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建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

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DOI：

10.3791/52940

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2016年10月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Bioingénierie et Biomécanique Ostéo-Articulaires (B2OA - UMR CNRS 7052), Université Paris Diderot, 2Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Université Paris-Est

本文内容

摘要

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。

摘要

使用组织工程骨构建体是一种克服自体移植在治疗大段骨缺损中局限性的有吸引力的策略。小鼠作为模式生物，已在骨相关研究中被广泛使用。然而，小鼠的大段骨干骨缺损模型较为少见，且常采用会填充骨髓腔并无法提供理想机械稳定性的骨固定方式。本研究旨在建立一种在裸鼠中具有临界尺寸的节段性股骨缺损模型。采用专用导板进行3.5 mm的股骨干中段截骨（约占股骨长度的25%），并通过前方放置的锁定钢板和4枚锁定螺钉进行固定。骨缺损随后保持空置或填充骨替代材料（同系骨移植物或珊瑚状支架）。通过放射影像学无创监测骨愈合过程， 体内 微计算机断层扫描，并随后进行评估 离体 动物安乐死后，术后10周进行微型计算机断层扫描（micro-computed-tomography）和未脱钙组织学分析。所有小鼠术后恢复良好，术后一天内即观察到完全负重。此外，在整个研究过程中，所有实验动物均实现了稳定的骨固定以及植入材料的可靠固定。当骨缺损未填充时， consistently 出现骨不连。相比之下，当骨缺损填充同基因型骨移植物时，始终观察到骨愈合。当骨缺损填充珊瑚衍生支架时，可在骨切除边缘与支架界面处以及支架内部短距离范围内观察到新骨形成。

本模型描述了一种在小鼠中通过钢板内固定实现稳定、可重复的股骨临界尺寸缺损模型，且具有较低的病理性风险。这种新型的承重节段性骨缺损模型可能有助于研究与骨科应用相关的骨再生内在机制。

引言

大段骨干骨缺损对骨科外科医生而言是一项重大挑战。目前被视为金标准治疗的自体骨移植存在供体来源有限以及取骨相关并发症的问题。因此，在骨科手术中，人们已探索将骨髓间充质干细胞与成骨传导性支架相结合的组织工程骨构建物作为自体移植物的替代方案。

迄今为止，大多数研究都是在具有临床相关性的动物模型（如狗、猪和绵羊）1-3中开展的，但在小型动物模型（如小鼠）中对这些构建体进行原位、节段性、临界尺寸骨缺损的初步评估可能具有多个优势：（i）成本较低；（ii）可进行大量动物实验；（iii）与大型动物模型相比，小鼠品系的一致性可减少个体间在支架降解和骨形成方面的差异；（iv）最重要的是，特异性抗体和基因靶向动物的可获得性，使得能够评估骨愈合过程中涉及的生物学过程。最后但同样重要的是，使用免疫缺陷型小鼠品系还可实现采用人源移植物或细胞进行研究，而不会在小鼠体内引发不良免疫反应。

尽管具有上述优势，小鼠大段骨干骨缺损模型仍较为少见。大多数此类模型采用髓内针进行骨固定，这会占据骨髓腔空间（从而限制了可测试材料的体积），并且由于无法提供旋转和轴向稳定性，影响了实验的可重复性2,4-7。

本研究的目的包括：（i）模拟临床骨不连情况，描述一种可重复的、具有临界尺寸的节段性股骨缺损小鼠模型，该模型通过精确且可重复的锁定钢板骨固定技术进行稳定，从而提供高度稳定的生物力学环境8-10；（ii）利用两种潜在的骨替代材料展示该模型，并描述可采用的骨形成分析方法。

方案

伦理声明：本研究中使用的小鼠均按照欧洲实验动物管理和使用委员会发布的指南（指令 2010/63/EU 和欧洲公约 ETS 123）进行处理。"实验方案"已获得拉里布瓦西埃圣路易医学院伦理委员会（CEEA LV/2010-01-04）的批准。

