%多聚甲醛中于4 °C下后固定至少12小时。
  4. 将脑组织置于含有15 ml含0.02%叠氮化钠的0.1 M PBS的50 ml聚苯乙烯锥形管中，4 °C保存，待切片时使用。
  5. 在振动切片前切除小脑。
  6. 使用速干胶将脑组织直立粘附于振动切片机的持样板上，切面朝下。
  7. 在适当的振动切片机上，沿背侧海马全程按顺序连续切割脑组织为20-40 µm厚的冠状切片。
  8. 用毛笔收集振动切片，并转移至24孔板中，每孔含1 ml 0.1 M PBS。
  9. 切片可短期保存于PBS中，或长期保存于含0.02%叠氮化钠的PBS中，4 ºC（组织最长可使用一年）。

4. 免疫组织化学

  1. 将每只小鼠的3-5个背侧海马切片转移至24孔板中，每孔加入500 µl的0.1 M PBS。
  2. 用500 µl的0.1 M PBS洗涤各孔中的切片（每次5分钟，  轻柔振荡，共3次）。
  3. 通过将切片在含1% H2O2 的PBS中孵育20分钟（轻柔振荡），以淬灭内源性过氧化物酶活性。
  4. 在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。
  5. 组织通透处理：将切片在含0.2% Triton X-100的PBS中孵育5分钟。
  6. 在上述步骤（4.4；4.5）期间，配制足够的封闭缓冲液（含10%山羊血清和0.1% Triton-X100的PBS），用于整个实验（切片数量 × 100 µl × 3步）。
  7. 注意：使用与二抗（生物素标记）同源的物种血清。
  8. 将切片在封闭缓冲液（每切片100 µl）中室温（RT）孵育1小时（轻柔振荡），以阻断抗体的非特异性结合。
  9. 将切片在封闭缓冲液稀释的一抗（pERK）中4 °C过夜孵育，轻柔振荡。
  10. 在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。
  11. 将切片在生物素标记的二抗（1:250稀释）封闭缓冲液（与步骤4.6中相同）中室温孵育1小时，轻柔振荡。
  12. 同时配制ABC试剂，因为亲和素与生物素在室温下至少需要30分钟才能形成复合物。
  13. 根据试剂生产商的说明书配制所需体积的ABC试剂。
  14. 在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。
  15. 将切片在ABC试剂中室温孵育45分钟。
  16. 在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。
  17. 配制DAB工作液；所有涉及DAB的操作均须在通风橱中进行，因为DAB具有致癌性和致畸性。
  18. 用塑料移液管将DAB溶液转移至新板中。
  19. 将切片放入含有DAB工作液的板中，手动缓慢摇动板，使切片充分接触溶液。
  20. 在显微镜下监测DAB反应，直至出现足够信号（2-5分钟）。
  21. 当颜色强度达到理想程度时，用0.1 M PBS洗涤组织（每次5分钟，共3次）以终止反应。
  22. 使用漂白剂在通风橱中过夜灭活残留的DAB底物溶液，并按照实验室规定进行处理。
  23. 将切片在PBS中漂浮后贴附于明胶包被的载玻片上，然后在室温下干燥至少3-4小时。
  24. 依次在50%、70%、95%和100%乙醇中各脱水2分钟，并在100%二甲苯中透明5分钟。
  25. 用封片介质封片后置于通风橱中过夜干燥。

5. 细胞计数

  1. 计数 pERK 阳性细胞，每只动物应分析背侧海马水平的三至五个脑切片。
  2. 使用合适的显微镜以 200 倍明场放大倍数采集每张切片的多张图像，然后使用图像处理软件将其拼接成全景图像。
  3. 使用 ImageJ 免费软件对转换为 tiff 格式的拼接图像进行细胞计数。
  4. 在齿状回门区和颗粒细胞层内，使用两到三个大小为 100 × 100 µm 的计数框进行 pERK 染色细胞计数。
  5. 细胞密度将以每个计数窗口（100 × 100 µm）中标记细胞的数量表示。
  6. 进行统计学分析以评估不同基因型之间的显著差异。可使用商业软件进行 Student t 检验或 ANOVA 分析，随后进行适当的事后检验。统计学显著性水平设定为 p <0.05。

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结果

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本方案旨在通过免疫组织化学方法，在神经发育障碍小鼠模型中可视化莫里斯水迷宫实验（MWM）后海马神经元活动特异性标志物的表达。本文展示的所有实验数据均来自我们近期的研究工作7。实验使用由杂合子交配获得的野生型（WT）和 En2-/-成年同窝仔鼠（雌雄均有），年龄相匹配（3–5 个月龄；体重 = 25–35 g）。共使用 22 只小鼠（每种基因型 11 只）进行莫里斯水迷宫实验。其中 8 只小鼠（每种基因型 4 只）在莫里斯水迷宫探针试验结束后被处死，用于免疫组织化学实验。

