使用导纳导管在小鼠中进行心脏压力-容积环分析

摘要

心脏压力-容积环分析是评估完整心脏功能的最全面方法。本文介绍了一种利用导纳导管进行心脏压力-容积环测量与分析的技术。

摘要

心脏压力-容积环分析是评估心室收缩与舒张功能中依赖负荷和独立于负荷指标的“金标准”。通过观察心脏对后负荷和前负荷变化的反应，可获得心室收缩力和顺应性的各项指标。这些技术最初是在近三十年前为在大型哺乳动物和人体中测量心脏功能而开发的。通过优化显微外科技术并研制出导电性导管，这些分析方法已成功应用于小动物（如小鼠）的研究。导电性导管利用电导与容积之间的关系，实现对血液容积的估算。若操作得当，这些技术可用于基因突变小鼠模型或药物干预研究中的心脏功能检测。此类研究的准确性与精确性取决于仪器校准、血流动力学测量及数据分析过程中的细致操作。本文将综述在小鼠中使用导电性导管进行压力-容积环实验的方法。

引言

心脏压力-容积环分析可提供心脏功能的详细信息，是功能评估的金标准 ¹尽管超声心动图或心脏磁共振成像等成像技术可提供心脏功能评估指标，但这些指标高度依赖于负荷条件。要获得与负荷无关的心脏收缩力和舒张功能评估，需在不同前负荷和后负荷条件下，动态测量心室压力与容积之间的关系。这种对压力-容积关系的理解源于Sagawa及其同事的开创性研究。 ^2,3他们证明了在 离体 灌注的犬心脏中，由压力-容积环导出的收缩力指标与负荷条件无关 ⁴.

体内应用这些分析方法随着20世纪80年代导纳导管的发展而成为可能。这一技术进步使得Kass及其同事能够在人体中进行压力-容积环分析^5,6。20世纪90年代末期，导纳导管的微型化以及外科技术的改进⁷使得啮齿类动物心脏功能的分析成为可能，从而推动了遗传学和药理学研究的开展。这一进步此后促进了压力-容积环分析的广泛应用，并极大地增进了对哺乳动物心脏生理学的理解。

使用导纳导管并解读其获取数据时的一个关键概念是容积与导纳之间的关系。导纳与电压呈反比关系，电压通过导管进行测量，该导管的电极通常近端置于主动脉瓣下方，远端置于左心室心尖部⁸。通过测量从近端电极流向远端电极的电流变化，可获得电压或导纳的变化。尽管血液腔室对导纳的贡献显著，但必须扣除心室壁所产生的导纳（称为并行导纳（V_p）），才能获得准确的左心室容积测量值。

执行此校正的方法称为生理盐水校准，下文方案中将对此进行讨论。Baan 及其同事描述的电导与容积之间的数学关系为：容积=1/α；(ρL²)(G-G_p)，其中 α 为均匀场校正因子，ρ 为血液电阻率，L 为电极之间的距离，G 为电导，G_p 为非血液电导⁹。值得注意的是，由于小鼠心腔容积较小，其均匀场校正因子接近于 1.0¹⁰。结合压力传感器，导管电导法可实时同步提供压力和容积数据。

心脏压力-容积分析相较于其他心脏功能评估方法具有特定优势，因其能够测量不受负荷条件和心率影响的心室功能。具体而言，不依赖于负荷的心肌收缩力指标包括：收缩末期压力-容积关系（ESPVR）、最大dP/dt_max–舒张末期容积关系、最大弹性（E_max）以及前负荷可募集的每搏功（PRSW）。评估舒张功能的非负荷依赖性指标为舒张末期压力-容积关系（EDPVR）¹¹。以下实验方案描述了采用颈动脉途径和心尖途径进行心脏压力-容积环分析的操作流程。尽管这些研究方法此前已有详细报道^8,11，本文将重点回顾获取精确压力-容积测量值的关键步骤，包括盐水和比色杯校准校正，并提供这些操作的可视化演示。本研究所涉及的动物实验均依照杜克大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准的方案及动物福利法规进行。