1. 动物

  1. 使用无胸腺小鼠（10周龄）。使用至少6只小鼠，缺陷处留空作为阴性对照组。

2. 支架制备

  1. 同基因型移植物制备
    1. 使用骨等植体填充缺损，为对照组提供至少6只动物的最小样本量。
    2. 通过采集来自同种小鼠的切除股骨获取骨同种移植物 "缺陷留空或 "珊瑚支架填充的缺损" 分组（此举可避免使用额外动物来采集骨同种异体移植物）11.
    3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗切除的骨组织，并用无菌湿纱布覆盖以保持无菌状态。
  2. 珊瑚支架制备
    1. 使用由天然珊瑚制成的支架： Acropora sp. 珊瑚外骨骼立方体，3 × 3 × 3 mm，作为潜在骨替代材料，至少使用6只动物。
    2. 将每个珊瑚立方体手工雕刻成圆柱形（高 3.5 mm，直径 2 mm）。
    3. 将每个支架通过高压灭菌（121 °C，20 分钟）进行灭菌，用无菌 PBS 洗涤，并在植入小鼠前置于完全培养基（α-MEM）中浸泡 24 小时。

3. 麻醉操作与镇痛

  1. 在麻醉前15分钟，通过皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg动物体重）以提供预防性镇痛。
  2. 每30分钟向动物眼部涂抹眼膏以防止角膜干燥，此操作需在动物处于麻醉状态下进行。
  3. 将小鼠置于加热垫上，以防止低体温。
  4. 手术过程中的麻醉与镇痛
    1. 腹腔注射含有赛拉嗪（8 mg/kg）和氯胺酮（100 mg/kg）的溶液。
    2. 输送氧气 通过 流速（50 ml/min）
    3. 通过观察肌肉松弛良好且动物对有害刺激无反应，确认麻醉深度足够（例如，坚定的足趾捏压）
    4. 皮下注射单剂量恩诺沙星（0.05 mg/kg）以进行微生物预防。
  5. 术后镇痛
    1. 术后每12小时皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），连续3天，以提供镇痛。
  6. 诊断成像过程中的麻醉
    1. 将小鼠放入麻醉盒中，然后分别使用约4%和2%的异氟烷（溶于氧气）进行麻醉诱导和维持。
    2. 通过观察动物肌肉充分放松且无活动，确认麻醉深度足够。
  7. 恢复条件
    1. 将小鼠置于加热垫上直至完全恢复
    2. 手术后，动物未恢复足够的意识以维持胸卧位时，不得无人看管。
    3. 动物在手术后未完全恢复前，不得放回与其他动物同处的环境中。
  8. 术后状况
    1. 在前3天内将小鼠单独饲养，第3天后每笼饲养4只。
    2. 提供水和适应性食物 随意摄取让小鼠在术后期间自由负重，不限制其任何活动。

4. 手术操作：股骨节段性缺损模型11,12

  1. 麻醉后，将每只小鼠置于俯卧位，左后肢伸展。
  2. 使用10%聚维酮碘对肢体进行无菌手术刷洗，持续5分钟，然后在肢体下方放置无菌铺巾以创建无菌区域（使用无菌透明铺巾以便在手术过程中监测呼吸运动）。手术过程中需注意保持手术区域的无菌状态。
  3. 在股骨前外侧从髋关节至膝关节做15–17 mm的纵向皮肤切口。
  4. 切开 阔筋膜，分割 股外侧肌 肌肉和 股二头肌 肌肉以充分暴露股骨骨干的全长。操作时需注意保护后侧的坐骨神经和远端的关节囊。图1).
  5. 为增强股骨骨干的暴露，横断 臀肌 和 股二头肌 来自第3个rd 转子
  6. 在股骨干中段进行环形截骨。
  7. 在股骨前侧放置一块6孔钛合金微型锁定板（长10 mm，宽1.5 mm，重量：30 mg）。
    注意：该接骨板的孔洞呈圆柱形底部与锥形凹陷结合的结构，可容纳钛制自攻型锁定螺钉（长2 mm，外径0.47 mm，重量5 mg，螺钉头部底面带螺纹，可与接骨板孔内螺纹咬合实现锁定），螺钉连接一螺钉尾柄，锁定后该尾柄可扭断去除。
  8. 使用0.3 mm钻头，通过专用或非专用发动机以2,500 rpm转速（功率约500 mW）在钢板最靠近近端的位置钻孔12).
  9. 使用专用螺丝刀插入第一颗螺丝，然后将其锁紧（图2).
    注意：由于钢板的对位由第一枚螺钉的置入决定，因此在置入螺钉时，必须确保钢板与股骨平行。
  10. 以类似方式钻入钢板最远端的螺钉孔，插入并锁定螺钉（图3).
  11. 插入另外两个外侧螺钉，但不要锁紧。
  12. 将0.22 mm Gigli锯的钢丝以内外侧方向紧贴骨骼周围放置，然后将其插入导向架的槽中图4).
  13. 将专用夹具插入最后两个螺钉的杆部，并将其置于板的上方（图5).
  14. 使用Gigli锯在灌注（使用无菌等渗盐水）条件下进行3.5 mm长的股骨中段骨干截骨，以防止热坏死。由外科医生的助手持握导向架，外科医生施加持续稳定的张力。注意避免锯丝缠绕，并使用锯丝的中段三分之二部分。避免过度移动，以获得平整的骨切面。图6).
  15. 截骨完成后，取出吉列锯。为避免软组织损伤，应从一侧靠近骨骼处将锯丝剪断。
  16. 取下夹具并拧紧最后两个螺钉（图7).
  17. 可将节段性缺损留空，或通过手术将待测材料植入缺损处进行填充。
  18. 用无菌等渗盐水大量冲洗手术区域。
  19. 放置 股外侧肌 将肌肉松散地覆盖于骨板之上。使用5.0规格的Glycomer 631缝线，采用单纯连续缝合方式闭合筋膜及皮下组织；使用4.0规格的Glycomer 631缝线，采用单纯间断缝合方式闭合皮肤。或者，也可使用皮肤粘合剂闭合皮肤。

