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方法文章

微藻生产力中重金属及其他无机污染物的定量分析

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DOI：

10.3791/52936

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2015年7月10日

 ,  ,  , 
1Mechanical and Aerospace Engineering, Utah State University

本文内容

摘要

将微藻培养与工业烟气相结合，最终会将重金属和其他无机化合物引入培养基中。本研究介绍了一种用于确定重金属及无机污染物对在光生物反应器中培养的Nannochloropsis salina生长过程的影响及其最终归趋的实验方法。

摘要

可再生燃料需求的不断增长促使研究人员探索替代原料（如微藻）的可行性。微藻具有诸多内在优势，包括高潜在产量、可利用非耕作土地以及能够与废水等废物资源相结合。大规模微藻生产系统的营养需求将要求将培养系统与工业废弃物资源耦合，例如来自烟道气的二氧化碳和来自废水的营养物质。然而，这些废弃物中存在的无机污染物可能导致微藻生物质中污染物的生物累积，进而对生产效率产生负面影响并限制其最终用途。本研究聚焦于实验评估14种无机污染物（As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn）对 Nannochloropsis salina 生长的影响及其归趋。实验在光生物反应器中进行，光照强度为 984 µmol m-2 sec-1，培养基 pH 值维持在 7，并添加了基于商业燃煤烟道气系统中典型成分浓度的无机污染物。在为期7天的生长周期结束后，采用冷蒸气原子吸收光谱法测定生物质和培养基中的 Hg 含量，采用电感耦合等离子体质谱法测定 As、Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn 的含量。结果表明，N. salina 对多金属环境较为敏感，这些污染物的引入导致其生物量产量出现统计学上的显著下降。本文所采用的技术方法适用于定量分析微藻生长情况并确定无机污染物的归趋。

引言

与传统陆生作物相比，微藻由于具有更高的固有太阳能转化效率，已被证明可实现更高的生物量和脂质产量1,2。要实现微藻的高生产率培养，需要提供多种营养物质，包括外源碳源。预计大规模微藻培养设施将与工业废气流（如工业烟气）相结合，以降低生产成本，同时实现环境修复。工业废碳通常以气态二氧化碳形式存在，并可能含有对微藻生产产生负面影响的污染物。具体而言，来自燃煤的烟气包含多种污染物，包括但不限于燃烧产物水和二氧化碳，以及硫氧化物和氮氧化物、细颗粒物、二噁英和呋喃等有机污染物，和重金属等无机污染物。这些污染物中的大多数，包括某些已知的重金属，对微藻生产力的影响尚未得到充分研究。其中一些元素在适当浓度下可作为营养物质，但在较高浓度下可能导致细胞功能障碍甚至死亡3。

将微藻与工业烟气结合可能会将无机污染物直接引入培养基中。燃煤烟气中含有多种无机元素（例如 As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn），其浓度各不相同，其中部分元素在低浓度下可作为微藻生长所需的营养物质。无机污染物具有高度亲和性，易于与微藻结合，并通过营养转运蛋白进一步被细胞内吸附。某些无机污染物（即 Co、Cu、Zn 和 Mn）是营养元素，可构成参与光合作用、呼吸作用及其他生理功能相关酶的组成部分3,4。然而，当这些金属元素过量时，可能产生毒性。其他元素如 Pb、Cd、Sn、Sb、Se、As 和 Hg，目前未发现其在任何浓度下对细胞功能具有促进作用，属于非营养性金属，可能对微藻培养生长产生负面影响3,5,6。这些污染物的存在均有可能对微藻细胞功能造成不利影响。此外，多种金属与微藻的相互作用使生长动态更加复杂，并可能影响其生长表现。

大规模经济效应与栽培系统的生产力直接相关7-19此外，微藻培养系统中的培养基循环利用至关重要，对于开放式跑道池（ORP）和光生物反应器（PBR）而言，其分别占系统总质量的99.9%和99.4%20培养基中无机污染物的存在可能因污染物的累积而最终限制微藻的生产效率以及培养基的循环利用。本研究通过实验确定了14种无机污染物（As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Sb、Se、Sn、V 和 Zn）在微藻培养系统与燃煤烟气耦合过程中可能达到的浓度下，对微藻生产效率的影响 N. salina 在气升式光生物反应器中培养。本研究中使用的污染物不仅存在于燃煤烟气中，还存在于城市垃圾烟气、生物污泥烟气、城市污水、产出水、受污染的地下水以及海水中。21-23本研究中所用浓度是基于微藻培养系统与燃煤CO₂排放源相结合时可能达到的预期水平。2 具有在商用PBR系统中已证实的吸收效率的来源20Napan 中提供了支持重金属和无机污染物浓度的详细计算过程 等24 采用分析技术来研究金属在生物量、培养基和环境中的分布情况。所提出的方法能够评估微藻在无机污染物胁迫下的生产潜力，并量化其最终归宿。