方案

1. 导管电导率准备与压力校准

1. 将导纳导管连接至血流动力学导管模块。通过记录导管模块上预设的压力和容积值，对压力和容积测量进行电子校准。记录0 mm Hg和25 mm Hg的压力曲线（图1A），并将电压分别分配给这两个压力曲线（图 1B和1C）。同样，记录5 RVU和25 RVU的容积曲线（图1D），并将电压分别分配给这两个容积曲线（图1E和1F）。
2. 使用水银柱血压计进行手动压力校准，以验证电子压力校准的准确性。将血压计的袖带接口连接三通旋塞。通过侧端口向通常用于冠状动脉成形术的三通止血阀系统中注入室温水。
   1. 将导纳导管的尖端插入充满液体的止血阀中，并小心固定，避免导管弯曲。将止血阀连接至血压计，充气至200 mmHg后锁定三通旋塞。检查所测得的压力是否与血压计上施加的压力一致。
3. 将导管置于加热至37 °C的生理盐水中，盐水液面应与手术操作平面齐平，测量压力。调节压力控制，直至记录的压力值为零。

2. 麻醉/插管

1. 以腹腔注射方式给予氯胺酮/赛拉嗪（80-100/10 mg kg^-1）。
   注意：可使用其他麻醉剂。有关该技术的既往综述中已提供详细的麻醉剂列表^11,12。可通过轻捏尾部确认是否达到适当麻醉状态。 
2. 动物麻醉后，使用电推剪剃除颈部和胸部毛发，并将其置于加热垫上。维持小鼠直肠温度在36.5–37.5 ºC之间。体温过低会导致心率下降。眼部涂抹眼膏以防止角膜干燥。
3. 沿颈部正中做切口，分离气管周围肌肉以暴露气管。在直视气管的情况下，经口腔插入气管插管，并连接呼吸机。
4. 手术过程中持续将小鼠连接于呼吸机。根据动物体重设定呼吸机参数，具体方法见既往文献描述¹¹。潮气量（ml）= 6.2 ×（动物体重，kg）^1.01，呼吸频率 = 53.5 ×（动物体重，kg）^-0.26。

3. 将导管放置于左心室腔内

1. 颈动脉入路
   1. 为确保无菌，使用两套无菌外科器械——一套用于初始皮肤切口，另一套用于开胸操作。在单次手术过程中，不同动物之间应使用干式灭菌器对器械进行去污处理，并在每日手术结束时进行高压蒸汽灭菌。
   2.  用氯己定+酒精皮肤擦洗液（0.5% 氯己定 / 70% 酒精溶液）对皮肤进行三次循环消毒后，沿右侧颈动脉从下颌至胸骨做一纵向切口。分离周围组织以暴露右侧颈动脉，并切断走行于颈动脉旁的迷走神经。
   3. 在颈动脉远端（远离胸部的一侧）放置一根无菌6-0丝线缝合线，打结并固定。在第一根缝合线近端（靠近胸部一侧）的颈动脉下方再放置两根额外缝合线，中间的缝合线先松松打结。轻轻牵拉近端缝合线，并用夹子将其固定于皮肤上。在继续操作前，确保颈动脉已在近端和远端均被夹闭。
   4. 在右侧颈动脉上、第一根缝合线近端处做一个小切口，并沿朝向胸部的方向纵向延长切口。
   5. 将预先在温盐水中浸泡30分钟的容积导纳导管尖端经切口插入血管，并用中间的缝合线固定导管。
   6. 在观察压力-容积环图形的同时，轻柔地将导管经颈动脉向前推进至左心室，以确保正确放置。
      注意：导管的最佳位置应产生呈矩形的压力-容积环（见图2）。若导管推进过程中遇到阻力，应轻柔回撤后再尝试轻柔推进。轻微旋转导管可能有助于其进入左心室。强行推进容积导纳导管可能导致严重的心血管并发症或导管损坏。
   7. 导管放置到位并达到稳态后约10分钟 ，记录基础压力-容积环（图2）。
2. 心尖入路
   1. 对麻醉并通气的小鼠，从剑突处做一切口，横向切开胸壁直至可见膈肌。
   2. 切开膈肌，暴露心脏心尖。
   3. 使用25–30 G针头在心尖处刺出小孔，将容积导纳导管经此穿刺口插入左心室，直至近端电极刚好进入心室内。
   4. 导管放置到位并达到稳态后约10分钟 ，记录基础压力-容积环。

4. 通过短暂主动脉阻断调节后负荷

1. 为进行短暂性主动脉阻断，需在胸部上部做一个小的横向切口，并分离周围组织以暴露横主动脉。
2. 将一根6-0丝线缝合线置于横主动脉下方。待压力-容积环恢复至基线后，用针持夹住缝线两端，轻柔缓慢地在1-2秒内提起缝线，随后缓慢释放张力。
3. 重复此操作，直至从同一动物获得三个独立的优质记录。
   注意：优质记录应包含至少5个压力-容积环周期，并在缝线施加张力过程中出现稳态升高的收缩末期压力（图3A和3C）。