5. 在体实验 骨再生评估

  1. 在小鼠麻醉状态下，使用常规 X 射线（26 kV，10 秒；2 倍放大；20 线/毫米空间分辨率）和高分辨率显微计算机断层扫描（μCT）进行纵向放射学评估。
  2. 进行 μCT 分析时，以 36 μm 的分辨率采集图像（50 kV 和 478 mA，曝光时间 40 毫秒，使用 0.5 mm 铝滤光片，旋转步长 0.7º，断层旋转 180º），并使用内置软件分析图像。

6. 离体 骨再生评估

  1. 手术后十周，使用异氟烷与氧气混合气体诱导麻醉，随后通过腹腔注射过量巴比妥类药物（1 ml 戊巴比妥钠）处死小鼠。
  2. 切除股骨，去除表面肌肉组织，并将骨样本在4%多聚甲醛（pH 7.4）中固定四天。
  3. 在多聚甲醛固定后，从每块切除的骨样本上移除钢板和螺钉。
  4. 离体 μCT 分析
    1. 将每块切除并固定的骨样本置于装有75%乙醇的聚乙烯管中，使用离体 μCT进行分析。
    2. 在80 kV和100 μA条件下采集图像（曝光时间为1,000毫秒，铝0.5滤光片，相机像素尺寸为4 μm（2,400 × 4,000，体素尺寸为7 μm）），每个0.9º旋转步进平均采集四帧图像。
    3. 使用内置软件，通过汉明滤波反投影法重建三维图像（平均体素尺寸为13 μm）。
    4. 为定量分析骨形成情况，使用内置软件在与缺损相对应的确定且一致的兴趣区域内，计算矿化组织体积（灰度下限为45灰阶指数，上限为240灰阶指数）。
    5. 对每只小鼠均以相同方式、在相同兴趣区域内进行分析。
    6. 采用单因素方差分析（置信区间为95%，显著性水平p < 0.05）比较各组间骨愈合率及兴趣区域内矿化组织体积。
  5. 组织学分析
    1. 将每块切除并固定的股骨样本包埋于甲基丙烯酸甲酯树脂中，并进行未脱钙组织学处理。
    2. 使用水冷式圆形金刚石锯沿纵向将每块骨样本切成厚片（200 μm）。
    3. 将每块骨样本切片研磨至厚度为100 μm，抛光后使用Stevenel蓝和van Gieson苦味酸酸性品红染色。
      注：染色后在光学显微镜下观察，细胞呈蓝色，骨组织呈粉红色，珊瑚呈棕色。

结果

上述手术操作持续45至60分钟。在手术助手的协助下，无需使用任何放大系统即可顺利进行骨切除和骨固定。术中未发生并发症。在一项针对18只小鼠的初步研究中11术后X线片显示骨缺损长度（3.43 ± 0.12 mm）及接骨板位置（膝关节腔与接骨板远端之间的距离 = 2.65 ± 0.56 mm）具有可重复性。

