非对称步道：一种研究非对称运动行为的新颖行为学检测方法

摘要

本文介绍了一种用于量化啮齿类动物精确步态的实验方案。在受阻运动过程中，精确的足部定位需要大脑皮层和脊髓中央模式发生器信号的共同参与。本文报道了一种新型的受限行走任务，可直接检测精确的步态行为。

摘要

行为学检测常用于评估中枢神经系统（CNS）的感觉运动功能障碍。量化啮齿类动物运动功能障碍的最精密方法是测量其在地面自由行走时步态的微小异常。例如然而，由脊髓中央模式发生器（CPG）产生的基本 locomotion并不需要皮层输入。因此，非限制性行走任务仅能间接检测由于运动皮层损伤导致的运动功能缺陷。在本研究中，我们提出了一种新型的精确足部定位运动任务，用于评估皮层对脊髓CPG的输入作用。我们使用一种带有仪器化的 peg-way（踏钉通道）来实施对称和不对称的运动任务，以模拟偏侧化的运动功能缺陷。我们证明，在偏好步幅长度下行走时， stride length（步幅长度）间距离变化达20%即可引起前肢支撑相特征的改变。此外，我们认为这种不对称走道可用于测量由皮层控制信号产生的行为学结果，这些指标对于评估皮层损伤后的功能障碍具有重要意义。

引言

卒中后幸存人群的病残率包括粗大运动功能障碍，这在卒中后人类及神经系统损伤动物模型的定量评估中均构成挑战¹。在临床实践中，这些运动功能障碍通常采用主观标准进行测量，而这些标准对重度而非大多数患者所表现出的中度功能障碍更为敏感。类似地，在动物中对损伤后运动行为的主观评估也很常见，例如，Basso、Beattie 和 Bresnahan（BBB）运动功能评分法^2,3。尽管这些主观评估方法有助于四足动物模型与人类在步态康复研究之间的转化，但它们并未评估与各肌肉群活动相关的运动缺陷的具体细节。此外，即使采用最新的自动化定量方法^4,5，也仅能间接获得对运动皮层在行走中作用的评估——而运动皮层被认为是脑血管意外中运动功能障碍的潜在关键因素，因为这些方法依赖于开放场域或直线行走任务。此类任务不需要皮层参与，可由脊髓的神经机制完成，即，中枢模式发生器（CPG）网络，该网络在大多数神经损伤动物模型（例如，脊髓横断动物）中得以保留^6-8。实验已证实，皮层对这些脊髓机制的必要性体现在需要预期性姿势调整⁹和抓取动作¹⁰，以及精确步态控制¹⁰的任务中。

此外，大多数神经损伤具有不对称性；例如，中风会导致偏瘫，即，身体一侧无力，从而引起不对称步态^11-14。偏瘫步态的不对称性主要表现为肌肉在时空激活上的不对称，最显著的特征是患侧步态周期中与伸肌相关的支撑相缩短，以及与屈肌相关的摆动相延长^15,16。这一趋势在健康或偏瘫动物不同运动速度下的表现尚未得到系统研究。在本研究中，我们采用了步相时程特征分析方法¹⁷，该方法描述了每一步中摆动相或支撑相持续时间与步态周期总时长之间的关系。随后，通过分析所有肢体间的不对称性，进一步描述所获得的线性回归模型。

我们报道一种基于精确踏步运动任务的新型低成本方法，用于评估四足动物运动系统中皮质下行输入的活动。该任务通过在自然行走速度范围内对足部定位提出要求，以挑战运动皮层。此外，通过操控足部定位需求，选择性地对运动系统的左侧或右侧施加挑战。在类似的运动任务中，Metz & Whishaw（2009）研究了大鼠在不规则横杆走道上行走时的失败频率及错步次数。我们的方法是对该先前研究的补充，进一步详细描述了"成功"步态中时相控制的质量¹⁸。

方案

以下训练范式采用对成年 Sprague-Dawley 大鼠平均相位调节的分析。请确保本文所述方案符合您所在机构的动物护理指导原则。本研究中的所有操作均依照西弗吉尼亚大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）和实验动物福利办公室（OLAW）的规定，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用的指导原则。

