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方法文章

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

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DOI：

10.3791/52933

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2015年6月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center

本文内容

摘要

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

摘要

中性粒细胞是人体循环中数量最多的白细胞，在宿主抵御入侵微生物的过程中发挥重要作用。此外，中性粒细胞在对肿瘤细胞的免疫监视中也起核心作用。它们能够识别肿瘤细胞，并通过依赖细胞接触且涉及过氧化氢的机制，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）诱导肿瘤细胞死亡。具有抗肿瘤活性的中性粒细胞可从癌症患者或荷瘤小鼠的外周血中分离获得。这类中性粒细胞被称为肿瘤驯化中性粒细胞（TEN），以区别于健康个体或未处理小鼠的中性粒细胞，后者无明显肿瘤细胞毒性活性。与其他白细胞相比，中性粒细胞具有不同的浮力特性，这使得获取一种 > 经密度梯度离心后可获得纯度达98%的中性粒细胞群体。然而，在癌症患者、荷瘤小鼠以及慢性炎症状态下，除正常的高密度中性粒细胞（HDN）群体外，循环中还会出现明显的低密度中性粒细胞（LDN）群体。LDN与单个核细胞组分共同富集，可通过阳性或阴性筛选策略与单个核细胞分离。待通过流式细胞术确定分离所得中性粒细胞的纯度后，即可用于后续实验 体外 和 体内 功能检测。我们描述了监测中性粒细胞抗肿瘤活性、迁移能力、活性氧产生能力以及吞噬功能的技术。 离体我们进一步描述了标记中性粒细胞的技术 体内 追踪，并确定其抗转移能力 体内所有这些技术对于理解如何获取和表征具有抗肿瘤功能的中性粒细胞至关重要。

引言

中性粒细胞最初被定义为先天免疫细胞，是抵御入侵微生物的第一道防线。如今已知，中性粒细胞具有更广泛的功能，可参与针对外来抗原的适应性免疫应答1,2，调控造血3、血管生成4以及伤口愈合5。此外，中性粒细胞可通过其促肿瘤和抗肿瘤活性影响肿瘤生长及转移进展6,7。中性粒细胞的特征是具有多叶分叶核（因此被称为多形核（PMN）白细胞），并含有至少三种不同类型的颗粒以及分泌小泡8（图1A-C）。

中性粒细胞具有强大的吞噬能力以及高水平的NADPH氧化酶活性，这对于清除微生物至关重要，同时还能分泌多种趋化因子，有助于募集更多中性粒细胞及其他免疫细胞至炎症部位8,9。中性粒细胞的特征是表达大量表面受体，包括Toll样受体（TLRs）、C型凝集素受体（CLRs）、补体受体3（CD11b/CD18）以及其他黏附分子（例如，L-选择素、LFA-1、VLA-4和癌胚抗原相关细胞黏附分子3（CEACAM3/CD66b））、趋化因子受体（例如，CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、趋化物受体（例如，PAFR、LTB4R和C5aR）、细胞因子受体（例如，G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、甲酰肽受体（例如，FPR1-3）以及Fc受体（例如，CD16（FcγRIII）、CD32（FcγRII）和CD64（FcγRI））10。在小鼠中，中性粒细胞通常被鉴定为CD11b+Ly6G+表型，而人类中性粒细胞则通过CD11b、CD15、CD16和CD66b等白细胞标志物进行鉴定。此外，通常也可通过染色颗粒蛋白髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）来检测组织中的中性粒细胞。

中性粒细胞的多种功能是由同一类细胞介导，还是由不同的细胞亚群介导，目前尚不明确。越来越多的研究数据表明，中性粒细胞群体具有异质性，其表现出高度的可塑性，受促炎刺激因素和微环境的影响11,12。Fridlender et al.13 将肿瘤中的中性粒细胞大致分为两个主要亚群：具有抗肿瘤特性的 N1 型和具有促肿瘤特性的 N2 型。在癌症以及慢性炎症中，还存在另一类亚群，即粒细胞系髓源性抑制细胞（G-MDSCs），这类细胞能够抑制 T 细胞反应14。G-MDSCs 被认为是未成熟的髓系细胞，在小鼠中表现为 CD11b+Ly6ClowLy6Ghi 表型15，而在人类中则具有 CD15+/CD16low 表型16。与正常循环中的中性粒细胞相比，G-MDSCs 表达更高水平的精氨酸酶和髓过氧化物酶，但表达较低水平的细胞因子和趋化因子。它们的吞噬和迁移能力较弱，但活性氧（ROS）的产生水平更高15,17,18。本文将介绍一些用于分离和鉴定具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的基本方法。

中性粒细胞占人体循环中所有白细胞的大部分（45 - 70%；1,800 - 6,000/μl），而在小鼠中，正常情况下其数量相对稀少（10 - 15%；300 - 500/μl）。在炎症发生时，中性粒细胞数量持续增加，有时在癌症中也会升高，而癌症是一种慢性炎症状态7。中性粒细胞由骨髓中的多能共同髓系前体（CMP）细胞发育而来，经过髓母细胞（MB）、早幼粒细胞（PM）、中幼粒细胞（MC）、晚幼粒细胞（MM）和杆状核细胞（BC）等阶段的分化过程8。成熟的终末分化中性粒细胞可在骨髓中停留4 - 7天，然后释放入血液循环8。中性粒细胞在血液中的更新通常很快，平均半衰期为6 - 12小时，在炎症条件下该时间可能延长。未受刺激的中性粒细胞抗肿瘤活性有限，但可通过将幼稚中性粒细胞暴露于趋化因子IL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5和CXCL56,19而获得此功能，或通过人工方式暴露于佛波酯12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）来诱导6。

