具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

摘要

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

摘要

中性粒细胞是人体循环中数量最多的白细胞，在宿主抵御入侵微生物的过程中发挥重要作用。此外，中性粒细胞在对肿瘤细胞的免疫监视中也起核心作用。它们能够识别肿瘤细胞，并通过依赖细胞接触且涉及过氧化氢的机制，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）诱导肿瘤细胞死亡。具有抗肿瘤活性的中性粒细胞可从癌症患者或荷瘤小鼠的外周血中分离获得。这类中性粒细胞被称为肿瘤驯化中性粒细胞（TEN），以区别于健康个体或未处理小鼠的中性粒细胞，后者无明显肿瘤细胞毒性活性。与其他白细胞相比，中性粒细胞具有不同的浮力特性，这使得获取一种 > 经密度梯度离心后可获得纯度达98%的中性粒细胞群体。然而，在癌症患者、荷瘤小鼠以及慢性炎症状态下，除正常的高密度中性粒细胞（HDN）群体外，循环中还会出现明显的低密度中性粒细胞（LDN）群体。LDN与单个核细胞组分共同富集，可通过阳性或阴性筛选策略与单个核细胞分离。待通过流式细胞术确定分离所得中性粒细胞的纯度后，即可用于后续实验 体外 和 体内 功能检测。我们描述了监测中性粒细胞抗肿瘤活性、迁移能力、活性氧产生能力以及吞噬功能的技术。 离体我们进一步描述了标记中性粒细胞的技术 体内 追踪，并确定其抗转移能力 体内所有这些技术对于理解如何获取和表征具有抗肿瘤功能的中性粒细胞至关重要。

引言

中性粒细胞最初被定义为先天免疫细胞，是抵御入侵微生物的第一道防线。如今已知，中性粒细胞具有更广泛的功能，可参与针对外来抗原的适应性免疫应答^1,2，调控造血³、血管生成⁴以及伤口愈合⁵。此外，中性粒细胞可通过其促肿瘤和抗肿瘤活性影响肿瘤生长及转移进展^6,7。中性粒细胞的特征是具有多叶分叶核（因此被称为多形核（PMN）白细胞），并含有至少三种不同类型的颗粒以及分泌小泡⁸（图1A-C）。

中性粒细胞具有强大的吞噬能力以及高水平的NADPH氧化酶活性，这对于清除微生物至关重要，同时还能分泌多种趋化因子，有助于募集更多中性粒细胞及其他免疫细胞至炎症部位^8,9。中性粒细胞的特征是表达大量表面受体，包括Toll样受体（TLRs）、C型凝集素受体（CLRs）、补体受体3（CD11b/CD18）以及其他黏附分子（例如，L-选择素、LFA-1、VLA-4和癌胚抗原相关细胞黏附分子3（CEACAM3/CD66b））、趋化因子受体（例如，CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、趋化物受体（例如，PAFR、LTB₄R和C5aR）、细胞因子受体（例如，G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TN....

方案

动物：5-7周龄的BALB/c小鼠购自Harlan（以色列）。所有涉及动物的实验均经希伯来大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。人类样本：从癌症患者和健康志愿者采集血液的程序已获哈达萨医学中心机构审查委员会（IRB）批准。 

1. 诱导具有抗肿瘤特性的中性粒细胞 体内 使用乳腺癌小鼠模型

注意：所有步骤均应使用无菌溶液在层流气流（LAF）生物安全柜中进行。

1. 在10 ml含有4.5 g/L D-葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，加入10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM D-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素G和100 μg/ml硫酸链霉素，将5 × 10⁵个4T1细胞接种于100 mm组织培养皿中。将细胞置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，37 °C培养3至4天。确保实验当天细胞融合度达到50 - 100%。
2. 为使肿瘤细胞从组织培养皿上脱离，吸除培养基，用5 ml PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入3 ml浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶溶液。在37 ºC下用胰蛋白酶孵育2 - 3分钟。
3. 加入10 ml含血清的培养基以中和胰蛋白酶，并反复吹打直至所有细胞脱落。将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中。
4. 在室温下以200 × g离心5....

结果

在最近的一项研究中，我们发现中性粒细胞具有抗转移功能⁶荷瘤小鼠的中性粒细胞获得细胞毒表型并具有杀伤肿瘤细胞的能力⁶这与来自未处理小鼠的中性粒细胞无显著抗肿瘤效应形成对比⁶方案部分所述的多种技术已用于研究抗肿瘤中性粒细胞功能 体外 和 体内⁶.