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方案

1. 生长系统

藻类生长用光生物反应器装置；包含管路、阀门、藻类培养物；示意图展示流路。

图1. 微藻培养系统。 (A) 空气转子流量计，(B) CO2 转子流量计，(C) 带电磁阀的pH控制器，(D) 数据记录仪，(E) 管路空气过滤器，(F) 空气分配总管，(G) 荧光灯组，(H) pH计，(I) 冷却系统，(J) 水浴槽，(K) 热电偶导线，(L) 气升式光生物反应器，(M) 加热器，(N) 走入式通风橱，(O) 排气口，(P) 供气毛细管，(Q) 空气过滤器，(R) 取样管，(S) 光生物反应器硅胶盖，以及(T) 硅胶盖上的pH检测孔。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 构建以下微藻实验培养系统（图1）。
    1. 准备12个气升式光生物反应器（PBR），每个由直径4.5 cm、高80 cm的玻璃管反应器组成，培养容量为1.1 L，并配有硅胶盖。准备预切割的玻璃毛细管（外径5 mm，内径1 mm），长度分别为10 cm（每PBR 3根）和85 cm（每PBR 1根）。
    2. 将硅胶盖放入-80 °C冰箱中冷冻。用甘油润滑钻头，在盖子仍处于冷冻状态时钻出3个孔，用于安装排气、取样和供气毛细管，另钻1个直径17 mm的孔用于安装pH探针。
    3. 将3根毛细管安装到位，其中最长的毛细管距PBR底部2 cm。在另一根毛细管中插入一段硅胶管，并在另一端连接一根毛细管，延伸至所需的取样点。用尺寸为21D的硅胶塞封住pH计的安装孔。
    4. 通过将环境空气通入水中鼓泡的方式进行加湿，并将加湿后的空气输送至空气分配总管。气体经0.2 µm滤膜过滤后，通过最长的玻璃供气毛细管导入藻类悬浮液中。
    5. 将压缩CO2通入加湿的气流中，以维持培养液悬浮体系的中性pH值在7.0 ± 0.1范围内。使用自动CO2供给系统（pH控制器）调节CO2供给速率，当藻类培养物pH达到7.1时开启电磁阀，pH降至6.9时关闭。
    6. 使用24根T5荧光灯提供光照，平均照度为984 µmol m-2 sec-1，接近室外光照峰值条件。
    7. 将PBR浸入水浴中，以维持系统温度恒定在约25 °C。通过循环冷却器和自动控温的循环加热水浴装置调节系统温度。
    8. 实时监测温度和pH值，并使用数据记录仪进行记录。
    9. 确保微藻培养系统的各个组件正常运行，特别是在收获微藻接种物或配制无机污染物之前，因为这些样品无法长期保存。

2. 实验室器皿准备

  1. 用肥皂和自来水清洗容量瓶、光生物反应器（PBR）、大瓶及其他容器，再用去离子水冲洗。
  2. 对实验器具进行酸洗，以去除任何无机污染物残留。可通过以下两种方法之一进行：
    1. 将实验器具在10%痕量金属级硝酸中浸泡过夜（注意：切勿吸入烟雾，浓硝酸可产生严重灼伤性和有毒烟雾，操作时应在通风橱内进行，并佩戴腈类手套、护目镜和实验服）。
    2. 将实验器具在50%痕量金属级硝酸中浸泡15分钟。
    3. 用去离子水彻底冲洗实验器具至少3次，确保完全去除所有酸液。尤其需彻底冲洗光生物反应器（PBR），特别是取样管和毛细管。若未充分冲洗，将导致培养基酸化，可能抑制细胞生长。应检测冲洗水的pH值，确认酸液已完全去除。
    4. 将光生物反应器（PBR）、容器和烧瓶在120 °C、标准大气压下高压灭菌至少30分钟。

3. N. salina 培养基制备

  1. 溶液A的制备：用去离子水（DW）部分填充一个1 L的容量瓶。放入一个磁力搅拌子，然后依次加入表1所示的化学品。确保每种成分完全溶解后再加入下一种组分。移去磁力搅拌子，并将容量瓶加水至1 L刻度线。
组分添加量 (g)终浓度 (g/L)
H3BO30.9000.900
Na2MoO4·2H2O0.0120.012
MnCl2·4H2O0.3000.300
ZnSO4·7H2O0.0600.060
CuSO4·5H2O0.0200.020

