简单和计算机辅助测试嗅觉的小鼠

Summary

我们在小鼠中提出了一种简单且无偏见的嗅觉测试。通过该方案，可以在单次行为会话中评估嗅觉辨别、偏好、回避和对新气味的敏感性。该方法适用于单个实验者，分析基于计算机辅助视频处理。

Abstract

嗅觉是高度保守性和所需的繁殖和生存。

在人类中，嗅觉也是受到影响与老化的感官之一，是神经退行性疾病的一个强有力的预测。因此，嗅觉测试是用来作为一种非创伤性诊断方法用于检测早期神经功能障碍。为了了解底层网络的嗅觉敏感性的机制，嗅觉研究啮齿动物已经获得的势头在过去的十年。

在这里，我们提出了一个非常简单的，时间效率和可重复的测试嗅觉与生俱来的感知气味的敏感性和小鼠的方法没有任何事先的食物或水限制的需要。所述测试是在一熟悉的环境中进行的小鼠，仅需要的气味和臭气物质的暴露2分钟会话。进行分析， 事后 ，使用上的ImageJ计算机辅助命令并且可以是，因此，开展从头至尾由一研究员结束。

该协议不需要任何特殊的硬件或设置并标明为有兴趣测试嗅觉的感知和灵敏度任何实验室。

Introduction

嗅觉是在哺乳动物中最不发达国家和重要的感觉功能之一。在嗅觉活性的任何损害可能影响食物摄取，社会行为和，在最坏的情况下，甚至存活。在人类中，嗅觉恶化是年龄依赖性^1，被认为是神经系统疾病²的强预测^{- 6。}由宾夕法尼亚大学开发的嗅觉鉴定试验目前代表了最常用的，非侵入性，可量化，诊断测试，可以评估早期神经功能缺损⁷和高概率预测老年痴呆症^8,9的进展之一。

嗅觉系统和嗅觉的啮齿动物中突出的可访问性，引发了人们研究的一个强烈的线条解决机制基础嗅觉功能^10。我们以前曾表明的信令RECEPT的功能丧失或Notch1的影响嗅觉回避^11。在这个协议中，我们使用缺乏信号配体，小鼠Jagged1的，在神经元或神经胶质细胞来研究嗅觉的性能。

先天嗅觉是由三个参数作为感知，气味和嗅觉灵敏度⁴区分限定。嗅觉测试在啮齿类动物可以以多种方式来完成，一些行为研究利用olfactometers，它提供气味给动物在特定的蒸气浓度和在一精确的时间框架^{12 - 14。}尽管如此，这种仪器是昂贵的，可能只在专门的设施是可用的。在我们的工作中，我们提供了一个简单，快速，可重复的测试嗅觉的协议，这是使用挥发性气味。测试说明措施的看法，以引诱或驱蚊气味和评估的气味和水^11,15,16之间的歧视。使用相同的设置，瓦特E也可以测量不同浓度^16,17的灵敏度的气味。在事后计算机辅助视频处理，灵感来自页和他的同事¹⁸的工作，提供公正的结果，而实验致盲，并允许单人进行整个实验的需要。

该协议的目的是为研究小鼠嗅觉行为提供一个起始点。

Protocol

所有动物的程序是按照在用于科学目的的动物的保护与欧盟指令六十三分之二千○一十/欧盟和由当地动物保健委员会（广弗里堡，瑞士）的批准。

1.动物的制备

1. 实验动物
   1. 执行对成年雄性野生型和3-5个月的婴儿转基因小鼠（C57BL / 6背景）的实验。三组小鼠的对应的野生型同窝对照组（A组，Jagged1处理FLOX / FLOX ^19）和两个条件KO小鼠系（B组，Jagged1ncKO和C，Jagged1gcKO）。
   2. 家鼠标准实验室条件在通风的房间下，具有12小时控制黑暗/光照周期，并提供食物和水自由采食 。

2.实验装置

1. 实验舞台
   1. 对于实验的舞台，用干净的消毒鼠笼（36厘米长×20.5厘米宽×13.5厘米高度）（ 图1A）。
   2. 将每个鼠标编号的笼子里新鲜的床上用品3厘米高。如果笼重用，如气味敏感试验，采取以下措施，以避免气味和老鼠之间的交叉污染。
      1. 马克在水一方。
      2. 清洁笼子的窄壁，用70％的乙醇，一为每侧的两个薄棉纸。
      3. 根据小鼠的基因型堆积笼和在层罩暂时储存。
2. 相机
   1. 安装一个摄像头定制鼎在58厘米的笼（ 图1A）底部的目标。固定三脚架和笼子的位置，并用标记分隔，以便相机上笼的顶部居中。
   2. 记录视频在320像素×240像素，每秒15.08帧作为MOV文件。
3. 气味
   1. 悬浮风光TS，时所指出的，在溶剂中，它们是可溶的。
   2. 对于偏好测试使用的花生酱。悬浮在花生油花生酱（10％重量/体积）。
   3. 为了避免测试使用纯2-甲基（2-MB）酸（98％）。
   4. 用于敏感性试验中，使用雌性尿液从同一小鼠菌落和背景（C57BL / 6）。
      1. 为了方便前1-2天收集尿液嗅觉测试。抑制并按住鼠标与它的肚子笼网格上方的引擎盖下。下的笼格放置一个塑料培养皿收集尿液的下降。
      2. 从在1.5ml管每个女性收集尿和混合所有尿样正常化动物间变异。储存在-20℃直到使用。
      3. 在实验的当天，解冻的尿，并执行4稀释在双蒸水以10:1的稀释因子（1:10，1:100; 1:1000 1:10,000）。