可从荷瘤小鼠中获取具有肿瘤细胞毒性的中性粒细胞⁶。为实现这一目的，将4T1细胞原位注射至小鼠左侧腹股沟乳腺脂肪垫（方案1）。接种肿瘤21天后，原发肿瘤体积达到1 - 2 cm³（图3——肿瘤明显位于左下腹部）。此时，处死小鼠并通过心脏穿刺每只小鼠采集1 ml血液（图3）。同时，采集未处理的非荷瘤小鼠血液。随后，通过密度梯度离心法纯化高密度中性粒细胞（HDN）（方案2.1及图4），获得高纯度（>98%）的中性粒细胞群体。中性粒细胞的活力通过台盼蓝染色法测定（方案2.1）。然后将中.......

讨论

中性粒细胞是所有白细胞中数量最多的一类，在感染和炎症发生时是首批响应的细胞。因此，它们对外界刺激极为敏感，易于被激活。此外，中性粒细胞的半衰期极短，更新速度很快。这些特性共同导致中性粒细胞的操作存在诸多困难，需要采用独特的实验策略。例如，目前已有多种中性粒细胞纯化方法，每种方法各有优缺点。

中性粒细胞研究中的一个关键步骤是从全血中纯化中性粒细胞。可采用密度梯度法或基于抗体的策略（阳性或阴性筛选）高效地纯化中性粒细胞。我们首选的方法是使用密度梯度法，因为该方法可以获得大量高纯度的中性粒细胞，且非特异性激活程度最低。然而，正如我们最近一项研究²¹所示，随着肿瘤进展，大量中性粒细胞会积聚在单个核低密度组分中。在此情况下，密度梯度法仅能获得高纯度的高密度中性粒细胞组分，但不能代表全部循环中性粒细胞群体，同时低密度中性粒细胞组分则被其他单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）严重污染。在这种情况下，首选方法应为基于抗体的纯化，尤其是阴性筛选。使用抗体纯化中性粒细胞可获得高纯度细胞，并能更好地代表全部循环中性粒细胞群体。然而，我们注意到，中性粒细胞与抗体孵育的时间越长，发生非特异.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
小鼠 4T1 乳腺癌细胞	ADCC	CRL-2539	培养基：DMEM + 10% 热灭活 FBS
塑料器皿与设备
24 孔组织培养板	Falcon	353047	无菌
100 mm 组织培养板	Corning	430167	无菌
25 cm2 组织培养瓶	Nunc	156340	无菌
90 mm 细菌级培养皿	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	无菌
15 ml 无菌锥形离心管	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	无菌
50 ml 无菌锥形离心管	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	无菌
Falcon 12 x 75 mm 圆底聚苯乙烯管	Becton Dickinson	352058	无菌
Millicell 24 孔迁移板，孔径 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	无菌
白色 96 孔平底板	Costar	3917	无菌
细胞滤器（40 mm）	BD Falcon	352340	无菌
20G x 1.5" 针头	BD Microlance 3	301300	无菌
23G x 1" 针头	BD Microlance 4	300800	无菌
25G x 5/8" 针头	BD Microlance 5	300600	无菌
0.3 ml 带 30G x 8mm 针头的注射器	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	无菌
9 mm 夹子	BD, AutoClip	427631	无菌
EasySep 磁力架	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS 分离柱	Miltenyi Biotech	130-042-201	无菌
MidiMACS 分离器磁铁	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotech	130-042-303
显微镜载玻片	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
轨道摇床	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
酶标仪	TECAN	InfiniteF200Pro
粉末
牛血清白蛋白（BSA），V 级	Sigma	A7906
溴脱氧尿苷（BrdU）	BD Pharmingen	550891	无菌
CFSE（5-(和 6-)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯）	Molecular Probes	C1157
葡聚糖 T500	Sigma	31392
来自猪肠黏膜的肝素钠盐	Sigma	H3149
叠氮化钠（NaN3）	Sigma	S8032	高毒性，操作需谨慎
硫代甘油酸盐粉末	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
培养基与补充剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma	D5796	无菌
Opti-MEM® I 减血清培养基	Life Technologies	31985062	无菌
罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基	Sigma	R8758	无菌
胎牛血清（FBS），热灭活	Sigma	F9665	无菌
L-谷氨酰胺	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	无菌
丙酮酸钠	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	无菌
青霉素-链霉素 x 1000 溶液	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	无菌
磷酸盐缓冲液（PBS），不含 Mg2+ 和 Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	无菌
PBS x 10，不含 Ca2+ 和 Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	无菌
高效液相色谱级水	J.T. Baker	4218-03	高压灭菌
溶液
ACK – 氯化铵-氯化钾	Life Technologies	A10492-01
溴脱氧尿苷（BrdU）溶液（10 mg/ml）溶于 PBS			将 10 mg BrdU 溶于 1 ml PBS 中，过滤除菌。
CFSE，5 mM 溶于 DMSO			将 2.8 mg CFSE 溶于 1 ml DMSO 中。分装为每管 10 ml 的等分试样于无菌 200 ml 管中，避光保存于 -20oC。