表1：溶液A配方。 数量为配制1 L浓缩液所需的量。

  1. 维生素溶液的配制：在三个不同的容量瓶中，分别加入如表2所示的维生素。将每种维生素溶液通过无菌的0.2 µm针头过滤器过滤至无菌容器中。在避光条件下，于-4 °C保存维生素溶液。
维生素用量 (mg)终体积 (mL)终维生素浓度 (mg/L)
生物素12.2250024.43
维生素 B1213.50100135.00
盐酸硫胺素977.635001,955.27

表2：维生素溶液配方。 数量为配制浓缩液所需的量。

  1. 用去离子水部分填充一个20 L的可高压灭菌容器，并放入一个磁力搅拌子。将容器置于磁力搅拌器上，按表3所示依次加入化学物质（维生素除外），每种物质完全溶解后再加入下一种。最后加去离子水至总体积达到20 L。
组分添加至培养基的量单位
NaCl350.00g
CaCl2·2H2O 3.00g
KCl 9.60g
Na2SiO3·9H2O1.14g
MgSO4·7H2O29.60g
KNO320.40g
KH2PO4 1.36g
柠檬酸铁铵0.10g
溶液 A20.00ml
生物素溶液*818.00µl
维生素 B12 溶液*296.20µl
盐酸硫胺素溶液*521.60µl
* 加入已灭菌并冷却的培养基中

表3：N. salina 培养基配方。 数量为配制20 L营养丰富培养基所需的用量。

  1. 将培养基在120 °C和大气压下高压灭菌30分钟。让培养基冷却至室温。
  2. 将容器置于磁力搅拌器上。加入步骤3.2中配制的维生素，并充分混合培养基。

4. 无机污染物储备液的配制

  1. 用去离子水（DW）部分填充表4中指定的容量瓶，并加入所列的单一盐类。再用去离子水定容至所需最终体积，充分混匀。请勿保存这些储备液，因为某些元素会吸附在容量瓶壁上。
    注意：本实验方案中使用的多种无机污染物具有致癌性、致畸性和致突变性，操作盐类时应佩戴口罩、手套和实验服。
分析物盐来源需配制的储备液体积（L）需加入烧瓶中的盐量（mg 盐）加入培养液中的分析物浓度（mg 分析物/L）
AsNaAsO20.114.87.74E-02
CdCdCl20.513.51.50E-02
CoCoCl2.6H2O0.534.71.56E-02
CrNa2Cr2O7·2H2O0.140.61.29E-01
CuCuCl2.2H2O0.138.31.30E-01
HgHgCl21.014.69.80E-03
MnMnCl2.4H2O0.158.81.49E-01
NiNiCl2.6H2O0.1112.02.51E-01
PbPbCl20.539.95.41E-02
SbSb2O30.526.74.06E-02
SeNa2SeO30.511.89.80E-03
SnSnCl2.2H2O0.53.93.76E-03
VV2O50.122.21.13E-01
ZnZnCl20.199.94.36E-01

表4：浓缩无机污染物储备液的配制。 将1 ml该浓缩储备液加入1.1 L的PBR培养基中，可达到最后一列所示的最终浓度。

  1. 通过无菌 0.2 µm 注射器滤器过滤溶液，对无机污染物储备液进行灭菌，并将滤液收集至无菌试管中。

5. N. salina 接种物制备

  1. 在500 ml的锥形瓶中加入第3步制备的200 ml培养基，然后加入3 g琼脂。用铝箔封口，在120 °C下高压灭菌20分钟。将溶液倒入无菌培养皿中，冷却至凝固。此操作应在无菌操作台中完成，或至少在清洁环境中靠近火焰处进行，以降低污染风险。
  2. 使用无菌接种环，将第5.1步制备的无菌培养皿中的N. salina细胞划线接种。将培养皿置于室温下、由T12灯照明的桌面上。让微藻生长至可见菌落。
  3. 将菌落转移至含有200 ml第3步制备的营养丰富的培养基的无菌带挡板锥形瓶中，并将其置于光照摇床（1,000 RPM）上培养。继续培养至培养基变为绿色。
  4. 将微藻转移至1.1 L的无菌光生物反应器（PBR）中。将PBR置于接种水浴中，使用T8荧光灯提供200 µmol m-2 sec-1的光照强度，并通过循环冷却器和自动控温循环水浴系统将温度维持在23 °C。将空气和CO2转子流量计分别调节至2.5 L min-1和25 cc min-1。
  5. 培养一周后，将生物量分装至含有新鲜培养基的新的1.1 L PBR中，继续培养，直至两个反应器中累计获得至少28 g干重生物量，该值可通过光密度测定确定。
  6. 通过离心收集接种用生物量：在10 °C下以2,054 × g离心15分钟，使用无菌离心管并采用无菌操作技术以避免污染。弃去上清液，并根据需要继续浓缩细胞。
  7. 所有生物量离心完成后，将细胞重悬于300 ml新鲜无菌培养基中。
  8. 取0.1 ml微藻培养液加入3 ml去离子水（DW）中稀释，再从中取0.1 ml加入3 ml DW中进一步稀释。确保样品充分混匀。立即使用分光光度计在750 nm波长下测定微藻浓缩液的光密度（OD）。
  9. 使用公式（1）计算浓缩液中生物量的含量。
    注意：公式（1）来源于N. salina的光密度与总悬浮固体（单位为g/L-1）之间的线性回归（R2=0.9995）。该公式专为材料表中所列的分光光度计型号开发；若使用其他型号的分光光度计，需重新建立校准曲线。
    1. 使用公式（2）计算在1.1 L体积的PBR中达到4 g/L-1培养密度所需的微藻浓缩液体积（单位为L）。