血液中性粒细胞的半衰期较短，且中性粒细胞数量较少（约 3 - 5 x 105) 来自未处理的6-8周龄小鼠1 ml血液，使得探索循环小鼠中性粒细胞的功能变得困难 体外为克服这一困难，研究人员已采用其他来源。例如，可从骨髓中获取大量中性粒细胞20 或在诱导无菌性炎症后腹膜的例如，经腹腔注射巯基乙酸盐肉汤或Zymosan A后）。需要注意的是，从腹腔获得的中性粒细胞不具有任何抗肿瘤活性（未发表观察结果）。

Granot 等6 观察到，将小鼠 4T1 乳腺癌细胞系原位接种于 BALB/c 小鼠后，小鼠会出现中性粒细胞增多症，且随着肿瘤进展而加重6（图 2A），因此在接种肿瘤后 3 至 4 周，可从 1 ml 血液中轻松分离出 2000 至 4000 万个血液中性粒细胞。这些中性粒细胞获得了抗肿瘤活性，因此被命名为肿瘤驯化中性粒细胞（TEN），以区别于幼稚中性粒细胞6（图 2B）。高密度中性粒细胞（HDN，图 1A）具有强效抗肿瘤作用，而在癌症背景下产生的低密度中性粒细胞（LDN，图 1B）则不具备此功能21。此外，荷瘤小鼠骨髓和脾脏中的高密度中性粒细胞也具有抗肿瘤活性（未发表数据）。需要注意的是，随着肿瘤进展，脾脏逐渐增大（脾肿大），其中中性粒细胞的数量也不断增加。

需要注意的是，在其他癌症模型中也会产生肿瘤诱导的中性粒细胞（TEN），包括自发性肿瘤模型（如 MMTV-PyMT 和 MMTV-Wnt1 乳腺肿瘤、k-Ras 驱动的肺癌）和接种性肿瘤模型（如 AT-3（MMTV-PyMT）和 E0771 乳腺癌细胞、LLC Lewis 肺癌细胞以及 B16-F10 黑色素瘤细胞）。然而，这些肿瘤模型中中性粒细胞的动员程度远低于接种 4T1 细胞的小鼠，接种后 3 周每毫升血液中仅达到 5–10 × 106 个中性粒细胞。

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方案

动物：5-7周龄的BALB/c小鼠购自Harlan（以色列）。所有涉及动物的实验均经希伯来大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。人类样本：从癌症患者和健康志愿者采集血液的程序已获哈达萨医学中心机构审查委员会（IRB）批准。 

1. 诱导具有抗肿瘤特性的中性粒细胞 体内 使用乳腺癌小鼠模型

注意：所有步骤均应使用无菌溶液在层流气流（LAF）生物安全柜中进行。

  1. 在10 ml含有4.5 g/L D-葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，加入10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM D-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素G和100 μg/ml硫酸链霉素，将5 × 105个4T1细胞接种于100 mm组织培养皿中。将细胞置于含5% CO2的湿润化培养箱中，37 °C培养3至4天。确保实验当天细胞融合度达到50 - 100%。
  2. 为使肿瘤细胞从组织培养皿上脱离，吸除培养基，用5 ml PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入3 ml浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶溶液。在37 ºC下用胰蛋白酶孵育2 - 3分钟。
  3. 加入10 ml含血清的培养基以中和胰蛋白酶，并反复吹打直至所有细胞脱落。将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中。
  4. 在室温下以200 × g离心5分钟。吸除上清液，保留200 μl液体覆盖在细胞沉淀上方。用残留液体重悬细胞，再加入10 ml PBS。将离心管倒置2 - 3次以获得均匀的细胞悬液，取出10 μl使用血细胞计数板进行细胞计数。使用台盼蓝区分活细胞与死细胞。
  5. 在室温下以200 × g将细胞悬液离心5分钟。吸除PBS，用PBS重悬细胞，最终浓度为2 × 106个细胞/ml。确保单细胞悬液无细胞团块。
  6. 使用0.3 ml注射器配30G × 8 mm针头，将1 × 106个4T1细胞或表达荧光素酶的4T1细胞悬浮于50 μl PBS中，正位注射至雌性BALB/c小鼠左侧腹股沟乳腺脂肪垫。
    1. 注射前，将小鼠置于诱导室中，以100%氧气为载体，通入流速较慢的异氟烷（3 - 5%）进行麻醉。
    2. 将小鼠仰卧于无菌手术垫上，确保其头部正确置于异氟烷鼻罩内。通过轻捏足爪确认麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。剃除注射部位周围的毛发，并用70%乙醇消毒。
    3. 使用无菌外科器械在腹股沟乳头与腹部乳头之间约中点处做一约5 mm的横向小切口，暴露脂肪垫后注入50 μl含1 × 106个4T1细胞的悬液。用9 mm夹子闭合切口，并于一周后移除夹子。注射表达荧光素酶的细胞可通过生物发光成像监测肿瘤大小及转移情况。
      注：该微创操作无需术后治疗，注射后小鼠可在2 - 3分钟内恢复意识。
    4. 持续监测小鼠直至其恢复意识，并确保其完全清醒后方可与其他小鼠合笼。
  7. 3 - 4周后，当原发肿瘤体积达到2 cm3时，通过缓慢通入CO2处死小鼠。在最后一次呼吸后立即使用连接1 ml结核菌素注射器（预先用肝素处理）的25G × 5/8'针头进行心脏穿刺取血。将注射器水平穿过膈肌向心脏推进时，针头开口应朝上，并缓慢逐步抽吸血液，避免施加过大压力（图3）。