5. 利用暂时性下腔静脉阻断（IVC）改变前负荷

1. 进行短暂下腔静脉阻断时，在剑突下方、膈肌下方做一横向切口，以暴露下腔静脉（IVC）。
2. 将一根6-0丝线置于下腔静脉下方。待压力-容积环恢复至基线后，用持针器夹住缝线两端；在1-2秒内轻柔缓慢地提起缝线，随后缓慢释放张力。也可使用棉签轻柔施压的方式实现下腔静脉阻断。
3. 重复此操作，直至同一动物获得三次独立的优质记录。
   注意：优质记录应包含至少5个压力-容积环周期，且在缝线施加张力过程中，左心室舒张末期压力呈现稳定下降趋势（图4A和4B）。

6. 盐水校准

1. 研究结束时，可通过颈静脉向动物注射 10 μl 高渗盐水（15%）来获得平行电导（V_p）值（图 5A 和 5B）。
   注意：该注射会导致表观容积增加而压力无变化。这种表观容积变化是由于血液电导率改变所致，而非实际容积增加。可观察到 dP/dt_max 出现短暂下降，因为高渗盐水具有负性肌力作用¹³。计算得到的 V_p 值可与比色杯校准参数一同输入压力-容积环分析软件，以将容积单位从相对容积单位（RVUs）转换为微升（μL）。

7. 比色皿校准

1. 进行比色皿校准时，将制造商提供的带有已知直径孔的比色皿置于预热至 37 ºC 的加热垫或水浴中。用正在接受血流动力学评估的小鼠的新鲜温热肝素化血液填充前 4–5 个孔。
   注意：比色皿校准可利用小鼠血液准确评估左心室血池，并实现将容积数据从 RVU 转换为微升（µL）。
2. 将导纳导管插入第一个孔中，直至所有电极完全浸没。轻轻移动孔中的导管，以产生不同的 RVU 值。
3. 记录容积通道中以 RVU 表示的导纳变化。选择最高的 RVU 值用于校准。
   注意：孔的容积可通过以下任一方法计算：1）使用圆柱体体积公式，其中半径为比色皿孔的半径，长度基于内侧两个感应电极之间的距离；或 2）查阅制造商说明书。通过将导纳输出与已知容积相关联，可建立校准方程，将数据从 RVU 转换为微升（µL）¹¹。

8. 安乐死

1.  实验方案结束时，在麻醉状态下通过颈椎脱臼法处死小鼠。
2.  为确保动物死亡，经颈椎脱臼处理的小鼠必须接受第二种辅助性安乐死方法。我们采用在麻醉下放血（同时采集心脏组织用于实验）或在麻醉下进行双侧开胸术。

9. 使用压力-容积环分析软件进行数据分析

1. 根据生理盐水校准计算 V_p
   1. 选择在注射高渗生理盐水期间获得的压力-容积环（图 5A 和 5B）
   2. 将环导出至压力-容积分析软件，并选择生理盐水校准选项（图 5C）
   3. 记录计算得到的 V_p 值（图 5D）。
      注意：V_p 值通过确定以下两条线的交点计算得出：1）生理盐水校准得到的舒张末期容积与收缩末期容积关系线；2）舒张末期容积等于收缩末期容积的直线。该交点即为 V_p，由压力-容积环分析软件自动计算。
2. 在容积通道选项中输入电导-容积（RVU）关系（图 1F）
3. 测量基线状态下的压力-容积环关系
   1. 在达到稳态后，从压力和容积通道中选取 8–10 个心动周期（图 2A），并导出至分析软件。识别 5–6 个呼气末期的压力-容积环（图 2B）
   2. 使用 V_p 值校正并联电导。选择“稳态”选项，并生成血流动力学汇总表（图 2C）
4. 测量主动脉缩窄期间的压力-容积环关系
   1. 在主动脉缩窄、但舒张末期压力尚未升高之前，从压力和容积通道中选取 8–10 个心动周期（图 3A），并导出至分析软件。识别 5–6 个呼气末期的压力-容积环（图 3C）
   2. 选择“收缩力”分析选项（图 3B），软件将据此计算收缩末期压力-容积关系（ESPVR）
5. 测量下腔静脉（IVC）缩窄期间的压力-容积环关系
   1. 在下腔静脉缩窄期间，从压力和容积通道中选取 8–10 个心动周期（图 4A），并导出至分析软件。识别 5–6 个呼气末期的压力-容积环（图 4B）
   2. 选择“收缩力”分析选项（图 3B），软件将计算前负荷可调节的每搏功（PRSW）（图 4C）、最大 dP/dt 与舒张末期容积（EDV）的关系（图 4D），以及收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（图 4E）