伊红 Y 溶液	Sigma	HT110-2-32
Hanks 平衡盐溶液	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	无菌
肝素，20 mg/ml 溶于 PBS			将 100 mg 肝素溶于 5 ml 无菌 PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
Histopaque-1119	Sigma	11191	通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
Histopaque-1077	Sigma	10771	通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
荧光素酶细胞裂解缓冲液 x5	Promega	E153A	使用前用无菌水稀释至 1:5。
荧光素酶检测试剂	Promega	E1501	包含荧光素酶检测试剂粉末（E151A）和荧光素酶检测缓冲液（E152A）
Mayer 苏木精溶液	Sigma	MHS-32
PBS + 0.5% BSA			将 2.5 g BSA 溶于 500 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
PBS + 1% BSA			将 1 g BSA 溶于 100 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
5x PBS 含 2.5% BSA			将 12.5 g BSA 溶于 250 ml 无菌 HPLC 级水和 250 ml PBSx10 的混合液中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS			将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS 中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
FACS 缓冲液（含 0.5% BSA、2 mM EDTA 和 0.02% NaN3 的 PBS）			将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS  中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）和 500 ml 2% NaN3，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
生理盐水（0.9% NaCl）			将 9 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
0.2% NaCl 溶液			将 2 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
1.6% NaCl 溶液			将 16 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
2% 叠氮化钠			将 1 g 叠氮化钠溶于 50 ml 无菌 ddw 中，4oC 保存。高毒性。
3% 硫代甘油酸盐溶液			将 3 g 硫代甘油酸盐粉末溶于 100 ml ddw 中。                                        煮沸至溶液变黄，然后高压灭菌。
台盼蓝溶液（0.4%）	Sigma	T8154	用 PBS 稀释 1:10，得到 0.04% 溶液。
胰蛋白酶溶液 B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	无菌
1 mg/ml Zymosan A			将 1 mg Zymosan A 溶于 1 ml 无菌 PBS 中，置于 Eppendorf 管内。剧烈涡旋，并在 37 oC 孵育 30 分钟。勿高压灭菌。使用前新鲜配制。
试剂盒
EasySep PE 选择试剂盒	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE 选择混合液	STEMCELL Technologies	18151
EasySep 磁性纳米颗粒	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G 小鼠 MicroBead 试剂盒	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies	19762
EasySep 人中性粒细胞富集试剂盒	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU 流式试剂盒	BD Pharmingen	559619
MACS 中性粒细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-097-658
吞噬作用检测试剂盒	Cayman Chemical Company	500290
抗体
FcR 封闭抗体	Biolegend	101302
纯化的大鼠抗-Ly6G 抗体	BD Pharmingen	551459	克隆号 1A8
PE 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体	Biolegend	127608	克隆号 1A8
FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G	BD Pharmingen	551460	克隆号 1A8
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	克隆号 1A8
violetFluor 450 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	克隆号 1A8
FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD11b	BD Pharmingen	553310	克隆号 M1/70
FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 Ly-6C（GR-1）	BD Pharmingen	553127	克隆号 RB6-8C5
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD45	BD Pharmingen	553081	克隆号 30-F11
FITC 标记的大鼠抗小鼠 F4/80	Abcam	ab60343	克隆号 BM8
FITC 标记的小鼠抗人 CD66b	Biolegend	305103	克隆号 G10F5
纯化的大鼠同型对照抗体（IgG2a, k）	BD Pharmingen	553927	克隆号 R35-95
LEAF 纯化型 Armenian 仓鼠抗小鼠 CD3e 抗体	BioLegend	100314	克隆号 145-2C11