麻醉相关死亡率约为 5%。

所有动物的手术肢体功能恢复良好，术后一天内即观察到完全负重。 （动画图1）. 本研究中使用的骨固定材料（接骨板和螺钉）重量约为小鼠体重的0.1%。未出现术后并发症（例如， 伤口感染，植入物失败，骨移植移位， 等等。未发生自残或由同笼伙伴造成的伤害。

当手术诱导的骨缺损未进行填充时，未观察到明显的骨形成，且 consistently 出现骨不连。相比之下，当缺损处填充了同基因移植物或珊瑚支架时，可观察到从近端和远端骨边缘延伸出的新骨形成。此外，在大多数使用同基因移植物处理的缺损中，骨形成实现了骨连续性的重建 (图8)；而使用珊瑚支架填充的缺损中，新骨仅在支架内部被观察到。事实上，在距离骨边缘超过1 mm 的区域未观察到任何骨组织。所有组织学分析结果中均未发现软骨，这表明所实现的骨愈合具有稳定性 (图9，图10)。

X射线和显微CT分析结果表明，植入后10周，空白缺损组的所有动物均未发生骨愈合。通过显微CT分析测定的矿化组织体积为0.8 ± 0.3 mm³。3 且代表新形成的骨组织。在同种移植组和珊瑚支架组中，分别有4只和4只动物实现了骨愈合。通过显微CT分析评估的矿化组织体积为4.4 ± 0.9 mm3 和 8.9 ± 0.7 mm3然而，在这些组中，由于同种移植物和珊瑚支架均含有矿物质，因此无法真正区分新形成的骨组织与残留的植入材料（同种移植物或珊瑚支架）。同种移植物组和珊瑚支架组的骨愈合率以及矿化组织体积均显著高于（p < 0.05）单纯血凝块组和空白对照组。 < 0.001）高于缺损未处理组所获得的结果。

用于骨折固定实验的啮齿动物股骨外科暴露，骨科研究方法。
图1：股骨节段性缺损造模的外科暴露。 在股骨前外侧做一长度为 15 - 17 mm 的纵行皮肤切口，切口自髋关节延伸至膝关节。切开fascia lata；分离vastus lateralis肌和biceps femoris肌，以充分暴露股骨干全长。请点击此处查看该图的放大版本。

股骨截骨术；骨固定方法；外科实验；骨科研究。
图 2： 钢板定位与近端螺钉置入。 将钢板置于股骨前侧。钻孔位于钢板最靠近近端的孔位；插入第一枚螺钉，随后进行锁定。请点击此处查看该图的放大版本。

骨固定手术；用于骨折稳定的骨科植入物示意图及手术设置。
图 3：远端螺钉置入。 对接骨板最远端的螺孔进行钻孔，并插入并锁定螺钉。（经许可转载自 Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280）请点击此处查看该图的放大版本。

骨科固定方法；示意图及外科应用；展示骨修复技术。
图 4：吉列锯定位。 另外两个外侧螺钉已插入但未锁定，将直径为 0.22 mm 的吉列锯钢丝紧密地围绕骨骼以内外侧方向缠绕。 请点击此处查看此图的放大版本。

使用外固定器进行骨固定的过程；骨折稳定的示意图和手术设置。
图5： 导板定位。 将导板安装在最后两枚螺钉的杆部，并置于钢板上方，然后将锯线插入导板的槽中。（经许可转载自 Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280） 请点击此处查看此图的放大版本。

骨科固定过程；显示骨骼对齐与稳定的示意图和手术照片。
图 6：截骨术。完成截骨操作后，撤出吉列锯。（经许可转载自《Tissue Eng Part C》, 2013, 19(4), 271-280） 请点击此处查看该图的放大版本。

骨固定实验，外固定方法，示意图与手术设置，骨科研究。
图7：内部螺钉锁定。 移除夹具后，将最后两个螺钉锁定。随后，节段性骨缺损保持空置或填充待测材料。（经许可转载自《组织工程》C部分，2013年，19(4)，271-280） 请点击此处查看该图的放大版本。

骨愈合进程、不同时间点的X光图像、骨缺损、移植物、支架比较、研究实验。
图8： 小鼠股骨代表性术后X线片及矢状面μCT重建图像。 小鼠股骨相应骨缺损区域，分别为空白对照 (A-E)，或填充大块同基因型骨移植物 (F-J)，或填充大块Acropora珊瑚支架 (K-O)；术后即刻 (A, F, K)、术后4周 (B, G, L)、术后6周 (C, H, M) 以及术后10周 (D, E, I, J, N, O)（钢板长度 = 10 mm）。(经许可转载自 Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280) 请点击此处查看该图的高清版本。

