小鼠简易及计算机辅助嗅觉检测

摘要

我们介绍一种在小鼠中进行的简单且无偏倚的嗅觉测试。通过该方案，可在单次行为学实验中评估小鼠对新气味与水相比的嗅觉辨别能力、偏好性、回避行为及敏感性。该方法适用于单名实验者操作，数据分析基于计算机辅助的视频处理。

摘要

嗅觉在不同物种间高度保守，对繁殖和生存至关重要。

在人类中，嗅觉也是随衰老而受到影响的一种感觉，且是神经退行性疾病的一个强有力预测指标。因此，嗅觉检测被用作一种非侵入性诊断方法，以早期发现神经功能缺损。为了理解嗅觉网络易损性的潜在机制，过去十年中，啮齿类动物的嗅觉研究进展迅速。

本文介绍一种非常简单、省时且可重复的小鼠先天性气味感知与敏感性检测方法，无需事先进行任何食物或饮水限制。测试在小鼠熟悉的环境中进行，仅需气味刺激物和2分钟的气味暴露时间。分析通过在ImageJ软件中使用计算机辅助命令进行事后（post-hoc）处理，因此整个流程可由一名研究人员独立完成。

本方案无需任何特殊硬件或设置，适用于任何对测试嗅觉感知和敏感性感兴趣的实验室。

引言

嗅觉是哺乳动物最发达且最重要的感觉功能之一。嗅觉功能的任何损伤都可能影响摄食行为、社会行为，甚至在最严重的情况下影响生存。在人类中，嗅觉功能衰退具有年龄依赖性¹，并被认为是神经系统疾病的一个强有力预测指标^2–6。由宾夕法尼亚大学开发的嗅觉识别测试目前被认为是最常用、无创且可量化的诊断方法之一，可用于评估早期神经功能缺陷⁷，并以高概率预测痴呆的进展^8,9。

嗅觉系统的可及性以及嗅觉在啮齿类动物中的显著作用，激发了大量关于嗅觉功能机制的研究¹⁰。我们先前已证实，信号受体 Notch1 的功能缺失会影响嗅觉回避行为¹¹。在本实验方案中，我们使用神经元或胶质细胞中缺失信号配体 Jagged1 的小鼠来研究其嗅觉功能表现。

先天嗅觉由三个参数定义：气味感知、气味间的辨别能力以及嗅觉敏感度⁴。在啮齿类动物中进行嗅觉测试有多种方法，一些行为学研究使用嗅觉仪，该仪器可在精确的时间范围内以特定的蒸气浓度向动物呈现气味刺激^12–14。然而，此类设备价格昂贵，可能仅在专业实验设施中才可获得。在本研究中，我们提供了一种简单、快速且可重复的嗅觉测试方案，该方案使用挥发性气味完成。所描述的测试可测量动物对吸引性或排斥性气味的感知能力，并评估其对气味与水之间的辨别能力^11,15,16。利用相同的实验装置，我们还可测量动物在不同浓度下对气味的敏感度^16,17。受Page及其同事工作¹⁸启发的事后计算机辅助视频分析，能够在无需实验设盲的情况下提供无偏倚的结果，并允许由单人完成整个实验操作。

本方案旨在为研究小鼠嗅觉行为提供一个起点。

方案

所有动物实验程序均符合欧盟关于用于科研目的动物保护的指令 2010/63/EU，并已获得当地动物护理委员会（瑞士弗里堡州）的批准。

1. 动物准备

1. 实验动物
   1. 对3-5月龄的成年雄性野生型及转基因小鼠（C57BL/6背景）进行实验。小鼠分为三组：野生型同窝对照组（A组，Jagged1 flox/flox）、¹⁹以及两个条件性基因敲除小鼠品系（B组，Jagged1ncKO 和 C组，Jagged1gcKO）。
   2. 在通风良好的房间内，对家鼠进行标准实验室条件饲养，保持12小时光照/12小时黑暗的可控光周期，并提供食物和饮水 随意摄取.

2. 实验设置

1. 实验场所
   1. 使用一个洁净且经过灭菌处理的小鼠笼（36 cm 长 × 20.5 cm 宽 × 13.5 cm 高）作为实验场所（图1A）。
   2. 将每只小鼠分配至一个编号的笼子中，垫料为新鲜垫料，高度为3 cm。若笼子需重复使用（如在气味敏感性测试中），应采取以下措施以避免气味和小鼠之间的交叉污染。
      1. 标记加水侧。
      2. 使用两张喷有70%乙醇的擦拭纸清洁笼子的窄边墙壁，每侧各用一张。
      3. 根据小鼠的基因型对笼子进行分类堆放，并暂时存放于超净工作台下。
2. 摄像机
   1. 将摄像机安装在定制的三脚架上，使镜头距离笼底58 cm（图1A）。固定三脚架和笼子的位置，并用标记划定范围，以确保摄像机能准确对准笼子正上方中心。
   2. 以320像素 × 240像素、每秒15.08帧的速度录制视频，保存为MOV文件。
3. 气味物质
   1. 根据需要，将气味物质溶解于其可溶的溶剂中重新悬浮。
   2. 在偏好测试中使用花生酱。将花生酱用花生油重新悬浮（10% w/v）。
   3. 在回避测试中使用纯2-甲基丁酸（2-MB）（98%）。
   4. 在敏感性测试中，使用来自同一小鼠品系和背景（C57BL/6）的雌性小鼠尿液。
      1. 为方便起见，可在嗅觉测试前1-2天收集尿液。在通风橱内固定并握住小鼠，使其腹部位于笼格上方，在笼格下方放置一个塑料培养皿以收集尿滴。
      2. 将每只雌鼠的尿液收集至1.5 ml离心管中，并将所有尿液样本混合，以消除个体间差异。收集后储存于-20 °C，直至使用。
      3. 实验当天，将尿液解冻，并用双蒸水进行4个梯度稀释，稀释倍数为10倍递增（1:10、1:100、1:1,000、1:10,000）。