En2-/- 小鼠空间学习缺陷的评估

为了特异性地检测 En2 中是否存在空间学习缺陷-/- 小鼠，我们采用了莫里斯水迷宫（MWM）测试，一种经典的依赖海马体的空间学习任务13,14在训练试验的第1天，En2之间在游泳潜伏期和游泳速度上均未检测到差异-/- 以及野生型小鼠，表明两种基因型在视觉和...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于检测神经发育障碍小鼠模型En2-/-在莫里斯水迷宫（MWM）实验后神经元的激活情况。与野生型（WT）小鼠相比，En2-/-突变体在CA3亚区中pERK水平降低。与CA3亚区的结果不同，与野生型小鼠相比，En2-/-小鼠的门区（hilus）和颗粒细胞层（GCL）中pERK阳性神经元数量总体增加。这种ERK磷酸化水平相反趋势的可能解释在于，MWM后pERK的诱导机制具有亚区特异性。

该实验方案包含多个关键步骤，例如MWM数据的评估、脑组织固定、抗体的选择与校准、洗涤步骤、信号检测以及细胞计数过程。所有这些关键步骤都必须仔细操作，以确保获得高质量且可重复的结果。例如，若脑组织未充分固定（步骤3.2和3.3），在染色过程中切片容易撕裂。此外，在洗涤过程中切片任何阶段均不得干燥，以避免染色信号减弱。最后，如果使用与本文所述不同（见材料列表）的pERK抗体，则必须对抗体浓度和孵育时间进行优化，以确定最可靠且合适的实验条件。此外，为确保免疫组织化学实验结果的准确性和无偏倚性，MWM测...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露

致谢

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我们感谢特伦托大学CIBIO研究所和国家研究委员会神经科学研究所行政人员提供的协助。Giovanni Provenzano 的研究由维罗内西基金会（意大利米兰）提供的博士后奖学金资助。本工作由意大利大学与研究部（PRIN 2008 项目编号 #200894SYW2_002 和 PRIN 2010-2011 项目编号 #2010N8PBAA_002，授予 Y.B.）、特伦托大学（CIBIO 启动基金，授予 Y.B.）以及特莱顿基金会（项目编号 #GGP13034，授予 Y.B.）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EthoVision XT 8Noldus Information Technology该软件平台并非必需 – 市场上还有许多其他的行为分析软件。
蛋彩画颜料Giotto - Fila集团子公司白色液体，无毒，用于制备Morris水迷宫中的不透明水。
振动切片机LeicaVT1200其他公司的等效型号也可使用。
24孔板SigmaCLS3524
100% 乙醇Fisher ScientificA406-20用于载片封片前脱水过程中的乙醇梯度制备。
二甲苯VWR66004-950有毒——需在通风橱中使用。根据使用情况每月更换二甲苯。 
叠氮化钠Sigma S2002
PBSSigmaP3813-10PAK
ddH₂O2O
Triton X-100Sigma T-8787
过氧化氢SigmaH1009-100ML
正常山羊血清AbcamG9023-10ML
ABC试剂盒Vectastain Vector LaboratoriesPK-6100加入5 ml PBS，再加入2滴试剂A，混匀，然后加入2滴试剂B，再次混匀。
DAB过氧化物酶底物Vector LaboratoriesSK-4100加入 5 ml ddH₂O2O：加入2滴缓冲液储备液并混匀；4滴DAB并混匀；2滴H2O2 并混匀。
[页眉]
pERK 抗体细胞信号转导技术 4370稀释比例 1:500
生物素标记的山羊抗兔IgG抗体Vector LaboratoriesBA-1000 稀释比例 1:250
SuperFrost 载玻片 卡尔·罗斯1879
盖玻片Fisher12-548-B
DPXSigma317616载玻片封片剂。可使用等效的封片剂。
显微镜 Zeiss Axio Imager.M2可使用同等显微镜。
Adobe PhotoshopAdobe 系统公司，美国加利福尼亚州圣何塞用于图像拼接。
ImageJ 软件美国国立卫生研究院免费软件可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 下载
SigmaPlot 11.0Systat Software Inc. (USA)可用于统计分析的等效软件。
Prism 6GraphPad Software, Inc.（美国加利福尼亚州拉霍亚）可用于统计分析的等效软件。

参考文献

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pERK Engrailed 2

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