2. 中性粒细胞分离

  1. 从荷瘤小鼠血液中分离细胞毒性中性粒细胞。
    1. 将从荷瘤小鼠（见方案 1.11）采集的 1 ml 血液用含 0.5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 稀释至终体积 6 ml。
    2. 在新配制的不连续蔗糖梯度上对稀释后的血液进行分层：
      1. 在 15 ml 圆锥形聚丙烯离心管底部加入 3 ml 经无菌过滤的密度为 1.119 g/ml 的蔗糖溶液。
      2. 缓慢而小心地将 3 ml 经无菌过滤的密度为 1.077 g/ml 的蔗糖溶液叠加在 1.119 g/ml 蔗糖层上方。随后，缓慢而小心地将 6 ml 稀释后的血液（方案 2.1.1）叠加在 1.077 g/ml 蔗糖层上方（图 4A）。建议将离心管倾斜持握，并以缓慢但连续的流速加入各组分，同时将移液管口朝向管壁下部，以避免产生湍流。
    3. 将含有稀释血液的离心管置于蔗糖梯度中，在室温下以 700 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。
    4. 小心地将离心管从离心机中取出，避免产生湍流。大部分红细胞将位于管底。高密度中性粒细胞（HDN）位于 1.119 g/ml 与 1.077 g/ml 蔗糖层之间的界面处，呈白色至红色环状（约在 3 ml 刻度处），而低密度白细胞则位于 1.077 g/ml 蔗糖层与含 BSA 的 PBS 之间的界面处，呈白色环状（约在 6 ml 刻度处，见 图 4B）。
    5. 吸除 PBS + 0.5% BSA 溶液，直至液面距低密度细胞层上方约 5 mm。通过缓慢旋转移液，用 1 ml 吸头缓慢吸取低密度细胞，并将细胞转移至含 0.5% BSA 的 30 ml PBS 中。
    6. 在同一梯度离心管中吸除上层液体，直至液面距高密度细胞带上方约 5 mm。用移液器吸取高密度细胞（主要为高密度中性粒细胞），并将其转移至含 0.5% BSA 的 30 ml PBS 中。
    7. 在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。
    8. 吸除上清液，通过将细胞重悬于 36 ml 无菌 HPLC 级水中 30 秒以裂解红细胞。随后加入 9 ml 含 2.5%（w/v）BSA 的 5 倍浓缩 PBS，以恢复等渗状态。
    9. 在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。
    10. 吸除上清液，将细胞重悬于 PBS-BSA 溶液中。使用血细胞计数板计数中性粒细胞数量，并用台盼蓝区分活细胞与死细胞。
    11. 在室温下以 400 × g 离心 10 分钟，将中性粒细胞重悬于所需的孵育培养基中，调整至最终细胞密度。立即使用中性粒细胞。
    12. 随后再次离心，将中性粒细胞重悬于孵育培养基中，调整至最终细胞密度。立即使用中性粒细胞。
  2. 从癌症患者中分离循环中性粒细胞。
    1. 将 10 ml 肝素抗凝（20 U/ml）的人血与等体积的 3% Dextran T500 生理盐水溶液混合，在室温下孵育 30 分钟。在此期间，红细胞将发生沉降。
    2. 在 50 ml 圆锥形聚丙烯离心管中加入 10 ml 密度为 1.077 g/ml 的蔗糖溶液，并缓慢将富含白细胞的上清液叠加在 1.077 g/ml 蔗糖层上方（图 4C）。
    3. 在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。高密度中性粒细胞（HDN）将出现在沉淀中。低密度中性粒细胞（LDN）则与单核细胞和淋巴细胞共同纯化，位于 1.077 g/ml 蔗糖层与血浆之间的界面处（图 4D）。
    4. 将中性粒细胞重悬于 10 ml 0.2% NaCl 溶液中 30 秒以裂解污染的红细胞，随后加入 10 ml 1.6% NaCl 溶液并轻轻倒置一次以恢复等渗状态。
    5. 在室温下以 160 × g 离心 5 分钟，并用 20 ml Hank's 平衡盐溶液洗涤三次。每次洗涤后均需离心并吸除上清液。
    6. 计数中性粒细胞，并将其重悬于补充有 2% FBS 的 RPMI-1640 培养基中，调整浓度为 2 × 106 个中性粒细胞/ml 或按需调整。

