小鼠简易及计算机辅助嗅觉检测

摘要

我们介绍一种在小鼠中进行的简单且无偏倚的嗅觉测试。通过该方案，可在单次行为学实验中评估小鼠对新气味与水相比的嗅觉辨别能力、偏好性、回避行为及敏感性。该方法适用于单名实验者操作，数据分析基于计算机辅助的视频处理。

摘要

嗅觉在不同物种间高度保守，对繁殖和生存至关重要。

在人类中，嗅觉也是随衰老而受到影响的一种感觉，且是神经退行性疾病的一个强有力预测指标。因此，嗅觉检测被用作一种非侵入性诊断方法，以早期发现神经功能缺损。为了理解嗅觉网络易损性的潜在机制，过去十年中，啮齿类动物的嗅觉研究进展迅速。

本文介绍一种非常简单、省时且可重复的小鼠先天性气味感知与敏感性检测方法，无需事先进行任何食物或饮水限制。测试在小鼠熟悉的环境中进行，仅需气味刺激物和2分钟的气味暴露时间。分析通过在ImageJ软件中使用计算机辅助命令进行事后（post-hoc）处理，因此整个流程可由一名研究人员独立完成。

本方案无需任何特殊硬件或设置，适用于任何对测试嗅觉感知和敏感性感兴趣的实验室。

引言

嗅觉是哺乳动物最发达且最重要的感觉功能之一。嗅觉功能的任何损伤都可能影响摄食行为、社会行为，甚至在最严重的情况下影响生存。在人类中，嗅觉功能衰退具有年龄依赖性¹，并被认为是神经系统疾病的一个强有力预测指标^2–6。由宾夕法尼亚大学开发的嗅觉识别测试目前被认为是最常用、无创且可量化的诊断方法之一，可用于评估早期神经功能缺陷⁷，并以高概率预测痴呆的进展^8,9。

嗅觉系统的可及性以及嗅觉在啮齿类动物中的显著作用，激发了大量关于嗅觉功能机制的研究¹⁰。我们先前已证实，信号受体 Notch1 的功能缺失会影响嗅觉回避行为¹¹。在本实验方案中，我们使用神经元或胶质细胞中缺失信号配体 Jagged1 的小鼠来研究其嗅觉功能表现。

先天嗅觉由三个参数定义：气味感知、气味间的辨别能力以及嗅觉敏感度⁴。在啮齿类动物中进行嗅觉测试有多种方法，一些行为学研究使用嗅觉仪，该仪器可在精确的时间范围内以特定的蒸气浓度向动物呈现气味刺激^12–14。然而，此类设备价格昂贵，可能仅在专业实验设施中才可获得。在本研究中，我们提供了一种简单、快速且可重复的嗅觉测试方案，该方案使用挥发性气味完成。所描述的....

方案

所有动物实验程序均符合欧盟关于用于科研目的动物保护的指令 2010/63/EU，并已获得当地动物护理委员会（瑞士弗里堡州）的批准。

1. 动物准备

1. 实验动物
   1. 对3-5月龄的成年雄性野生型及转基因小鼠（C57BL/6背景）进行实验。小鼠分为三组：野生型同窝对照组（A组，Jagged1 flox/flox）、¹⁹以及两个条件性基因敲除小鼠品系（B组，Jagged1ncKO 和 C组，Jagged1gcKO）。
   2. 在通风良好的房间内，对家鼠进行标准实验室条件饲养，保持12小时光照/12小时黑暗的可控光周期，并提供食物和饮水 随意摄取.

2. 实验设置

1. 实验场所
   1. 使用一个洁净且经过灭菌处理的小鼠笼（36 cm 长 × 20.5 cm 宽 × 13.5 cm 高）作为实验场所（图1A）。
   2. 将每只小鼠分配至一个编号的笼子中，垫料为新鲜垫料，高度为3 cm。若笼子需重复使用（如在气味敏感性测试中），应采取以下措施以避免气味和小鼠之间的交叉污染。
      1. 标记加水侧。
      2. 使用两张喷有70%乙醇的擦拭纸清洁笼子的窄边墙壁，每侧各用一张。
      ....

结果

感知测试用于测量对花生酱的趋向性以及对2-MB酸的回避行为。测试三组小鼠，并量化其在“气味区域”停留的时间，与水进行比较。在偏好测试中，对照组A对气味的偏好显著高于水（t₈ = 2.52，p <0.05）。另一方面，B组对花生酱无明显趋向性，更多时间停留在水侧（t₆ = 3.22，p <0.05）。因此，其行为与对照组A存在显著差异（F_1,7 = 26.39，p <0.005）。此外，C组未表现出明显区分，停留在水和花生酱附近的时间大致相等（t₈ = 0.78，p = 0.45）。总体而言，三组小鼠的行为存在显著差异（F_2,9 = 19.83，p <0.005），且基因型与处理条件（花生酱与水）之间存在显著交互作用（F_2,1 = 4.90，p <0.005）（图3A）。

对照组对2-MB酸产生回避反射，因此在水中停留的时间更长（t₈ = 2.67，p <0.05.......

讨论

本方案中提出的实验可用于评估小鼠先天嗅觉行为的不同方面：对气味的感知、区分气味与水的能力以及对气味的敏感性。该方案可适用于任何气味，具体取决于先前所示的偏好与回避等级¹⁵。由于本方案基于探索性活动，因此重要的是小鼠不应存在任何运动功能障碍或焦虑状态，以免影响其活动能力并干扰嗅觉探索。所述实验旨在用于成年雄性小鼠，但也可进行调整，以用于研究成年雌性小鼠或老年小鼠的嗅觉功能。

在开始研究小鼠嗅觉的实验之前，需注意以下几点：1）每次测试之间应至少间隔3天。为尽量减少嗅觉记忆的干扰，应将回避测试安排在最后进行²⁰；2）实验应在每天的同一时间进行，最好在傍晚，此时小鼠处于活跃周期²¹，并使用弱光源照明。此外，在固定时间安排嗅觉测试可控制嗅觉功能可能存在的昼夜节律变化²²；3）在开始使用驱避性气味物质（如酸类）的回避测试前，每次仅将一个笼子的小鼠带入实验区域，并将其置于超净台下。此步骤对于避免小鼠对气味物质产生习惯化、从而获得同组内更均一的反应至关重要；4）在完成测试前，应将已测试的小鼠暂时隔离，直至同一笼.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠笼具	Italplast (意大利)	1144B	长 36 cm × 宽 20.5 cm × 高 13.5 cm
木屑垫料	Abedd (奥地利)	LTE E-001	高度 3 cm
花生酱	Migros (瑞士)	NA	1:10 稀释
2-甲基丁酸	Sigma Aldrich (瑞士)	W269514	纯品
同品系健康雌性小鼠的尿液	NA	NA	系列稀释
相机	Olympus (美国)	Camedia C-8080	MOV 文件格式
适用于 Windows 的 Quicktime for Java	Apple (美国)	NA	用于播放 MOV 视频文件的插件
适用于 Windows 的 ImageJ	NIH (美国)	NA	视频处理/分析