总悬浮固体公式：TSS=OD750×0.2962+0.0667；分析化学方程式。

体积计算公式：V = TSS × PBR<sub>v</sub>，用于光生物反应器计算。

  1. 采用无菌操作技术，将步骤 5.9 中确定体积的微藻浓缩液加入已灭菌的光生物反应器（PBR）中，使初始培养密度达到 4 g/L-1。用培养基将 PBR 补充至 1.1 L。重复此步骤，直至接种 6 个 PBR。将接种后的 PBR 置于种子液水浴中。
  2. 让 PBR 中的微藻生长 8 天，然后收获生物质（重复步骤 5.6 至 5.7）。重复步骤 5.8，计算初始培养密度为 1 g/L-1 所需的种子液体积。

6. 实验反应器

  1. 采用无菌技术，将步骤 3 中制备的约 1 L 培养基加入 12 个经酸冲洗的无菌光生物反应器（PBR）中。将 PBR 置于实验培养系统的水浴中。开启曝气，流速设为 1.5 L min-1。
  2. 用 70% 乙醇清洁已校准的 pH 计进行灭菌。测定 PBR 中培养基的 pH 值，确保其约为 7.0；若不符合，需重复步骤 2，以去除酸冲洗步骤中溶出的酸性物质。
  3. 使用 pH 7 缓冲液校准每个 pH 控制器，用乙醇（70%）对探头进行消毒，然后将其插入 PBR 的盖子中。
  4. 向每个 PBR（对照 PBR 除外）中加入 1 ml 步骤 4 中制备的无菌无机污染物储备液。让污染物在 PBR 中充分混合。PBR 中无机污染物的最终浓度见表 4最后一列，该浓度为燃煤电厂耦合系统中预计的最大浓度。
  5. 向对照 PBR 中各加入 14 ml 无菌去离子水（DW）。
  6. 将步骤 5.11 中获得的浓缩微藻接种物加入实验用 PBR，使初始培养密度达到 1 g/L-1。使生物量充分混匀。
  7. 开启高强度光照（984 µmol m-2 sec-1），启动 pH 控制器，并将 CO2 流速调节至 30 cc min1。从第 3 天起将 CO2 流速提高至 50 cc min-1。初始低 CO2 流速至关重要，可避免因气液传质和 pH 测量延迟导致 pH 值剧烈变化。
  8. 根据需要进行测量和取样。取样后务必标记液面位置。（注意：PBR 中某些无机污染物具有致癌性、致畸性和致突变性；处理样品时应佩戴手套并使用带盖容器）。
  9. 每天向 PBR 中添加无菌去离子水（DW），以补偿蒸发造成的损失。
  10. 培养 7 天后，以 9,936 × g 离心收集生物量，并将生物量和上清培养基均在 -80 °C 下保存。
  11. 在 0.1 mbar 和 -50 °C 条件下冻干生物量，过夜。将生物量研磨成粉（使用刮勺在离心管内将生物量研磨成粉）。将冻干后的生物量在 -80 °C 下保存。

7. 样品的微波辅助消解

生物质样品的消解是进行ICP-MS分析所需的预处理步骤。
注意：这些步骤使用带有受控泄压功能的密闭容器微波消解系统。（警告：酸消解过程中会产生高压，每次使用前应检查消解罐和防护罩的物理完整性，并重新塑形微波消解罐盖）。