3.嗅觉测试

注:在这个协议中的气味已经有意选择这被认为是强有力的引诱（花生酱和女性尿液）或强驱蚊（2-MB酸^）15。它之前进行的优先级和敏感性测试，以愉快的气味，以避免测试，以消除与嗅觉行为的任何干扰的可能性是非常重要的。然而，为简单起见，在本文中，偏好和回避试验将二者下的感知试验说明。每个行为会话开始于一个习惯阶段。

1. 习惯相
   1. 将动物在清洁分配笼并让它探索5分钟（ 图1B）。由于实验笼子里的环境是熟悉的家笼，这么短的时间就足以允许习惯。
   2. 如果灵敏度测试在一天内完成，应用A之前执行习惯只有一次n中的最高稀释气味。如果灵敏度进行试验在不同的日子，在每一天，需要在一个新的干净笼子一个习惯相。
2. 感知测试
   1. 习惯后，启动相机，并立即吸取60微升愉快的气味（花生酱）和60微升中性气味（自来水）的上保持器的相对壁以约10厘米的底部（ 图1C）。
   2. 让鼠标探索气味​​2分钟（ 图1D）。此后，关闭摄像头。
   3. 此时，继续进行从习惯相下一小鼠开始。通过施加60微升斥气味的（2 MB乙酸）和60微升水恰好执行回避试验中的方法相同。
3. 药敏试验
   1. 评估雄性小鼠的吸引力阈增加以下顺序女性尿液浓度:1:10,000; 1:1000; 1:100; 1:10和纯尿。
   2. 习惯之后，暴露每只小鼠为先前在3.2.1描述的实验者吸管的最高稀释。
   3. 记录的尿与水的探索行为，在摄像​​机2分钟的时间范围内。之后所有小鼠队列被测试的最高稀释度（1:10,000），暴露于尿液浓度较高时，如上面所指出的。

4.事后的数据分析

注意:所述的所有行为试验在处理事后以下的数据分析的指令。

1. 在ImageJ的打开MOV文件为Windows系统
   1. 使用自定义设置从http://www.apple.com/quicktime/download安装快速的时间为Java。
   2. 安装快速的时间插件从ImageJ的网站（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html）。
   3. 进口QTJava.zip（C: Program Files文件 QuickTime的 QTSystem）到库EXTENSImageJ的离子（.ImageJ JRE lib目录分机）。
   4. 副本也将在QTJava.zip插件文件夹并将其重命名为QTJava.jar。
   5. 安装附加的宏文件夹中的六个脚本（ImageJ的插件宏）。
   6. 打开ImageJ的编译和运行快速时间插件，随后关闭ImageJ的。
   7. 重新打开ImageJ的使用文件>导入打开文件MOV>使用快速的时间。
2. 视频调整
   1. 一旦视频文件中的ImageJ打开，以便获得恒定的2分钟的探索从时间实验者已经吸的气味物质入笼（T0）剪切视频。识别对应于T 0的帧，并删除利用增量为1（ImageJ的图片堆栈 ToolsSlice剂）的先前帧。使用相同的命令删除所有超过2分钟的探索帧。
   2. 确保笼中心并在必要时使用图像>变换>旋转命令对齐。
3. 韦迪o处理
   注:视频处理是完全计算机辅助并使用附带本文宏命令。
   1. 为了在区域限制到一个127像素×218像素大小的笼子里运行插件>宏>运行命令第1步宏。移动固定矩形在笼（ 图2，步骤1）。
   2. 作物上的感兴趣区（ROI）的区域中的保持器的使用步骤2宏（ 图2，步骤2）的面积。
   3. 使用步骤3宏通过分配阈值信号，去除斑点和过滤该信号方差来提取从背景的小鼠图像。在Z轴情节的输出值表示的平均灰度值，对应于鼠标阴影的2分钟的探索过程中的"水室"的ROI中移动的强度。将结果复制到根据在一个电子表格文件在ROI（ 图2，步骤3）命名表。
   4. 使用第4步宏在ROI"气味室"提取鼠标的平均灰度值。将结果复制到根据在ROI中的相同的电子表格文件，如4.3.3（ 图2，步骤4）命名表。
   5. 为了进一步限制了投资回报率"水周"鼠标移动的分析，使用步骤5宏。结果复制到按投资回报率在同一个电子表格文件中4.3.3（ 图2，第5步）命名工作表。
   6. 要限制在投资回报率"气味外围"鼠标移动的分析使用步骤6宏。结果复制到根据ROI的电子表格文件，如4.3.3（ 图2，步骤6）命名的工作表。
   7. 过程中的所有视频和检查一致性每动物的帧数。这里，记录所有动物对于对应于一个2分钟的探索会话1,810帧。
   8. 对于每一个动物，并为每个投资回报率，平均灰色VA帧排序梅毒大于0除以相应帧由值的数量为1秒，将获得在每个ROI所经过的秒数。