显示骨整合脊柱固定的X射线与组织学图像，呈现结构分析与合成。
图9：本研究中测试的珊瑚支架填充缺损的代表性X线片、μCT重建图像及组织学结果。 在周围骨边缘与珊瑚支架之间观察到大量新形成的骨组织；相比之下，支架内部骨组织较少。染色方法：Stevenel蓝与von Gieson苦味品红。在此条件下，骨组织、细胞和珊瑚分别呈红色、蓝色和棕色。比例尺 = 500 μm。ACS = Acropora 珊瑚支架；BN = 骨组织。（经许可转载自 Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280）请点击此处查看此图的放大版本。

骨组织显微镜分析；组织学图像 A、B、C；可见纤维组织、骨髓和珊瑚支架。
图10：空白缺损（A）、填充大块同基因型骨移植物（B）及填充珊瑚支架（C）的代表性组织学图像。 在未填充的缺损区域，可见骨边缘呈圆形，骨髓腔被填充，并有大量纤维组织深入缺损内部。在填充大块同基因型骨移植物的缺损区域，移植物与周围骨边缘之间观察到骨连续性；原始骨腔内存在骨髓。在填充珊瑚支架的缺损区域，周围骨边缘与珊瑚支架之间可见新形成的骨组织，但支架内部骨组织较少。染色方法：Stevenel蓝与von Gieson苦味品红。在此染色条件下，骨、细胞和珊瑚分别呈红色、蓝色和棕色。比例尺 = 500 mm。ACS，珊瑚支架；BN，骨；BM，骨髓；FT，纤维组织。（经许可转载自 Tissue Eng Part C, 2013, 19(4), 271-280）请点击此处查看该图的放大版本。

在网格设置中进行空间导航实验研究的小鼠行为分析。
动画/视频图1：术后一天小鼠步态的代表性视频。可见完全负重。 请点击此处查看该视频。

讨论

在小鼠体内异位植入骨科相关材料和器械，常用于评估各种支架的成骨能力13,14。然而，异位模型与原位模型之间存在重要差异，包括天然成骨信号因子以及与宿主成骨细胞之间的旁分泌相互作用。

本研究建立了一种可重复的小鼠大段节性、临界尺寸股骨缺损模型（3.5 mm，约为股骨长度的20-25%）。鉴于该缺损的尺寸以及钢板内固定所提供的稳定性，此模型模拟了临床中常见的萎缩性骨不连情况。

本研究选择的术后时间段与先前报道的非愈合模型小鼠一致，显示在8至12周后缺乏充分的愈合4,9,15,16。

最重要的是，使用锁定钢板和截骨导向夹进行截骨术后，获得了可重复且稳定的骨固定效果，同时植入的骨替代材料也保持了稳定，且未出现明显的发病率和死亡率1,2。这一结果与使用外固定架或髓内钉所报道的结果形成对比4,5,17-24。外固定架可能存在的缺点包括：刚度变异、针道感染、针体松动、针体导致的潜在损伤以及材料重量（占小鼠体重的4%至20%）。髓内钉可能存在的缺点包括：钉体占据骨髓腔以及对关节面造成的医源性损伤。

已有文献报道，通过接骨板固定稳定的其他小鼠节段性股骨临界尺寸缺损模型，其骨缺损由磨钻制备，长度范围为1.5至2毫米16,25。在本模型中，通过使用导向夹具和钢丝锯，可精确实现3.5毫米长的骨切除，且不造成明显的肌肉损伤。

然而，要成功完成该操作，应注意以下几个关键点：不要使用体型过小的小鼠（裸鼠体重低于25 g或年龄小于8周），否则钢板会过长。在接近股骨时，应注意保护后侧的坐骨神经以及远端的关节囊。将钢板置于股骨的前侧，由于钢板的对齐由第一枚螺钉的置入位置决定，因此在插入第一枚螺钉时，应确保钢板与股骨平行。

在进行截骨前，需先在股骨干中段对股骨进行环形游离，以避免肌肉组织损伤。实施截骨时，手术助手必须牢固固定导向装置，术者须注意：（i）避免钢丝锯缠绕，（ii）使用钢丝的中段三分之二部分，并保持持续稳定的张力，（iii）避免过度移动，以获得平整的骨切面。

在当前模型中，只要使用骨移植物，骨愈合是可能的。此外，该模型还允许进一步研究在使用人源移植物或细胞时，针对标准化良好、大段节段性骨缺损的骨替代策略所涉及的机制。

此外，为顺应当前骨科相关研究中减少并优化动物使用的趋势，该模型可与 体内 生物发光等成像技术。此类非侵入性技术可在无需处死动物的情况下，实现对移植细胞存活情况和组织愈合过程的监测 26.