结果

压力-容积环分析可用于测定基因修饰小鼠的心脏功能 ^14,15 或接受药物研究的小鼠¹⁶来自先前已发表研究的代表性压力-容积环 ¹⁶ 研究β-阻遏蛋白偏向性AT1R配体TRV120023的作用。检测TRV120023是否影响心脏功能 体内 对接受传统和新型血管紧张素受体阻滞剂的野生型小鼠进行压力-容积环分析。静脉输注 TRV120023 显著增强了心肌收缩力（图6 和 表1，图示修改自 Kim 等 AJP 2012¹⁶）。收缩力指标由主动脉收缩得出。

图...

讨论

我们介绍一种在小鼠中使用导电性导管进行压力-容积环分析的方法，以全面评估心脏收缩力和舒张功能。Suga、Sagawa 及其同事利用压力-容积环定义了心脏收缩力的测量指标，特别是收缩末期压力-容积关系曲线的斜率，即收缩末期弹性（E_是）和 E_最大值弹性（Elastance）定义为压力与容积之比（P/V），在收缩期持续过程中发生变化。每次收缩期内，瞬时弹性取决于心率和心肌收缩力，而基本不受前负荷或后负荷的影响。 ^3,17因此，峰值弹性或E_最大值 用于定义心肌收缩力，该指标在很大程度上不受单个心动周期负荷条件的影响¹⁸. 一个密切相关的收缩性术语，E_是 由稳定状态下一系列心动周期中ESPVR的斜率定义。而E_es 在有限的载荷范围内呈线性_是 可以呈曲线形，且曲线形与收缩状态相关¹⁹.  E 增加_es 或 E_最大 表示收缩力增强，而降低则表示收缩力减弱。此外，除了 E_是 或 E<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿纳塞德（赛拉嗪）	劳埃德实验室	NADA 编号 139-236	麻醉剂
氯胺酮（Ketaset）	辉瑞	440842	麻醉剂
VIP3000	Matrx Medical Inc.		麻醉机
呼吸机	哈佛仪器	Model 683	外科手术器械
导管套件	哈佛仪器公司	72-1049	外科器械
恒温毯	Kaz Inc.	5628	外科手术器械
体视显微镜	卡尔·蔡司光学公司	Stemi 2000	外科手术器械
照明器	科尔–帕尔默	41720	外科器械
Dumont no. 55 Dumostar 镊子	Fine Science Tools 公司	11295-51	手术器械
格劳费钳，弯型	Fine Science Tools 公司	11052-10	手术器械
Moria MC31 镊子	Fine Science Tools 公司	11370-31	手术器械
梅奥剪刀	Fine Science Tools 公司	14512-15	手术器械
虹膜剪	Fine Science Tools 公司	14041-10	手术器械
哈尔西持针器	Fine Science Tools 公司	12501-13	外科手术器械
Olsen–赫加针持	Fine Science Tools 公司	12002-12	手术器械
弹簧剪	Fine Science Tools 公司	15610-08	手术器械
一次性护理垫	Kendall/Tyco Healthcare	1038	手术用品
无菌纱布垫，无菌	Dukal	62208	手术用品
无菌棉签	索隆	368	手术用品
外科缝合线  丝线，6-0	DemeTECH	FT-639-1	外科手术用品
1 cc 胰岛素注射器	Becton Dickinson	329412	手术用品
接入9通止血阀	Merit Medical	MAP111	血流动力学设备
血压计	Baumanometer	320	血流动力学设备
Millar PV 系统 MPVS-300/400 或 MPVS Ultra（包含校准比色皿）	ADInstruments 公司		血流动力学设备
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PowerLab 4/30 配 Chart Pro	ADInstruments 公司	ML866/P	血流动力学软件
动物毛发修剪器	Wahl	8787-450A	其他
皮内导管 PE-10	Becton Dickinson	427401	其他
皮内导管 PE-50	Becton Dickinson	427411	其他
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0.9%（wt/vol）氯化钠注射液，USP	Hospira	NDC 编号：0409-4888-50	其他
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