  1. 用肥皂和水清洗聚四氟乙烯微波消解罐，用去离子水冲洗，并让消解罐自然风干。为去除消解罐中的痕量金属污染，请按照以下步骤进行酸消解处理。
  2. 调整微波消解罐盖的形状，并将瓶盖紧密关闭。
  3. 向每个消解罐中加入10 ml硝酸。
  4. 将消解罐放入安全防护罩中。确保安全防护罩内壁或消解罐外壁上没有残留生物材料、水或任何试剂，以避免对防护罩造成损坏。用带安全阀的盖子封闭防护罩，并确保瓶内弹簧与盖面齐平。将防护罩放置于转子上，使外圈消解罐的盖子通气口朝外，内圈朝内。
  5. 在1号消解罐中插入陶瓷测温套管和温度传感器。该温度计用于监测瓶内实际温度，并作为执行消解程序的控制参数。确保1号消解罐中的样品和试剂用量与其他消解罐相同。
  6. 输入表5所示的消解参数并开始消解。程序完成后，让消解罐在空气中冷却至室温。
步骤小瓶清洗样品消解
温度 (°C)时间 (min)最大功率 (W)温度 (°C)时间 (min)最大功率 (W)
1室温至190251,000室温至180151,000
2190101,000180151,000
排气-20--20-

表5：微波消解程序中使用的参数。

  1. 在通风橱内，将压力释放工具插入防护盖中，确保盖上的通气孔朝向远离操作者的方向。压力释放后，方可打开瓶盖（注意：消化瓶必须始终在通风橱内打开，因为酸消化生物质会产生有毒气体）。
  2. 妥善处理废酸。用去离子水（DW）冲洗聚四氟乙烯（Teflon）容器3次。让消化瓶自然晾干。
  3. 为消化生物质，将50 mg冷冻干燥的生物质样品加入微波消解容器中。为进行质量控制（QC），准备以下样品管：在两个不同的样品管中分别加入5 ml步骤9.1和10.1中配制的ICPMS 7级标准液或CVAAS 7级汞标准液（该样品管中所得消解液称为实验室加标空白液（LFB））；另留一个样品管为空（该样品管中所得消解液称为实验室试剂空白液（LRB））。
  4. 为消解培养基，将10 ml上清培养基加入已干燥并经酸冲洗过的微波消解容器中。为进行质量控制（QC），准备以下样品管：在两个不同的样品管中分别加入5 ml步骤9.1和10.1中配制的ICPMS或CVAAS 7级金属标准液（该样品管中所得消解液称为LFB）；在另一样品管中加入10 ml去离子水（DW）（该样品管中所得消解液称为LRB）。
  5. 调整微波消解容器盖的形状，并将样品管盖紧。
  6. 向每个样品管中加入7 ml高纯度痕量金属级硝酸和3 ml过氧化氢。通过轻轻旋转混匀溶液内容物。通过重复步骤7.4至7.7进行样品消解（使用表5中列出的微波消解参数进行样品消解）。
  7. 将消解后的样品转移至25 ml容量瓶中，用去离子水（DW）冲洗容器以提高回收率。用去离子水（DW）定容至刻度线。
  8. 将消解后的样品转移至带盖容器中，并在4 °C下保存，直至完成分析。本研究中，汞样品在同日完成分析，其他元素在三天内完成分析。

8. 质量控制（QC）样品

注意：应分析质控样本，以确保实验样本结果的可靠性。

  1. 用去离子水部分填充一个经酸冲洗过的1 L容量瓶。加入280 ml高纯级浓硝酸，并充分混匀（该溶液也称为空白溶液）（注意：务必始终将酸加入水中，切勿将水加入酸中，因为该放热反应可能非常剧烈）。让溶液冷却至室温。
  2. 除步骤7.9和7.10中制备的质量控制（QC）样品外，还需制备以下QC样品。
    1. 用于持续校准验证（CCV）：用校准标准液填充一个聚苯乙烯管（制备方法见步骤9.2和10.1）。将Hg标准溶液置于CVAAS进样架上，ICPMS标准溶液置于ICPMS自动进样器中。
    2. 用于持续校准空白（CCB）：用空白溶液（步骤8.1中制备的溶液）填充两个16 ml聚苯乙烯管。将其中一个样品放入CVAAS进样架，另一个放入ICPMS自动进样器。
    3. 用于实验室加标基质（LFM）：每12个样品中随机选取1个样品，针对每种类型的样品（i.e., 生物量或培养基）均进行此操作，并用于制备LFM。对于ICPMS分析，向一个聚苯乙烯管中加入0.5 ml ICPMS标准液7级和3 ml已消解的实验样品（来自生物量或培养基）。对于CVAAS分析，向一个聚苯乙烯管中加入2 ml Hg标准液7级和6 ml已消解的实验样品（来自生物量或培养基）。
    4. 混匀内容物，并将样品管置于ICPMS自动进样器中（ICPMS）或CVAAS进样架上（CVAAS）。
    5. 用于重复样品：每12个样品中随机选取1个样品，针对每种基质类型（e.g., 生物量、培养基、LFM或任何稀释基质）均进行此操作，并对样品管进行重复制备。将重复的样品管放入ICPMS自动进样器或CVAAS进样架中。
    6. 用于重复样品：每12个样品中随机选取1个样品，针对每种基质类型（e.g., 生物量、培养基、LFM或任何稀释基质）均进行此操作，并对样品管进行重复制备。将重复的样品管放入ICPMS自动进样器或CVAAS进样架中。
  3. 确定本研究的数据质量标准。本研究采用Eaton、Clesceri、Rice和Greenberg25所建立的质量控制标准。QC参数如下：持续校准验证（CCV）的百分差值（%D）在±10%以内25（Pb和Sb除外，参见讨论部分），实验室本底加标（LFB）的百分回收率（%R）在70–130%范围内25，实验室加标基质（LFM）的百分回收率（%R）在75–125%范围内25，相对百分差（RPD）在±20%以内25，且持续校准空白（CCB）应低于方法报告限（MRL）25。计算公式见步骤9.7。