1. 仪器设置

1. 构建一个不对称步道，其结构为顶部开放的塑料箱，四个角由铝制支架支撑，尺寸为 155 cm × 104 cm（图1）。在箱子的顶边使用两侧带凹槽的铝条进行加固，沿箱子周缘设置可交替安装插销的位置，使同一侧上相邻插销之间的距离定义步幅长度。
2. 在每个角落放置一个 20 cm × 20 cm 的平台（共四个），以分隔各侧所代表的不同条件。该距离应足以包含单只大鼠一个步态周期所经过的距离。
   1. 使用铝材制成的插销，尺寸为 20 cm × 1 cm × 0.5 cm。将每个插销顶端距尖端 2.5 cm 处弯曲，形成足部放置平台。
   2. 通过精密加工的孔洞，使用滑动内嵌支架将插销固定在带凹槽的铝条上，确保所有插销处于相同高度并水平对齐。使用螺丝刀和直尺调整位置。插销宽度采用 1 cm，约等于大鼠足掌的平均尺寸；过窄或过宽的插销均会导致不适或增加足部放置的变异性。
3. 通过调节两侧插销的位置，产生三种精确的行走挑战条件。
   1. 通过将左侧步间长度（lISL）和右侧步间长度（rISL）均设为步幅长度的一半（7.5 cm），构建对称运动任务，步幅长度为 15 cm（SL15）。
   2. 通过将 lISL 和 rISL 均调整为 6.0 cm，施加另一种对称条件（SL12）。
   3. 通过改变左右两侧插销之间的距离（称为步间长度）来构建不对称任务。为不对称地挑战运动系统，将 lISL 和 rISL 分别改变 20%，在左侧施加较短步间长度（L6R9 条件）或在右侧施加较短步间长度（L9R6 条件）。1.5 cm 的扰动使 L6R9 条件下的 lISL 为 6 cm、rISL 为 9 cm，而 L9R6 条件下的 lISL 为 9 cm、rISL 为 6 cm。
4. 对于大鼠实验，除 SL12 条件外，其余所有条件的步幅长度均保持在偏好的 15 cm。
5. 为方便操作，可将步道的两条长边分别设定为偏向受试动物左侧或右侧的不对称条件，而两条短边则保留用于对称对照条件。
6. 设置一台采样率至少为 60 Hz 的高清摄像机，确保摄像机镜头垂直于步道，无遮挡地记录肢体在插销上的放置情况，视野范围覆盖约 7 步。靠近平台的起始步和最后一步不予分析。

2. 仪器训练

1. 请使用标准培训资源， 例如，美国国立卫生研究院（NIH）实验室大鼠基础生物方法学培训，旨在熟悉啮齿类动物的一般行为训练。
2. 训练初期，先将受试动物置于20 × 20 cm的平台上，停留至少5分钟并给予奖励，以使其适应环境。随后，通过提供食物奖励引导动物跨越间距为1 cm的桩阵，到达下一个平台。动物抵达平台后，应给予口头表扬及抚摸作为奖励。
3. 完成5次训练后，将插脚之间的距离额外增加1 - 2厘米，然后进行接下来的5次训练。此处列出的重复次数足以产生具有统计学意义的样本量（20 - 35步）。
   1. 如果动物在完成任务时进展较慢，表现为步态连续性差（出现停顿）和姿势不良（背部弯曲），则应在较短步长（S12）条件下加强训练，重点强化这些技能，之后再恢复较长步长（S15）的训练，逐步接近目标步长。
   2. 如果新的间距引发受试者对该任务的焦虑或不适感，应将 peg 调整回先前设置，并重复训练范式。
   3. 继续进行此项训练，直至四种条件下的步间长度达到适当标准，并满足运动功能的基准要求。根据我们的经验，大鼠对以口头鼓励作为启动试验提示的反应良好。若受试动物有足够动机完成任务，测试可在训练当天进行。
      注：运动行为的标准如下：行走应保持稳定，不包含停顿或失步；头部摆动最小；运动过程中背部呈拱形，尾部抬起；从行走通道的正交视角观察，在支撑相起始和结束时，每只肢体均应清晰可见。该筛选过程至关重要，因为本研究仅关注行走行为，而非其他步态行为。