当前模型的主要局限性在于其承重条件以及所创建骨缺损的体积，因为这些因素未能完全模拟人类临床实践中遇到的情况。该模型的其他局限性包括：（i）接骨板的射线不透性，这可能需要在影像学检查前移除接骨板 离体 μCT 分析，可能使纵向放射学检查结果的解读复杂化；（ii）无法调节钢板的刚度，而刚度可能是骨形成中的一个关键力学参数27-30.

在使用骨同种异体移植物或含有矿物质成分（特别是碳酸钙）的其他支架材料时，还必须注意，由于新形成骨的密度与同种异体移植物或支架材料的密度在一定程度上重叠，这会在显微CT分析的分割过程中引入一定的偏差。因此，通过显微CT分析获得的骨体积主要反映的是矿化组织的总体积（即新形成骨与骨替代材料之和）11,26,31。

披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Rena Bizios 对手稿提出的宝贵意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-MEM，最小必需培养基EagleSigma-Aldrich, 法国M4526500 ml 
Acropora sp. 珊瑚外骨骼立方体，Biocoral®Biocoral®，Inoteb，法国3 × 3 × 3 mm 立方体，经高压灭菌（121 °C，20 分钟）消毒
布托啡诺，Buprecare®Axience，Pantin，法国0.3 mg/ml
赛拉嗪，Rompun® 2%Bayer HealthCare，Puteaux，法国20 mg/ml
氯胺酮，Ketamine 500®Virbac，Carros，法国50 mg/ml
异氟烷，Forène®Abbott，Arcueil，法国
恩诺沙星，Baytril® 5%Bayer HealthCare，Puteaux，法国50 mg/ml
戊巴比妥，Dolethal®Vétoquinol，Lure，法国182.2 mg/ml
麻醉箱Ugo Basile，Gemonio，意大利7900/10
透明塑料无菌铺巾，BusterOpCover 30 × 45 cmBuster，Coveto，Montagu，法国613867
10% 聚维酮碘，Vétédine® 溶液Vétoquinol，Lure，法国100 mg/ml
钛微锁定板，MouseFix Plate XLRISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/RIS.401.1206 孔，长 10 mm，宽 1.5 mm，高压灭菌（121 °C，20 分钟）或冷灭菌（环氧乙烷）
0.3 mm 钻头，Drill Bit 0.30 mmRISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/RIS.592.200高压灭菌（121 °C，20 分钟）或冷灭菌（环氧乙烷）
动力引擎RISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/AccuPen冷灭菌（环氧乙烷）
螺丝刀，HandrillRISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/RIS.390.130高压灭菌（121 °C，20 分钟）或冷灭菌（环氧乙烷）
自攻锁定螺钉，MouseFix Screw 2 mmRISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/RIS.401.100长 2 mm，外径 0.47 mm，芯径 0.34 mm，高压灭菌（121 °C，20 分钟）或冷灭菌（环氧乙烷）
定位夹具，MouseFix XL 钻孔和锯切导向器RISystem AG，达沃斯，瑞士，http://www.risystem.com/RIS.301.103槽间距 3.5 mm，高压灭菌（121 °C，20 分钟）或冷灭菌（环氧乙烷）
0.22 mm Gigli 锯（0.22 mm 锯）RISystem AG，达沃斯，瑞士
5.0 glycomer 631，BiosynCovidien，Vétoquinol，Lure，法国锥形切割针
4.0 glycomer 631，BiosynCovidien，Vétoquinol，Lure，法国锥形切割针
X 射线成像仪，MX20Faxitron X-ray Corp，Edimex，Le Plessis Grammorie
体内高分辨率显微计算机断层扫描，Skyscan 1176Skyscan，Aartselaar，比利时
体外高分辨率显微计算机断层扫描，Skyscan 1172Skyscan，Aartselaar，比利时
配套软件：Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4)Skyscan，Aartselaar，比利时

参考文献

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