9. 采用电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）进行定量分析

  1. 在分析当天，将约 5 ml 消解后的样品转移至聚苯乙烯管中，并将其放入 ICPMS 自动进样器中。将约 15 ml 消解后的样品加入聚苯乙烯管中，并放入 CVAAS 样品架中。
  2. 在分析当天配制校准标准溶液。按照表 6所述（标准溶液的详细说明见材料表），将购买的 ICPMS 标准溶液加入经酸冲洗过的容量瓶中，并用空白溶液（步骤 8.1 中制备的溶液）定容。
参数水平 1水平 2水平 3水平 4水平 5水平 6水平 7
需加入的购买标准品（ml）------10.0
需加入的水平 7（ml）0.01.02.55.020.025.0-
最终体积*（ml）-50.050.050.0100.050.0100.0
最终浓度（µg/L）
         75As0.02.05.010.020.050.0100.0
         111Cd0.01.02.55.010.025.050.0
         59Co0.010.025.050.0100.0250.0500.0
         52Cr0.02.05.010.020.050.0100.0
         63Cu0.05.012.525.050.0125.0250.0
         55Mn0.03.07.515.030.075.0150.0
         60Ni0.08.020.040.080.0200.0400.0
         208Pb0.01.02.55.010.025.050.0
         121Sb0.012.030.060.0120.0300.0600.0
         51V0.010.025.050.0100.0250.0500.0
         66Zn0.04.010.020.040.0100.0200.0
* 通过加入第8.1步制备的溶液来达到此体积

 表6：校准标准品的浓度。 1至7级。

  1. 从ICPMS中取出锥体，并在去离子水中超声清洗1分钟。将锥体干燥后重新安装回仪器中。
  2. 打开水冷机、气体（Ar、H2、He）、ICPMS，连接内标管线，并向自动进样器的清洗容器中加入去离子水、10%硝酸溶液、1%硝酸加0.5%盐酸混合溶液。
  3. 启动Masshunter Workstation软件，点燃等离子体，调节ICPMS，并加载表7中列出的方法参数。
参数数值
内标元素72Ge, 115In
射频功率1,500 W
等离子体气体流速14.98
雾化器气体流速1.1 L/min（载气和稀释气合计 — 0.6 + 0.5 L/min）
采样锥镍质，用于 x 透镜
截取锥镍
样品提升速率0.3 rps
雾化器泵转速0.1 rps
雾化室温度2 °C
扫描条件停留时间 1 秒，重复次数 3 次
H2 气体流速N/A
He 气体流速4.3 ml/min

 表7：ICPMS工作条件。

  1. 将校准标准品、质控样品和实验样品放入自动进样器中。在ICPMS软件中添加分析序列并开始样品分析。仪器将样品引入等离子体，在其中元素被离子化。随后，真空系统将离子导入检测器。离子根据其原子质量从轻到重依次分离。
    注意：ICPMS废液应收集于危险废物容器中，并按照相关规定妥善处理。
  2. 确保每种金属或类金属的校准曲线相关系数（R）值大于0.99524。
  3. 在样品分析过程中，按照公式3至公式626所述计算%R、%D和RPD，并将结果与8.3节中的项目数据质量标准进行比较。
    1. 计算回收率百分比（%R），以评估实验室加标空白（LFB）的损失或增益情况，以及实验室加标基质（LFM）中的基质干扰。