3. 测试与数据分析

1. 使用随机化会话设计，在 S12、S15、L9R6 和 L6R9 任务上测试实验动物（见第 1.3 节描述）。在任务之间安排休息，以避免适应性效应。
2. 使用高清摄像机以至少 60 Hz 的采样率记录会话。将视频记录以不重采样的方式导入视频编辑软件，并仅选取行走片段用于进一步分析。
3. 在每个受试动物的视频记录中标注运动学相位的起始和终止时间点。
4. 此处使用基于 Matlab 编写的自定义软件 videoa，逐帧手动识别每个肢体支撑相的起始和终止时间：支撑相起始以肢体落在横杆上时运动模糊消失为标志，支撑相终止则以肢体开始抬离横杆时首次出现运动模糊为标志。
5. 将摆动相的持续时间计算为连续两个支撑相起始时间之间的剩余时间。排除任何不符合地面四足行走模式的行为（例如步态中出现双摆动相（即双前肢或双后肢同时离地））进入后续分析。
6. 将各相位持续时间绘制为对应步态周期持续时间的函数。对每条肢体分别建立线性回归模型（Tphase = B1 + B2×Tc）以描述该关系，其中 Tc 为周期持续时间，Tphase 为与伸肌相关的支撑相（Te）或与屈肌相关的摆动相（Tf），B1 和 B2 为回归模型的经验常数（截距和斜率）。
   注意：B2（斜率）表示运动速度变化时相位持续时间的变化程度。
7. 对每条肢体使用公式 1 和公式 2（图 2C）计算不对称指数（AI）。两个公式均为标准化差值的简单比值形式，即将两个数值的差除以其和。
   1. 使用公式 1 计算水平方向差异（AI_h），该指数基于左侧（l）和右侧（r）肢体支撑相调制斜率的差值。类似地，使用前侧/前肢（a）和后侧/后肢（p）肢体的斜率计算垂直方向不对称性（AI_v）。应用这两个公式的结果为一组 4 个 x-y 数据点，分别对应：1）前肢不对称性，aAI_h；2）后肢不对称性，pAI_h；3）左侧前-后肢不对称性，lAI_v ；4）右侧前-后肢不对称性，rAI_v 。
   2. 将这些值绘制成图块（图 2B），以直观展示所有肢体间的不对称性分布。
8. 计算对角耦合指数（DI），以评估前肢与其对侧后肢参数之间的对角耦合关系（公式 3，图 2C）。
9. 使用单因素方差分析（ANOVA）及事后均值比较分析¹⁹，检验 DI 以及在相反不对称条件下的四个 AI 差值（ΔAI = |AIL9R6 - AIL6R9|）的统计学显著性。

结果

图2展示了单个代表性受试者在运动任务期间不对称性的分析结果。所有条件下的数值均基于所有受试者个体数据（图2）以及8只雌性斯普拉格-道利大鼠（Sprague-Dawley rats，250–400 g，图3）的合并数据，使用公式1和公式2分别计算得出。通常情况下，前肢站立相的调制程度在运动偏好侧（较短的步长，ISL）较低，这与以下观点一致：随着运动速度降低，优势侧（较长的步长，ISL）的站立相在步态周期中所占比例 tends to 占据更大比例，相较于偏好侧肢体。

采用单因素方差分析（α = 0.05）以及使用Matlab中的anova1和multcompare函数进行保守的Bonferroni校正的事后t检验（校正后α = 0.0125），对从L9R6和L6R9条件获得的相应不对称性指数之间的差异（ΔAI）进行检验。...

讨论

本研究的目的是开发一种行为学任务，以定量评估非对称运动行为中精确控制能力的变化。脊髓中枢模式发生器（CPG）的存在已在功能上被证实多年²⁰，但其解剖和功能特征，以及来自下行通路或感觉反馈通路的调节性输入，直到过去十年才逐渐被阐明^6,21,22。目前的共识是，脊髓固有机制、感觉反馈和下行指令在运动行为的产生过程中紧密整合¹

本文介绍的非对称精确足部放置任务旨在功能性地挑战负责灵巧性非对称迈步控制的系统，这种控制已知需要皮层输入^23,24。该表现是相对于对下行皮层和脑干控制依赖较少的对称性任务进行评估的，因此我们有机会区分脊髓通路与下行通路的各自贡献。由于运动皮层直接参与运动过程中肌肉时相的调节，以及抓取和姿势调整^9,10,25，因此分析在施加的非对称精确迈步任务下时相调节的变化，为描述随意控制的改变提供了依据。这一点在左侧与右侧优势任务之间显著的偏侧化时相调节差异中得以体现，其特征表现为非对称性指数的不同。我们还观察到全身协调性的变化，这种协调需要对侧前肢与后肢之间的对角耦合...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MATLAB® R2013a	MathWorks		用于自定义视频标注软件的设计平台
Sony HDR-CX380/B 高清 Handycam	Sony	27-HDRCX330/B	视频采集设备
Jif 浓稠花生酱 - 无麸质 454 g	J.M. Smucker Company		食物奖励刺激物
蔗糖片剂 - 巧克力味 1800 g	TestDiet	1811256	食物奖励刺激物
曼萨尼塔木咀嚼棒	BioServe	W0016	用于呈现食物奖励刺激物