3. 使用磁珠富集血液中性粒细胞

  1. 阳性选择
    1. 按照方案1.8所述方法，使用肝素化注射器从小鼠采集1 ml血液。
    2. 将血液置于15 ml锥形管中，在室温下以400 × g离心5分钟。
    3. 吸除上清液，或保留血浆用于后续研究。
    4. 通过将细胞重悬于8 ml HPLC级水中裂解红细胞。30秒后，加入2 ml含2.5% BSA的5倍浓缩PBS以恢复等渗状态。计数细胞。
    5. 在室温下以400 × g离心5分钟。
    6. 每108个细胞用200 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS重悬细胞沉淀。
    7. 加入50 μl生物素标记的抗Ly6G抗体。充分混匀，在冰箱中孵育10分钟（不要放在冰上）。
    8. 加入150 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的冷PBS。
    9. 涡旋混匀抗生物素包被的磁性微珠储存液。取100 μl加入细胞悬液中，充分混匀后在冰箱中孵育15分钟（不要放在冰上）。
    10. 加入10 ml含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS洗涤细胞，在室温下以400 × g离心10分钟。
    11. 完全吸除上清液，将细胞重悬于500 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的冷PBS中。
    12. 将磁性分离柱插入固定在磁力架上的磁铁支架中，用500 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的冷PBS冲洗柱子。
    13. 将细胞悬液加至柱上。穿流液中含有未标记的Ly6G阴性细胞。
    14. 用500 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS洗涤柱子。额外的未标记细胞将出现在穿流液中。
    15. 再用另一份500 μl含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS重复洗涤一次。
    16. 将柱子从磁铁上取下，置于一个15 ml收集管上。加入1 ml含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS，并用力推动柱塞将磁性标记的细胞冲出。穿流液中含有Ly6G+中性粒细胞。
  2. 阴性选择
    1. 按照步骤3.1.1至3.1.5制备血液白细胞。
    2. 在5 ml聚苯乙烯圆底管中，将1 × 108个细胞重悬于1 ml含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS中。
    3. 加入50 μl正常大鼠血清。
    4. 加入50 μl中性粒细胞富集混合液（含有针对非中性粒细胞白细胞的生物素标记抗体），充分混匀，在冰箱中孵育15分钟。
    5. 加入4 ml含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS洗涤细胞，以400 × g离心10分钟。
    6. 弃去上清液，将细胞重悬于1 ml含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS中。
    7. 加入50 μl针对生物素和葡聚糖的四聚体抗体复合物。充分混匀，在冰箱中孵育10分钟。
    8. 在加入150 μl前，充分涡旋混匀含有葡聚糖包被磁珠的管子，然后加入细胞悬液中，充分混匀并在冰箱中孵育10分钟。
    9. 加入含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS，使细胞悬液体积达到2.5 ml。轻轻混匀，获得均一的细胞悬液。
    10. 将管子（不盖盖子）插入磁铁中，静置3分钟。
    11. 连续动作翻转磁铁及管子，使液体中未结合的细胞转移至新管中。保持磁铁和管子倒置2–3秒，然后恢复直立位置。磁性标记的非目标细胞将保留在原管管壁上，而未结合的中性粒细胞则存在于转移的液体中。

4. 中性粒细胞的细胞学染色

  1. 将 1×105 个中性粒细胞重悬于 50 µl PBS 中，并将细胞悬液转移至薄层细胞制备装置（如 Cytospin）。以 150 × g 离心 5 分钟。将预标记的玻片从装置中分离。
  2. 将玻片浸入 70% 乙醇中固定 2 分钟。让装置制备的样本（见步骤 4.1）在室温下干燥后再进行染色。将玻片在蒸馏水中浸洗 5–6 次。
  3. 在 Mayer 苏木精溶液中染色 1–2 分钟。用自来水冲洗 1 分钟。在伊红 Y 溶液中染色 10 秒。用自来水洗涤。依次用浓度递增的乙醇（70%、96% 和 100%）冲洗玻片进行脱水。让玻片短暂空气干燥，并在光学显微镜下观察。
    注意：苏木精呈深蓝紫色，可染核酸；而伊红呈粉红色，可非特异性地染蛋白质。中性粒细胞的胞质颗粒不被酸性或碱性染料着色，因此得名“嗜中性”。嗜碱性粒细胞经苏木精-伊红染色后呈深蓝色，嗜酸性粒细胞呈鲜红色，而中性粒细胞则呈中性粉红色（见 图 1A）。成熟中性粒细胞的特征是具有多叶核，通常较大，分为 2–5 叶，称为“分叶核中性粒细胞”（图 1A 和 图 1C）。未成熟中性粒细胞的特征是具有单叶、弯曲或环状的细胞核（图 1B）。

5. 通过流式细胞术测定中性粒细胞纯度。

  1. 将1×106个细胞重悬于100 μl FACS缓冲液（含0.5% BSA、2 mM EDTA和0.02% NaN3的PBS）中。对于全血样本，染色前需进行溶血处理（步骤3.1.1至3.1.5）。加入10 μl FcR阻断试剂，孵育5分钟。
  2. 加入0.5 μg针对小鼠中性粒细胞Ly-6G或人中性粒细胞CD11b和CD66b的荧光标记抗体，充分混匀后于室温孵育15分钟。
  3. 用含0.5% BSA和2 mM EDTA的PBS调整体积至500 μl，通过流式细胞术分析染色结果。