回收率计算公式；化学浓度准确性计算方程；分析化学。

回收率百分比公式，%R = ((LFM 样品结果 - 样品结果) / 已知添加的 LFM 浓度) × 100%。

  1. 计算百分比差异（%D），以确定运行 CCV 样品时仪器性能随时间的变化。

静力平衡方程，%D 计算公式，数学分析。

  1. 计算相对百分比差异（RPD），以确定在运行实验样品时方法精密度随时间的变化情况。

相对百分比差异公式，用于比较样本结果的 RPD 方程，统计分析。

  1. 为减少基质干扰（%R 超出可接受范围），将 %R 值较差的样品用去离子水按 1:3 的比例稀释（样品:去离子水）。

10. 冷蒸气原子吸收分光光度法（CVAAS）测定汞含量

  1. 在分析当天制备校准标准品。取1 ml购得的汞标准溶液，加入100 ml容量瓶中，并用第8.1步制备的溶液定容。
    1. 取2.5 ml该溶液置于100 ml容量瓶中，用第8.1步制备的溶液定容（此新溶液为7级汞标准溶液）。按照表8所述，将稀释后的7级汞标准溶液加入容量瓶中，并用空白溶液（即第8.1步制备的溶液）定容（参见材料表中购得的汞标准溶液说明）。
参数水平 1水平 2水平 3水平 4水平 5水平 6
需添加的 L7 汞标准溶液（ml）012.552025
最终体积*（ml）-50505010050
最终浓度（µg/L）00.51.252.5512.5
* 通过加入步骤 8.1 中配制的溶液来达到此体积

 表8：汞校准标准品的浓度。 1至6级。

  1. 打开氩气和空气阀门，开启原子吸收分光光度计和流动注射原子光谱仪（FIAS）。启动 CVAAS Winlab 软件，打开汞灯并预热，直至软件中的能量参数达到 79。载入用于汞分析的程序，参数见表 9。调节仪器中的光路，使透射率达到最大值。
参数数值
载气氩气, 100 ml/min
灯Hg无极放电灯, 设定为185 mA
波长253.7 nm
狭缝0.7 nm
池温度100 °C
进样体积500 µl
载液3% HCl, 9.23 ml/min
还原剂10% SnCl2, 5.31 ml/min
测量方式峰高
读数重复次数3

 表9：CVAAS工作条件。

  1. 将管路连接至由3%痕量金属级盐酸配制的载液溶液。
  2. 将管路连接至还原剂溶液，该溶液由10%氯化亚锡（适用于汞分析）溶于3%痕量金属级盐酸中配制而成。该溶液需在分析当天现配，因其易被空气氧化（注意：氯化亚锡具有高度危险性，操作时须穿戴防护装备。冷蒸气原子吸收光谱法（CVAAS）产生的废液应收集于危险品容器中，并按规定妥善处置）。
  3. 将汞标准溶液、质控样品及实验样品放入CVAAS样品架中，并在CVAAS Winlab软件中输入分析序列。运行标准样品并生成校准曲线方程。
  4. 运行质控样品和实验样品。CVAAS仪器自动吸取约5 mL样品，将样品中的汞还原为元素汞（Hg0）气体，并在密闭系统中以载气（Ar）将汞蒸气吹扫出溶液。汞蒸气通过汞灯光路中的吸收池，检测器测定253.7 nm波长处的光吸收量，并将其转换为汞浓度（注意：汞蒸气具有毒性，须确保仪器排风罩正常工作）。
  5. 在分析过程中按第9.7步计算回收率（%R）、稀释因子（%D）和相对百分偏差（RPD），并将结果与项目数据质量标准进行比对。

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结果

生物量产量

在本研究使用的光生物反应器（PBR）系统中，N. salina 的产量在7天内从对照组反应器的1 g/L-1 增长至8.5 ± 0.19 g/L-1（N = 12），而多金属污染组的产量为4.0 ± 0.3 g/L-1（N = 12）。实验在三个重复反应器及多批次培养中均获得了可重复的数据。图2A展示了基于三个独立PBR取样的平均培养密度，其标准误差极小。为确保该结果并非偶然，又进行了三批相似条件的培养实验，所有四批实验的综合结果如图2B所示。尽管存在生物学变异，本研究结果表明无机污染物对N. salina的生产具有持续的负面影响。从第2天起，暴露于污染物的PBR中的生物量产量与对照组PBR相比具有统计学上的显著差异（ANOVA，p <0.05）。

无机污染物定量的质量控制评估

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讨论

盐生微藻N. salina可在设计的培养系统中成功培养，结果可重复且生物量产量高。在7天的培养周期内，气升式搅拌实现了良好的悬浮培养混合状态，沉降或生物污染极少。荧光灯组光照强度的微小差异也被证明不会对生长产生明显影响。