3. 嗅觉测试

注意：本实验方案中特意选择了被感知为强吸引性（花生酱和雌性尿液）或强驱避性（2-MB酸）的气味¹⁵。为避免对嗅觉行为产生干扰，必须在进行回避测试之前先完成对愉悦气味的偏好性和敏感性测试。然而，为简化描述，本文将偏好测试和回避测试均归入感知测试部分进行说明。每次行为学实验均以适应阶段开始。

1. 适应阶段
   1. 将动物放入清洁的指定笼子中，让其探索5分钟（图1B）。由于实验笼的环境与动物的居住笼环境相似，这一短暂时间足以完成适应过程。
   2. 如果敏感性测试在一天内完成，则仅在施加最高稀释度气味前进行一次适应阶段。如果敏感性测试在不同日期进行，则每天均需在新的清洁笼子中进行一次适应阶段。
2. 感知测试
   1. 适应后，启动摄像机，并立即用移液器将60 μl的愉悦气味（花生酱）和60 μl的中性气味（自来水）分别滴加到笼子相对的两侧内壁，距底部约10 cm处（图1C）。
   2. 让小鼠探索气味2分钟（图1D），之后关闭摄像机。
   3. 此时，从下一小鼠开始重复上述操作，从适应阶段起始。回避测试以完全相同的方式进行，施加60 μl的厌恶气味（2-MB酸）和60 μl的水。
3. 敏感性测试
   1. 按以下顺序评估雄性小鼠对雌性尿液浓度递增的吸引阈值：1:10,000；1:1,000；1:100；1:10 及纯尿液。
   2. 适应后，将每只小鼠暴露于实验者如前所述（3.2.1节）移液的最高稀释度气味。
   3. 在2分钟的时间范围内，用摄像机记录小鼠对尿液与水的探索行为。当所有小鼠组别均完成最高稀释度（1:10,000）测试后，再依次暴露于更高浓度的尿液，顺序如上所述。

4. 事后数据分析

注意：所描述的全部行为学实验均经过处理 事后检验 按照数据分析说明进行。

1. 在 Windows 系统中使用 ImageJ 打开 MOV 文件
   1. 从 http://www.apple.com/quicktime/download 下载并使用自定义设置安装适用于 Java 的 QuickTime。
   2. 从 ImageJ 网站（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html）安装 QuickTime 插件。
   3. 将 QTJava.zip 文件（路径：C:\Program Files\QuickTime\QTSystem）导入 ImageJ 的库扩展目录中（.ImageJ\jre\lib\ext）。
   4. 同时将 QTJava.zip 复制到插件文件夹中，并将其重命名为 QTJava.jar。
   5. 将附带的六个脚本安装到宏文件夹中（ImageJ\plugins\Macros）。
   6. 启动 ImageJ，编译并运行 QuickTime 插件，然后关闭 ImageJ。
   7. 重新打开 ImageJ，使用“文件>导入>使用 QuickTime”命令打开 MOV 文件。
2. 视频调整
   1. 在 ImageJ 中打开视频文件后，对视频进行裁剪，以从实验人员将气味物质加入笼中（T0）的时间点起，截取持续 2 分钟的探索阶段。确定对应于 T0 的帧，并使用增量为 1 的方式删除其之前的帧（ImageJ\Image\Stacks\Tools\Slice Remover）。使用相同命令删除超过 2 分钟探索时间的所有后续帧。
   2. 确保笼子位于画面中央，如有需要，使用“图像>变换>旋转”命令进行对齐。
3. 视频处理
   注意：视频处理完全由计算机辅助完成，并使用随本文提供的宏命令。
   1. 为将分析区域限制为大小为 127 像素 × 218 像素的笼区，从“插件>宏>运行”命令中运行“步骤 1”宏。将固定矩形移动至笼子上方（图 2，步骤 1）。
   2. 使用“步骤 2”宏，对感兴趣区域（ROI）中的笼区进行裁剪（图 2，步骤 2）。
   3. 使用“步骤 3”宏，通过设定阈值信号、去斑点及滤除信号方差，从背景中提取小鼠图像。Z 轴图中的输出值表示平均灰度值，对应于在 2 分钟探索期间，小鼠影子在“水室”感兴趣区域（ROI）内移动时的强度变化。将结果复制到电子表格文件中一个以该 ROI 命名的工作表中（图 2，步骤 3）。
   4. 使用“步骤 4”宏提取小鼠在 ROI“气味室”中的平均灰度值。将结果复制到与 4.3.3 节相同的电子表格文件中，工作表名称根据该 ROI 命名（图 2，步骤 4）。
   5. 为进一步限制对 ROI“水室边缘”中小鼠运动的分析，使用“步骤 5”宏。将结果复制到与 4.3.3 节相同的电子表格文件中，工作表名称根据该 ROI 命名（图 2，步骤 5）。
   6. 为限制对 ROI“气味室边缘”中小鼠运动的分析，使用“步骤 6”宏。将结果复制到与 4.3.3 节相同的电子表格文件中，工作表名称根据该 ROI 命名（图 2，步骤 6）。
   7. 处理所有视频，并检查每只动物的帧数是否一致。本实验中，每只动物记录 1,810 帧，对应 2 分钟的探索时长。
   8. 对每只动物及每个 ROI，筛选出平均灰度值大于 0 的帧数。将帧数除以每秒对应的帧数值，得到每只动物在各 ROI 中停留的秒数。