6. 跟踪中性粒细胞门控 体内

  1. 体内 中性粒细胞的 BrdU 标记
    1. 向荷瘤小鼠腹腔注射 100 μl 浓度为 10 mg/ml 的溴脱氧尿苷（BrdU）无菌 PBS 溶液。
    2. 注射后 48 小时，按照方案 2.1 分离血液中性粒细胞。使用 BrdU 流式检测试剂盒对 BrdU 标记的中性粒细胞进行染色。
  2. 中性粒细胞的 CFSE 标记
    1. 将 107 个中性粒细胞重悬于 1 ml 预热的 PBS 中。
    2. 向悬浮的中性粒细胞中加入 2 μl 的 5 mM CFSE 储存液，使其终浓度为 10 μM。充分混匀后于 37 °C 孵育 15 分钟。5 mM CFSE 溶液的配制方法：将 2.8 mg CFSE（5-(和 6-)-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）溶解于 1 ml DMSO 中，分装为每管 10 μl 至无菌 200 μl 离心管中，避光保存于 -20 °C。
    3. 加入等体积含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养基以中和过量 CFSE。于 37 °C 孵育 10 分钟。在室温下以 400 x g 离心 10 分钟，收集中性粒细胞。用 10 ml 含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基洗涤中性粒细胞两次。
    4. 以 400 x g 离心 10 分钟，弃上清，重悬于适量体积的 PBS 中。此时中性粒细胞（例如，1 x 107 个细胞）可经静脉注射或心脏注射注入受体小鼠体内。

7. 体外 监测分离中性粒细胞抗肿瘤活性的荧光素酶检测法

  1. 按照方案1.1-1.5中所述培养表达荧光素酶的肿瘤细胞，但将胰蛋白酶消化后的细胞重悬于添加了2% FBS的优化低血清培养基中。调整细胞密度至每毫升5 × 104 个细胞。
  2. 在白色平底96孔组织培养板的每个孔中，接种100 μl含0.5% FBS的优化低血清培养基，其中含有5,000个表达荧光素酶的肿瘤细胞。
  3. 接种肿瘤细胞4小时后，向每孔加入50 μl含0.5% FBS的优化低血清培养基，其中含有1 × 105 个中性粒细胞，并过夜培养。制备浓度为2 × 106 个细胞/ml的中性粒细胞悬液。对照孔仅加入50 μl不含中性粒细胞的培养基。每种实验条件需设置多个重复。
  4. 次日早晨，轻柔吸除上清液，每孔用200 μl PBS洗涤一次，随后吸除PBS，加入50 μl被动裂解缓冲液。对于易于脱落的细胞（如AT-3细胞），无需PBS洗涤，而在吸除培养基后直接加入细胞裂解缓冲液。
  5. 用铝箔包裹培养板，在室温下置于旋转摇床上以150 rpm振荡孵育20分钟。
  6. 将培养板放入化学发光检测仪中，向每孔自动注入50 μl荧光素酶检测试剂，每孔检测10秒的化学发光信号。
  7. 按以下公式计算肿瘤细胞裂解百分比：% 肿瘤裂解 = (1 - [含中性粒细胞样品的发光值] / [仅含培养基样品的发光值]) × 100%。

注意：为了评估中性粒细胞对转移性定植的贡献，可按照方案 8.1 中所述方法耗竭中性粒细胞。为实现有效耗竭，需从肿瘤移植后第 7 天开始给予中性粒细胞耗竭性抗体。

8. 中性粒细胞在乳腺癌小鼠模型中的抗转移活性。

  1. 在体 中性粒细胞耗竭
    1. 新鲜配制 12.5 μg 大鼠抗 Ly6G 抗体（中性粒细胞耗竭抗体）或大鼠同型对照抗体（IgG）2a，Κ) 溶于生理盐水中，每只小鼠给药体积为100 μl。
    2. 从肿瘤移植后的第3天开始，每天腹腔注射12.5 μg大鼠抗Ly6G抗体（100 μl）。对照小鼠腹腔注射12.5 μg（100 μl）大鼠同型对照抗体（IgG）2a，Κ)
    3. 从第14天开始，每天给予抗体两次，因为当4T1肿瘤生长时，中性粒细胞的产生速率会显著增加。
    4. 每隔一天，通过切开外侧尾静脉获取血样（2 - 3 滴），并将血液收集至含抗凝剂的试管中（肝素、柠檬酸盐或 EDTA）。
    5. 使用流式细胞术验证中性粒细胞耗竭，方法见方案5。
  2. 肿瘤中和试验（改良Winn试验）
    1. 从荷瘤小鼠中分离中性粒细胞。将 1 x 106 肿瘤细胞和 3 x 106 每只小鼠50 μl生理盐水中含中性粒细胞。
    2. 将细胞皮下注射至6至8周龄未经处理的BALB/c小鼠的 flank 部位。在肿瘤移植前剃除 flank 区域毛发，以便准确测量肿瘤大小。自移植后第5天起，每日测量肿瘤大小。
  3. 中性粒细胞过继转移
    1. 注射 2 x 104 将200 μl PBS中的表达荧光素酶的肿瘤细胞注入尾静脉。
    2. 中性粒细胞转移应在肿瘤细胞注射后4小时进行。因此，应在计划时间前约2小时开始从荷瘤小鼠中纯化HDN（方案2.1） 体内 转移。用PBS重悬中性粒细胞，终浓度为2.5 × 107 细胞/毫升
    3. 在引入肿瘤细胞4小时后，将小鼠置于加热灯下5分钟。将小鼠放入固定器中，注射5 × 106 HDN（200 μl）通过尾静脉注射。对照组小鼠注射溶剂（PBS）。
    4. 在不同时间点通过生物发光成像监测肺转移灶的形成 体内 成像系统或免疫组织化学方法
  4. 肺转移定植检测
    1. 注射 0.5 - 1 x 106 将亲本4T1细胞按照方案1所述方法正位接种于左侧腹股沟乳腺脂肪垫中。
    2. 第10天，将表达GFP的4T1细胞在PBS中重悬，终浓度为5 x 105 细胞/毫升。将小鼠置于热灯下5分钟。
    3. 将小鼠置于固定器中，并注射 1x105 将表达GFP的4T1细胞（200 μl）静脉注射至4T1荷瘤小鼠或未致敏小鼠。
    4. 第二天，处死小鼠，并用 20 ml PBS 灌注肺部以去除残留的红细胞。
    5. 切除肺组织，用于通过免疫组织化学分析GFP阳性细胞。  
      注意：为了评估中性粒细胞对转移性定植的贡献，可按照方案8.1所述方法耗竭中性粒细胞。为实现有效耗竭，应在肿瘤移植后第7天开始给予中性粒细胞耗竭性抗体。