研究表明，含有重金属污染介质的培养环境，其浓度若与燃煤烟气整合条件相当，会对生物量生长产生负面影响。本研究的可重复性凸显了多金属体系对生产率的影响。该过程中的多个步骤可能对生长产生不利影响，并导致系统污染，因此需要严格的实验准备。实验开始前测定培养基的 pH 值是一项质量控制步骤，可用于验证培养基是否发生酸化（例如，酸浸泡后光生物反应器冲洗不当所导致）。培养基酸化将影响藻类生长，并改变营养物质的生物可利用性（例如，无机碳形态和金属形态的变化），从而影响藻类结合位点、营养物质与金属之间的相互作用。这些研究要求对实验室设备进行细致的准备，以确保所添加金属的质量平衡能够准确测定。该过程中的其他步骤可能引入未被计量的金属，突显了使用适当纯度等级溶剂和化学品的必要性。在整个过程中实施适当的质量控制，可有效识别重金属污染物...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢美国国家科学基金会（资助号：1335550）、犹他州水研究实验室、Joan McLean 教授和 Tessa Guy 在金属/类金属分析过程中提供的帮助。作者还感谢 Laura Birkhold 在数据收集方面的支持以及 Danna Olbright 的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
氯化钠Fisher ScientificS271-3
二水合氯化钙Fisher ScientificC79-500
氯化钾Fisher ScientificP217-500
九水合偏硅酸钠 Fisher ScientificS408-500
七水合硫酸镁 Fisher ScientificM63-500
硝酸钾EMD ChemicalPX1520-5
磷酸二氢钾 Fisher ScientificP285-500
柠檬酸铁铵Fisher ScientificI72-500
硼酸Fisher ScientificA73-500
二水合钼酸钠EMD ChemicalSX0650-2
四水合氯化锰Fisher ScientificM87-500
七水合硫酸锌Fisher ScientificZ68-500
五水合硫酸铜Fisher ScientificC489-500
生物素 Acros Organics230090010
硫胺素 Acros Organics148990100
维生素B12 Acros Organics405920010
二水合氯化铜(II) Sigma-Aldrich221783-100G刺激性，对环境有害
氯化铅(II) Sigma-Aldrich268690-250G有毒，对环境有害
二水合重铬酸钠 Sigma-Aldrich398063-100G氧化性，剧毒，对环境有害
六水合氯化钴(II) Sigma-Aldrich255599-100G有毒，对环境有害
六水合氯化镍(II) Sigma-Aldrich223387-500G有毒，对环境有害
亚砷酸钠(偏亚砷酸钠) Sigma-Aldrich71287有毒，对环境有害
氯化镉 Sigma-Aldrich202908-10G剧毒，对环境有害
氯化汞(II) Sigma-Aldrich215465-100G有毒，对环境有害
二水合氯化亚锡Fisher ScientificT142-500腐蚀性。适用于汞分析。有极高危险性。
四水合氯化锰Fisher ScientificM87-500
五氧化二钒Acros Organics206422500对环境有害
二氧化碳 Air LiquideI2301S-1压缩气体
过氧化氢H325-500Fisher Scientific水溶液中含30%
ICP-MS标准品ICP-MS-6020High Purity Standards
汞标准品CGHG1-1Inorganic Ventures1000±6 µg/mL，溶于5%硝酸
氩气Air Liquide压缩气体
氦气Air Liquide压缩气体，超高纯度
氢气Air Liquide压缩气体，超高纯度
硝酸Fisher ScientificA509-P21267-70%硝酸，痕量金属级。注意：需在通风橱中操作。
盐酸Fisher ScientificA508-P21235%盐酸，痕量金属级。注意：需在通风橱中操作。
设备
科学预真空灭菌器Steris31626ASV-120
离心机Thermo Fisher46910RC-6 Plus
分光光度计Shimadzu1867UV-1800
pH控制器HannaBL981411X4
转子流量计，X5DwyerRMA-151-SSVT31Y
转子流量计，X5DwyerRMA-26-SSVT35Y
循环水浴锅Fisher Scientific13-873-45A
紧凑型冷却器VWR13270-120
冷冻干燥机Labconco7752020
搅拌器Fisher Scientific11-100-49S
pH实验室电极Phidgets Inc3550
电感耦合等离子体质谱仪Agilent Technologies7700 Series ICP-MS连接CETAC ASX-520自动进样器
FIAS 100Perkin Elmer InstrumentsB0506520
原子吸收光谱仪Perkin Elmer InstrumentsAAnalyst 800
石英加热池Perkin Elmer InstrumentsB3120397
微波消解仪Milestone可编程，最大功率1,200 W
微波转子Milestone配备24个75 ml聚四氟乙烯（PTFE）消解罐，用于密闭容器微波辅助消解
材料
0.2 μm注射器滤器Whatman6713-0425
0.2 μm注射器滤器Whatman6713-1650
0.45 μm注射器滤器Thermo FisherF2500-3
聚苯乙烯管Evergreen222-2094-05017 x 100 mm，带盖，16 ml，聚苯乙烯
八角形磁力 搅拌 子Fisher scientific14-513-60聚四氟乙烯（PTFE）包裹的磁铁

参考文献

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