5. 统计学分析

1. 对每次测试，使用 http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ 提供的公式，通过 Bartlett 检验验证各组/基因型内方差的齐性。
2. 在趋近与回避实验中，使用非定向的 Student t 检验对同一组内动物在水相与气味相所用时间进行比较；方差齐性根据 Bartlett 检验结果判断，据此选择假设方差相等或不相等的 t 检验方法。通过单因素方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 校正，比较不同基因型间动物在气味相停留时间减去水相停留时间的差值。 事后 测试。
3. 在敏感性测试中，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Bonferroni法，比较各组在特定尿液稀释度下，接触气味时间减去接触水时间的差值。 事后 测试。通过双因素重复测量方差分析（Two-Way ANOVA）结合Bonferroni法比较各组对逐渐增加的气味浓度的敏感性。 事后 测试。
4. 通过双因素方差分析（Bonferroni法）研究基因型与处理因素在趋性与回避实验中的交互作用 事后 测试。

结果

感知测试用于测量对花生酱的趋向性以及对2-MB酸的回避行为。对三组小鼠进行测试，量化其在“气味区域”停留的时间，并与水进行比较。在偏好测试中，对照组A对气味的偏好显著高于水（t₈ = 2.52，p <0.05）。另一方面，B组对花生酱没有表现出显著的趋向性，且在水中停留的时间更长（t₆ = 3.22，p <0.05）。因此，其行为与对照组A存在显著差异（F_1,7 = 26.39，p <0.005）。此外，C组未表现出明显的选择性，在水和花生酱附近停留的时间大致相同（t₈ = 0.78，p = 0.45）。总体而言，三组小鼠的行为存在显著差异（F_2,9 = 19.83，p <0.005），且基因型与处理（花生酱与水）之间存在显著交互作用（F_2,1 = 4.90，p <0.005）（图3A）。

对照组对2-MB酸表现出回避反射，因此在水中停留的时间更长（t₈ = 2.67...

讨论

本方案中提出的实验可用于评估小鼠先天嗅觉行为的不同方面：对气味的感知、区分气味与水的能力以及对气味的敏感性。该方案可适用于任何气味，具体取决于先前所示的偏好与回避等级¹⁵。由于本方案基于探索性活动，因此重要的是小鼠不应存在任何运动功能障碍或焦虑状态，以免影响其活动能力并干扰嗅觉探索。所述实验旨在用于成年雄性小鼠，但也可进行调整，以用于研究成年雌性小鼠或老年小鼠的嗅觉功能。

在开始研究小鼠嗅觉的实验之前，需注意以下几点：1）每次测试之间应至少间隔3天。为尽量减少嗅觉记忆的干扰，应将回避测试安排在最后进行²⁰；2）实验应在每天的同一时间进行，最好在傍晚，此时小鼠处于活跃周期²¹，并使用弱光源照明。此外，在固定时间安排嗅觉测试可控制嗅觉功能可能存在的昼夜节律变化²²；3）在开始使用驱避性气味物质（如酸类）的回避测试前，每次仅将一个笼子的小鼠带入实验区域，并将其置于超净台下。此步骤对于避免小鼠对气味物质产生习惯化、从而获得同组内更均一的反应至关重要；4）在完成测试前，应将已测试的小鼠暂时隔离，直至同一笼...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠笼具	Italplast (意大利)	1144B	长 36 cm × 宽 20.5 cm × 高 13.5 cm
木屑垫料	Abedd (奥地利)	LTE E-001	高度 3 cm
花生酱	Migros (瑞士)	NA	1:10 稀释
2-甲基丁酸	Sigma Aldrich (瑞士)	W269514	纯品
同品系健康雌性小鼠的尿液	NA	NA	系列稀释
相机	Olympus (美国)	Camedia C-8080	MOV 文件格式
适用于 Windows 的 Quicktime for Java	Apple (美国)	NA	用于播放 MOV 视频文件的插件
适用于 Windows 的 ImageJ	NIH (美国)	NA	视频处理/分析