9. 荷瘤小鼠中性粒细胞对T细胞增殖的抑制作用。

  1. 取出已安乐死的未免疫 BALB/c 小鼠的脾脏，并置于 10 ml PBS 中。
  2. 将脾脏置于放置在培养皿上的 40 μm 细胞筛网上，培养皿内盛有 RPMI-1640 培养基。用注射器的推杆端将脾脏研磨，使细胞通过筛网进入培养皿中。用 5 ml RPMI 冲洗细胞筛网，随后丢弃筛网。
  3. 将重悬的细胞转移至 50 ml 锥形离心管中，以 400 × g 离心 10 分钟。
  4. 弃去上清液，通过将细胞重悬于 36 ml 纯水中 20 秒以裂解红细胞，随后加入 4 ml 10 倍浓缩的 PBS 调整至等渗状态。或者，将细胞重悬于 5 ml 红细胞裂解缓冲液（ACK）中，在室温孵育 5 分钟。加入 10 ml RPMI-1640 培养基以中和 ACK。在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 5 ml PBS 中并计数。
  5. 将脾细胞重悬于 PBS 中，最终密度为 4 × 107 个细胞/2 ml，置于 15 ml 离心管中。加入 2 ml 浓度为 2.5 μM 的 CFSE PBS 溶液。迅速倒置混匀，于 37 °C 孵育 10 分钟，期间每隔 2 分钟轻轻混匀一次，并避光操作。
  6. 加入 4 ml 预热的 FBS（100%）以淬灭多余的 CFSE，在室温孵育 1 分钟。加入 3 ml PBS，以 400 × g 离心 10 分钟。
  7. 用 30 ml PBS 洗涤细胞，以 400 × g 离心 10 分钟。
  8. 将细胞通过 40 μm 细胞筛网过滤，并再次用 PBS 洗涤。
  9. 将细胞重悬于含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基中，最终密度为 2 × 107 个细胞/ml。
  10. 在 24 孔组织培养板中每孔接种 2 × 106 个细胞（200 μl）。
  11. 在 500 μl 含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基中加入 1 μg 纯化的 Armenian 仓鼠抗小鼠 CD3ε 抗体，以刺激细胞。
  12. 向 CFSE 标记的脾细胞中加入 300 μl 含 2 × 106 个 HDN 或 LDN 的 RPMI-1640 培养基（含 10% FBS），于 37 °C 孵育 3 天。未加中性粒细胞的对照孔加入 300 μl 培养基。每孔总体积应为 1 ml。
  13. 收集细胞并进行流式细胞术检测前处理。将细胞重悬于 100 μl FACS 缓冲液（方案 5）中，加入 10 μl FcR 封闭试剂，在室温孵育 5 分钟。
  14. 加入 1 μl APC 标记的抗 CD8α 抗体，在室温孵育 15 分钟。
  15. 通过流式细胞术检测 CD8+ T 细胞上的 CFSE 荧光强度（图 5）。每次细胞分裂后，CFSE 荧光强度减半，因此可通过 CFSE 染色强度确定细胞分裂次数。

10. 中性粒细胞迁移实验

  1. 在25 cm2的组织培养瓶中加入7 ml添加了0.5% FBS的优化型低血清培养基，并接种5×105个4T1细胞，于37 °C培养24小时。
  2. 将800 μl上清液转移至孔径为5 µm的迁移板的下室中。
  3. 将2×105个中性粒细胞重悬于400 μl添加了0.5% FBS的优化型低血清培养基中，将细胞悬液加入上室，于37 °C孵育2小时。
  4. 孵育结束后，移除上室，计数迁移至下室的中性粒细胞数量。

11. 监测中性粒细胞活性氧（ROS）的产生。

  1. 在不含酚红的Hank's平衡盐溶液中制备浓度为1.1 × 106 个中性粒细胞/ml的细胞悬液。每孔加入180 μl，使每个孔中含有2 × 105 个中性粒细胞，接种于白色96孔平底板中。
  2. 将培养板放入化学发光仪中。向每孔加入20 μl PBS配制的500 μM鲁米诺（Luminol）溶液，使终浓度为50 μM。在5分钟的时间过程中，每隔10秒记录一次基础化学发光值，每次读数持续1秒。
  3. 加入刺激剂（例如，10 nM或100 nM的PMA，或10 μM的fMLP）。将每种刺激剂用不含酚红的Hank's平衡盐溶液配制成10倍浓度的工作液，向相应孔中加入22 μl。对照孔中加入22 μl溶剂对照。
  4. 在化学发光仪中检测发光信号。分别进行短时间程（每10秒一次，持续5分钟）和长时间程（每分钟一次，持续1小时）的检测。

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结果

在最近的一项研究中，我们发现中性粒细胞具有抗转移功能6荷瘤小鼠的中性粒细胞获得细胞毒表型并具有杀伤肿瘤细胞的能力6这与来自未处理小鼠的中性粒细胞无显著抗肿瘤效应形成对比6方案部分所述的多种技术已用于研究抗肿瘤中性粒细胞功能 体外 和 体内6.