5.统计分析

1. 对于每个测试使用的http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/可用公式由巴特利特的试验验证组/基因型内方差齐性。
2. 在吸引和回避试验，进行比较之间用水对气味的时间花费在一个组内使用一个非定向学生t检验，假设根据巴特利特的试验的结果相等或不等方差。比较用减去花费与水的基因型之间通过单向ANOVA和Bonferroni的事后检验时的气味所花费的时间。
3. 在敏感性试验分析与来自时间中减去所述气味所花费的时间与水:花的比较在尿特定稀释液通过单向ANOVA和Bonferroni的事后测试组间河2路ANOVA和重复使用邦费罗尼的事后检验比较各组之间不断增长的气味浓度的敏感性。
4. 基因型和治疗中的吸引和回避试验之间的相互作用是由双因子ANOVA调查和Bonferroni的事后检验。

Results

感知试验测量的吸引力的花生酱和回避到2 MB酸。三组小鼠进行试验，并作为与水相比，在"气味周长"所花费的时间被量化。在偏好的测试，相比于水（T ₈ = 2.52，P <0.05）对照组显示显著偏好的气味。另一方面，B组不显示任何显著吸引力的花生酱和花费更多的时间以水（叔₆ = 3.22，P <0.05）。因此，它的行为不同于对照组（F = _1,7 26.39，P <0.005）。此外，C组显示无歧视，花费大约在同一时间与水和花生酱（T ₈ = 0.78，P = 0.45）。总体上，三组不同的表现（F = _2,9 19.83，P <0.005），有基因型与治疗（花生酱和水）之间的相互作用显著（F = _2,1 4.90，P <0.005） （

响应于2 MB酸的对照组显示一个回避反应，结果花费更多的时间以水（叔₈ = 2.67，P <0.05）。同样，B组显示了明显的回避反应到2 MB酸（T

Discussion

在这个协议中提出的测试能够评估天生的嗅觉行为的小鼠不同方面:感知气味，气味与水和对气味敏感的歧视。这个协议可以根据先前显示¹⁵的偏爱和避免规模应用于任何气味。由于该协议是基于探索行动的小鼠不显示任何运动障碍或焦虑可能影响其运动并干扰嗅觉勘探是很重要的。所描述的试验是为了对成年雄性小鼠但是它们可以适于还调查嗅觉在成年女性或老年小鼠。

1）至少3天的间隔进行每个测试:在老鼠开始这样的研究调查嗅觉之前，要注意以下几个方面是很重要的。应避免被测试的最后，以尽量减少嗅觉记忆²⁰干扰; 2）进行电子xperiments在一天的同一时间，最好是在下午晚些时候，当小鼠在它们的活性周期²¹和使用的光的减光源。此外，调度的嗅觉测试在定义的时间控制在嗅觉功能²²可以昼夜变化; 3）开始回避测试，使用驱蚊气味物质，如酸之前，在实验套房带一个笼子里的时候，并保持在层流罩笼。这个步骤是重要的，以避免习惯的加臭剂，将获得在同一组的更均匀的响应; 4）暂时分离出已经过测试，直到同笼的所有小鼠暴露于加臭剂，以减少臭气物质污染的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
鼠笼	Italplast （意大利）	1144B	36 厘米长 x 20.5 厘米宽 x 13.5 厘米高
碎木床上用品	Abedd （奥地利）	LTE E-001	3 厘米高
花生酱	Migros （瑞士）NA		1：10
2-甲基丁酸	Sigma Aldrich （瑞士）	W269514
来自相同小鼠品系的可育雌性纯雌性尿液	NA	NA	稀释系列
相机	奥林巴斯 （美国）	Camedia C-8080	MOV 文件
Quicktime for Java （Windows）	Apple （美国）	NA	视频插件，用于可视化 MOV 文件
ImageJ for Windows	NIH （美国）	NA	视频处理/分析