可从荷瘤小鼠中获取具有肿瘤细胞毒性的中性粒细胞6。为实现这一目的，将4T1细胞原位注射至小鼠左侧腹股沟乳腺脂肪垫（方案1）。接种肿瘤21天后，原发肿瘤体积达到1 - 2 cm3（图3——肿瘤明显位于左下腹部）。此时，处死小鼠并通过心脏穿刺每只小鼠采集1 ml血液（图3）。同时，采集未处理的非荷瘤小鼠血液。随后，通过密度梯度离心法纯化高密度中性粒细胞（HDN）（方案2.1及图4），获得高纯度（>98%）的中性粒细胞群体。中性粒细胞的活力通过台盼蓝染色法测定（方案2.1）。然后将中...

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讨论

中性粒细胞是所有白细胞中数量最多的一类，在感染和炎症发生时是首批响应的细胞。因此，它们对外界刺激极为敏感，易于被激活。此外，中性粒细胞的半衰期极短，更新速度很快。这些特性共同导致中性粒细胞的操作存在诸多困难，需要采用独特的实验策略。例如，目前已有多种中性粒细胞纯化方法，每种方法各有优缺点。

中性粒细胞研究中的一个关键步骤是从全血中纯化中性粒细胞。可采用密度梯度法或基于抗体的策略（阳性或阴性筛选）高效地纯化中性粒细胞。我们首选的方法是使用密度梯度法，因为该方法可以获得大量高纯度的中性粒细胞，且非特异性激活程度最低。然而，正如我们最近一项研究21所示，随着肿瘤进展，大量中性粒细胞会积聚在单个核低密度组分中。在此情况下，密度梯度法仅能获得高纯度的高密度中性粒细胞组分，但不能代表全部循环中性粒细胞群体，同时低密度中性粒细胞组分则被其他单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）严重污染。在这种情况下，首选方法应为基于抗体的纯化，尤其是阴性筛选。使用抗体纯化中性粒细胞可获得高纯度细胞，并能更好地代表全部循环中性粒细胞群体。然而，我们注意到，中性粒细胞与抗体孵育的时间越长，发生非特异...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

ZG 获得了以色列科学基金会 I-CORE 项目（资助号：41/11）、Abisch-Frenkel 基金会、Rosetrees 信托基金、以色列癌症研究基金会（ICRF - 研究职业发展奖）以及 CONCERN 基金会的资助。ZGF 获得了以色列癌症研究基金会（ICRF - 研究职业发展奖）、以色列卫生部首席科学家办公室以及以色列肺脏协会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系
小鼠 4T1 乳腺癌细胞ADCCCRL-2539培养基：DMEM + 10% 热灭活 FBS
塑料器皿与设备
24 孔组织培养板 Falcon353047无菌
100 mm 组织培养板 Corning430167无菌
25 cm2 组织培养瓶Nunc156340无菌
90 mm 细菌级培养皿 Miniplast, Ein Shemer, Israel20090-01-017无菌
15 ml 无菌锥形离心管 Miniplast, Ein Shemer, Israel835015-40-111无菌
50 ml 无菌锥形离心管 Miniplast, Ein Shemer, Israel835050-21-111无菌
Falcon 12 x 75 mm 圆底聚苯乙烯管 Becton Dickinson352058无菌
Millicell 24 孔迁移板，孔径 5μm Merck MilliporePSMT010R1无菌
白色 96 孔平底板 Costar3917无菌
细胞滤器（40 mm） BD Falcon352340无菌
20G x 1.5" 针头BD Microlance 3 301300无菌
23G x 1" 针头 BD Microlance 4300800无菌
25G x 5/8" 针头 BD Microlance 5300600无菌
0.3 ml 带 30G x 8mm 针头的注射器BD Micro-Fine Plus Demi320829无菌
9 mm 夹子 BD, AutoClip 427631无菌
EasySep 磁力架 STEMCELL Technologies18000
MACS LS 分离柱 Miltenyi Biotech130-042-201无菌
MidiMACS 分离器磁铁Miltenyi Biotech130-042-302
MACS 多功能支架Miltenyi Biotech130-042-303
显微镜载玻片 Menzel-Gläser Superfrost  Plus ThermoJ1800AMNZ
轨道摇床 Sky line, ELMIS-3.02.10L
酶标仪 TECANInfiniteF200Pro
粉末
牛血清白蛋白（BSA），V 级SigmaA7906
溴脱氧尿苷（BrdU） BD Pharmingen550891无菌
CFSE（5-(和 6-)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯）Molecular ProbesC1157
葡聚糖 T500Sigma31392
来自猪肠黏膜的肝素钠盐 SigmaH3149
叠氮化钠（NaN3）SigmaS8032高毒性，操作需谨慎
硫代甘油酸盐粉末 Difco225650
Zymosan ASigmaZ4250
培养基与补充剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）SigmaD5796无菌
Opti-MEM® I 减血清培养基 Life Technologies31985062无菌
罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基SigmaR8758无菌
胎牛血清（FBS），热灭活SigmaF9665无菌
L-谷氨酰胺Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-020-1A无菌
丙酮酸钠Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-042-1B无菌
青霉素-链霉素 x 1000 溶液Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-031-5无菌
磷酸盐缓冲液（PBS），不含 Mg2+ 和 Ca2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-1无菌
PBS x 10，不含 Ca2+ 和 Mg2+ Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-023-5A无菌
高效液相色谱级水 J.T. Baker4218-03高压灭菌
溶液
ACK – 氯化铵-氯化钾Life Technologies A10492-01
溴脱氧尿苷（BrdU）溶液（10 mg/ml）溶于 PBS将 10 mg BrdU 溶于 1 ml PBS 中，过滤除菌。
CFSE，5 mM 溶于 DMSO将 2.8 mg CFSE 溶于 1 ml DMSO 中。分装为每管 10 ml 的等分试样于无菌 200 ml 管中，避光保存于 -20oC。
伊红 Y 溶液SigmaHT110-2-32
Hanks 平衡盐溶液Biological Industries, Beth HaEmek, Israel02-016-1A无菌
肝素，20 mg/ml 溶于 PBS将 100 mg 肝素溶于 5 ml 无菌 PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。 
Histopaque-1119 Sigma11191通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
Histopaque-1077 Sigma10771通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
荧光素酶细胞裂解缓冲液 x5PromegaE153A使用前用无菌水稀释至 1:5。
荧光素酶检测试剂PromegaE1501包含荧光素酶检测试剂粉末（E151A）和荧光素酶检测缓冲液（E152A）
Mayer 苏木精溶液 SigmaMHS-32
PBS + 0.5% BSA将 2.5 g BSA 溶于 500 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
PBS + 1% BSA将 1 g BSA 溶于 100 ml PBS 中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
5x PBS 含 2.5% BSA将 12.5 g BSA 溶于 250 ml 无菌 HPLC 级水和 250 ml PBSx10 的混合液中，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS 中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
FACS 缓冲液（含 0.5% BSA、2 mM EDTA 和 0.02% NaN3 的 PBS）将 250 mg BSA 溶于 50 ml 无菌 PBS  中，加入 200 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）和 500 ml 2% NaN3，通过 0.2 mm 滤膜过滤除菌。
生理盐水（0.9% NaCl）将 9 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
0.2% NaCl 溶液将 2 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
1.6% NaCl 溶液将 16 g NaCl 溶于 1,000 ml ddw 中，高压灭菌
2% 叠氮化钠将 1 g 叠氮化钠溶于 50 ml 无菌 ddw 中，4oC 保存。高毒性。
3% 硫代甘油酸盐溶液                                       将 3 g 硫代甘油酸盐粉末溶于 100 ml ddw 中。                                        煮沸至溶液变黄，然后高压灭菌。
台盼蓝溶液（0.4%）SigmaT8154用 PBS 稀释 1:10，得到 0.04% 溶液。
胰蛋白酶溶液 B Biological Industries, Beth HaEmek, Israel03-046-1无菌
1 mg/ml Zymosan A将 1 mg Zymosan A 溶于 1 ml 无菌 PBS 中，置于 Eppendorf 管内。剧烈涡旋，并在 37 oC 孵育 30 分钟。勿高压灭菌。使用前新鲜配制。
试剂盒
EasySep PE 选择试剂盒STEMCELL Technologies18557
EasySep PE 选择混合液 STEMCELL Technologies18151
EasySep 磁性纳米颗粒 STEMCELL Technologies18150
Anti-Ly6G 小鼠 MicroBead 试剂盒Miltenyi Biotec130-092-332
EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies19762
EasySep 人中性粒细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies19257
FITC BrdU 流式试剂盒BD Pharmingen 559619
MACS 中性粒细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-097-658
吞噬作用检测试剂盒 Cayman Chemical Company 500290
抗体
FcR 封闭抗体 Biolegend101302
纯化的大鼠抗-Ly6G 抗体 BD Pharmingen 551459克隆号 1A8
PE 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体 Biolegend127608克隆号 1A8
FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly6GBD Pharmingen 551460克隆号 1A8
PerCP-Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G TONBO Biosciences65-1276克隆号 1A8
violetFluor 450 标记的大鼠抗小鼠 Ly6G TONBO Biosciences75-1276克隆号 1A8
FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD11bBD Pharmingen 553310克隆号 M1/70
FITC 标记的大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 Ly-6C（GR-1）BD Pharmingen 553127克隆号 RB6-8C5
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD45BD Pharmingen 553081克隆号 30-F11
FITC 标记的大鼠抗小鼠 F4/80 Abcamab60343克隆号 BM8
FITC 标记的小鼠抗人 CD66b Biolegend305103克隆号 G10F5
纯化的大鼠同型对照抗体（IgG2a, k） BD Pharmingen 553927克隆号 R35-95
LEAF 纯化型 Armenian 仓鼠抗小鼠 CD3e 抗体BioLegend100314克隆号 145-2C11

参考文献

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具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征
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